tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng pcr đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các promoter wp cp và qp của ebv sử dụng các nguyên liệu là các tế bào dòng

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể
dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung thư vịm cao
nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất
thấp. Các nướcđơng nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung
bình.Virut Epstein - Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di
truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là
yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất.
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không
biệt húa và tồn tại các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen
quan trọng là EBNA1, LMP1 và 2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào
chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn
truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh
ung thư trong các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm xa nhau trong bộ gen và được
biểu lộ nhờ những promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ trong các thể nhiễm
tiềm ẩn nhờ sự hoạt húa các promoter, bao gồm Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên trong
ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều
hũa biểu lộ gen EBNA1.
Ngoại di truyền được cho là có vai trị rất quan trọng trong điều hũa biểu lộ
gen, chúng bao gồm methyl húa ADN vùng promoter, sửa chữa histon và
nucleosom. Mức độ methyl húa xảy ra ở các vị trí CpG của ADN tại vùng
promoter và exon1 có vai trị trong điều hũa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ
hoặc khơng biểu lộ hồn tồn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ. Việc xác
định mức độ methyl húa vùng khởi động của một gen có ý nghĩa quan trọng trong
tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều
q trình bệnh lý như ung thư, đồng thời dấu ấn này cũng
22


góp phần trong chẩn đốn sớm trong ung thư. Ngồi ra, việc làm mất methyl
húa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp

cho việc điều trị những rối loạn hay bệnh lý khác nhau.
Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định
được mức độ methyl húa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen. Các kỹ thuật
này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức tạp, nhưng có
những ký thuật đơn giản và thơng dụng. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu
methyl húa theo nguyên lý xử lý ADN bằng phương pháp bisulfite để xác định
mức độ methyl húa các promoter Wp, Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1,
đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các promoter đó. Việc phát triển PCR đa
mồi đặc hiệu methyl húa giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN
của nhiều gen, đặc biệt là các gen ức chế ung thư.
Đề tài này nhằm mục đích sau:
1.
Tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa
mồi đặc hiệu methyl húa cho các promoter Wp, Cp và Qp
của EBV, sử dụng các nguyên liệu là các tế bào dòng.
2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl
húa các promoter điều hũa biểu lộ gen EBNA1 trong các
mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng.
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
22

1.1.Tình hình ung thư vịm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu
mô nằm ở vị trí cửa mũi sauvà vịm họng, là loại đứng hàng đầu trong số các ung
thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học khá đặc biệtlà liên quan tới địa lý.Tỷ
lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau:Khu vực

có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30
- 40/100.000 dân/năm. Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ chỉ
từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm. Cịn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày
càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam
Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5
trong các ung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu mặt
cổ [4]

1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH
1.2.1. Vai trò của virut Epstein - Barr .
VirutEpstein - Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được
nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quanchặt chẽ của nú với UTVMH. Người ta
phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu
mô không biệt húa (UCNT) và EBV được phát hiện là từ tế bào UTVMH chứ
không phải từ lympho thâm nhiễm đã được chứng minh từ chuột trụi lông được
truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u này không chứa lympho thâm
nhiễm (Klein và cs 1974) [trích từ 89]. Ngồi ra, các sản phẩm gen của EBV là
EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết
UTVMH hoặc ở tổn thương q sản tại biểu mơ vịm họng gồm những dịng tế
bào tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV làmột
trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển
của UTVMH [124].
22
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nú trong khối u vòm họng,
người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh
nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn
8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổkhác hoặc người khỏe về lâm
sàng (Henle và cs 1970, 1973; Klein và cs 1970) [trích từ 89 c.binh]. Đặc biệt
IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường
qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],

[156] , có giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có
giá trị là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng
cao( ref). Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện
tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng
độ IgA/VCA[89].
1.2.2. Mơi trường sống và thói quen sinh hoạt
Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ơ nhiễm
liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống. Nhiều
nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý
kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là
nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối
ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến
7.5 lần. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa
EBV hoặc trực tiếp thơng qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển
dạng do EBV. Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có
giá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng.
1.2.3. Yếu tố di truyền
Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ
lệ mắcthấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ
22
mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung [2]. Điều đó cho thấy rằng yếu tố
di truyền có vai trị trong bệnh sinh của UTVMH.Ở Việt Nam, việc nghiên cứu
mối liên quan giữa HLA và UTVMH cho thấy có tăng nguy cơ mắc UTVMH với
tăng tần suất các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17,
A11- B17 [13],[20]. Việc xác định các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh
lý cũng đã được nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion
transferase M1 [111],[153]. Cơ chế tác động của chúng cho đến nay vẫn chưa được
rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang được khẳng định là sự phát triển UTVMH

là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố môi trường sống, EBV và HLA


1.3. Virut Epstein - Barr
1.3.1. Sinh học của EBV
Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và nú
tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm. Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước
bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường khơng có triệu chứng.
Ngồi ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của
mẹ truyền sang con, thậm chí là thơng qua quan hệ tình dục. EBV nhân lên trong
tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mơ vịm họng rồi xõp nhập vào tế bào lympho B
qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào. Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở
dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào. Tuy nhiên, EBV
cũng tích hợp vào DNA của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dịng
Namalwa, nú tích hợp vào nhiẽm sắc thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong
lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm
quá thấp (1 tế bào lympho B/ 1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn
dịch. Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngồi rồi lại nhiễm
vào các tế bào
22
lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên trong
cơ thể.
Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng
virut có thể vào bằng những cách sau:Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp
cận giữa tế bào biểu mơ vịm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B đi vào chu trình
dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus
mới cho các tế bào khác trên một diện rộng (Bayliss và Wolf 1980,1981) [trích từ
89]. Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua
trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey và Yao, 1992) [trích từ 89].Ngồi ra, phân tử
MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mơ [10].

Ngồi các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV cịn bị tấn cơng bởi các tế
bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Nature Killercell).


1.3.2. Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nú khoảng 172
- kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid.Suốt chiều dài của gen
có thể chia làm 4 vùng chính: 1 chuỗi ngắn duy nhất (US- short unique ), 1 chuỗi
lặp ( IR- internal repeat), 1 chuỗi dài duy nhất (UL - long unique ) và 1 chuỗi lặp
cuối cùng ( TR - terminal repeat ). EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế
bào bị nhiễm bởi đầu TRcủa nú. (hình 1A). Khi xử lý EBV của dịng tế bào B95 - 8
bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ
cái và theo thứ tự kích thước giảm dần. (hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng
đoạn như sau: Theo mỗi chữ là ký hiệu cho từng đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp
( trái hoặc phải) và số bắt đầu theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ như BARF0,
BARF1. EBV của dòng tế bào B95 - 8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số
tại ngân hàng gen là V01555 [1].
22
trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut [65, 66].
Vùng gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm ở vùng oriP của
prụmụtơ Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20
đoạn nucleitid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng
có hai vị trí gắn xi chiều của Qp.
Hình 2. Cấu trúc của EBNA1

Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và khi
gắn với FR thì nó điều hịa phiên mã các gen EBNA. Các gen này được biểu lộ
dưới sự kiểm sốt của prơmơtơ Cp hay các prơmơtơ Wp. EBNA1 cũng có thể liên
kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của prômôtơ Qp làm tự điều hòa biểu lộ
protein EBNA1 [72]. Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các prômôtơ Cp không hoạt

động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp. Cp không hoạt động do các
yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [73, 74].
1.3.4.2. EBNA2


Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa. Do có trình tự gen
khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và EBNA2B, cũng
là dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I và typ II [78]. Các protein EBNA2A và
EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứngvà giống nhau về trình tự
khoảng 57% [79, 80]. EBNA2 là một trong những protein virut đầu tiên được biểu
lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm, xuất hiện 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV ở nuôi
cấy tế bào in vitro[81]. Protein này là mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu của
virut và tế bào bao gồm cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc [82, 83],
và là cần thiết cho sự bất tử của tế bào B trong in vitro [84, 85] . EBNA2 không
gắn trự tiếp với ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác nhưRBP-JK),
PU1 các protein các tế bào khác.
22
B: Phiên mã bị chặn bởi tăng methyla húa trong vùng prụmụtơ.
Do đó sự methyl húa ADN của các gen trong các tế bào ung thư hiện nay là
một mục tiêu hấp dẫn điều trị và là một kiến thức mới trong lĩnh vực chẩn đoán
phân tử, tức là, phát hiện sớm bệnh bằng sử dụng PCR để xác định methyl húa
ADN. [ luận án]
1.4.2. Methyl húa ADN các promotor của EBNA1
EBNA1
được

biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt húa của các promoter khác nhau ở những


thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu kỳ dung giải (Fp). Ở chu kỳ dung

giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt húa, trong khi các promoter khác không
hoạt động. Ngược lại, trong thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt húa, tuy
nhiên phụ thuộc vào từng thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và
II chỉ có Qp hoạt động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt
động. Hai promoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một
thời gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn
Hình 4. Các vùng promotor của EBV điểu khiển phiên mã.

22
Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2. 1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/ 2011 đến tháng
10/2011.
- Mẫu được thu thập tại Khoa xạ trị tổng hợp, Bệnh viện K
Hà Nội.


- Các kỹ thuật được tiến hành tại Phịng thí nghiệm của bộ môn Miễn dịch –
Sinh lý bệnh; Labo Trung tâm Y - Sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Giải
phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội.

2.2. Đối tượng nghiên cứu.
2.2.1. Nhóm bệnh nhân
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
- Bệnh nhân mới nhập viện, được chẩn đoán xác định là UTVMH dựa
vàotriệu chứng lâm sàng và kết quả giải phẫu bệnh trên mô sinh thiết lấy từ khối u
vòm họng.
Các bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu này được xếp loại giai đoạn từ II

đến IVB với T N M theo cách phân loại T. N. M và giai đoạn lâm sàng của
Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 1997
-Tiêu bản mô sinh thiết.
Những tiêu bản mô sinh thiết tươi và tiêu bản mô sinh thiết đúc farafin của
bệnh nhân đã được chẩn đoán là UTVMH thể không biệt húa.
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ.
- Các thể mơ bệnh học khác ngồi UCNT
- Các bệnh nhân ở giai đoạn 1 hoặc đã có di căn.
- Bệnh nhân đến khám định kỳ
1 -4

0 – 3

0

22

2. 3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp nghiờn cứu:
- Thiết kế nghiên cứu mơ tả cắt ngang
- Trình tự kỹ thuật cần thực hiện:
+ Thiết kế mồi.
+ Chiết tách AND, ARN, Protein.
+ Xử lý AND bằng Bisulfite
+ Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi.
+ Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu.


2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu:
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin

- Quan sát và ghi kết quả xét nghiệm
- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm
theo)

2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được làm sạch trước khi nhập vào máy tính. Xử lý số liệu bằng
phần mềm chương trình SPSS 15. 0 với các test thống kê thích hợp trong y học

2.5. Sơ đồ nghiên cứu

22


DỰ KIẾN KẾT LUẬN

22


KHUYẾN NGHỊ

22


KẾ HOẠCH NGHIấN CỨU
1. Tiến độ về thời gian
Các hoạt
động triển
khai

1, 2, 3

4, 5, 6, 7

8

Nghiên
cứu tài liệu và
viết,
bảo vệđề cươn
g
Thu
thập số liệu
Nhập số liệu
Xử lý số liệu
Viết báo cáo v
à bảovệ
2.Dự trù kinh phí
Cơng việc
1.Chuẩn bị đề cương
- Cơng thu thập tài liệu tham khảo
- Photo tài liệu tham khảo
- Hoàn thiện đề cương
2. Thu thập số liệu
- Triết tách mẫu
- Hóa chất và sinh phẩm:

Thành tiền
500.000đ
200.000đ
100.000đ

200.000đ
28.000.000
4000.0000

22

9

1 11,
0 12


+ Bisufite
+ DNTPs
+ Enzym (Buffer)
+ Mồi
4. In ấn tài liệu
5. Chi phí phát sinh
Tổng số tiền

8000.000/1kit
7.500.000
5000.000/250 mẫu
3.500.000/40 Nucleotid
1.000.000đ
500.000đ
30.000.000đ

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

TỔNG QUAN

1
2

1.1.Tình hình ung thư vịm mũi họng trên thế giới và Việt
Nam.
3
1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH
3
1.2.1. Vai trò của virut Epstein - Barr .
3
1.2.2. Mơi trường sống và thói quen sinh hoạt
4
1.2.3. Yếu tố di truyền
4
1.3. Virut Epstein - Barr
5
1.3.1. Sinh học của EBV
5
1.3.2. Cấu trúc của EBV
6
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV
7
1.3.4. Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn
8
1.4. Yếu tố ngoại di truyền trong UTVMH
11
1. 4. 1. Methyl húa ADN và điều hũa biểu lộ
gen.

11
1.4.2. Methyl húa ADN các promotor của
EBNA1
13
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
15
2. 1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
15
2.2. Đối tượng nghiên cứu.
15
2.2.1. Nhóm bệnh nhân
15
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
15
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ.
15


2. 3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
16
2.3.1. Phương pháp nghiờn cứu:
16
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu:
16
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin
16
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
16
2.5. Sơ đồ nghiên cứu
16

DỰ KIẾN KẾT QUẢ
17
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
18
DỰ KIẾN KẾT LUẬN
19
KHUYẾN NGHỊ
20