bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối bằng màng bc hấp phụ nisin có nguồn gốc từ lactococcus lactis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
o0o
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG
BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN
LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI
SVTH: Đỗ Hương Thảo
MSSV: 60502634
CBHD: Ths. Lâm Xuân Uyên
Ts. Nguyễn Thúy Hưong
Bộ môn: Công Nghệ Sinh Học
TP. Hồ Chí Minh, 02/2010
- 1 -
MÔÛ ÑAÀU
- 2 -
Những năm gần đây trứng vòt muối là một trong những mặt hàng nông sản xuất
khẩu có ưu thế cạnh tranh, đặc biệt lượng hàng xuất khẩu trứng vòt muối tăng lên vào
các dòp trung thu hàng năm. Do đó, việc rút ngắn thời gian sản xuất và kéo dài thời
gian bảo quản trứng vòt muối được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm.
Hiện nay, nisin đã được sử dụng như một hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn
(bacteriocin), có hoạt tính cao và an toàn khi dùng trong thực phẩm được Mỹ và hơn 50
quốc gia công nhận. Tuy nhiên, dòch bacteriocin bao bọc bề mặt thực phẩm không hiệu
quả, thời gian lưu lại trên thực phẩm ngắn. Ngoài ra, do bacteriocin có bản chất là
protein nên dễ bò enzyme protease thủy phân. Từ những đặc điểm trên cần phải có
hướng giải quyết mới để có thể cố đònh được dòch bacteriocin giúp thời gian lưu lại lâu
hơn, tăng được thời gian bảo quản thực phẩm.
Do đó, đề tài: “Bảo quản lòng đỏ trứng vòt muối bằng màng BC hấp phụ
nisin có nguồn gốc từ Lactococcus lactis” hướng đến những mục tiêu và nội dung sau:
1. Mục tiêu chính của đề tài:

- Khảo sát khả năng hấp phụ dòch bacteriocin vào màng mỏng BC
- Ứng dụng màng BC hấp phụ dòch bacteriocin để bảo quản lòng đỏ
trứng vòt muối
2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng BC
- Khảo sát khả năng hấp phụ dòch bacteriocin vào màng BC.
- Ứng dụng màng BC hấp phụ dòch bacteriocin để bảo quản lòng đỏ
trứng vòt muối.
- 3 -
CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU
- 4 -
1.1 Bacteriocin
1.2.1 Giới thiệu về bacteriocin
Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có
khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất.
Bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương với
những đặc điểm:
- Bacteriocin do vi khuẩn Gram âm tổng hợp: gồm nhiều loại protein khác nhau
về kích thước, nguồn gốc vi sinh vật, kiểu tác động và cơ chế miễn dòch.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là Colicin do vi
khuẩn Escherichia coli tổng hợp. Khả năng ức chế của bacteriocin do vi khuẩn
Gram âm tổng hợp yếu hơn bacteriocin do vi khuẩn Gram dương.
- Bacteriocin do vi khuẩn Gram dương tổng hợp: các bacteriocin này cũng nhiều
như ở vi khuẩn Gram âm. Chúng khác với bacteriocin của vi khuẩn Gram âm ở
những điểm sau: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh
vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen
hơn ở vi khuẩn Gram âm.
Bacteriocin khác với kháng sinh ở những điểm sau:
- Được tổng hợp nhờ ribosome
- Tế bào chủ miễn dòch với chúng

- Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh
- Phổ kháng khuẩn hẹp vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi
khuẩn gần với giống sản xuất.
- 5 -
Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, LAB được quan tâm nhiều
do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng.
1.1.2 Phân loại
Bacteriocin do LAB sản xuất được chia thành 4 lớp:
Lớp I: (Lantibiotic) những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chòu nhiệt, hoạt động
trên cấu trúc màng. Lantibiotic chứa những acid amin hiếm (lanthionine, 3 –
methyllanthionine) và một số acid amin khử nước.
Lantibiotic có thể được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấu
trúc và chức năng:
- Lớp Ia: là những peptide tích điện dương, gồm từ 21-38 acid amin. Những
peptide này hoạt động chủ yếu do sự phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế
bào đích. Có thể chia Lantibiotic thành hai phân nhóm dựa trên kích thước ,
điện tích và trình tự leader peptide.
- Lớp Ib: là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 acid amin. Hoạt
động chủ yếu của chúng là phá vỡ chức năng của các enzyme như ức chế việc
sinh tổng hợp vách tế bào của tế bào đích.
Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader ở đầu
N, trình tự này sẽ bò cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích peptide
hoạt hóa.
Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) gồm những phân tử peptide
hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt, gồm 30-60 acid amin.
Bacteriocin lớp II có phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp II có thể chia thành 3 phân lớp:
- 6 -
- Lớp IIa: rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu N và hoạt tính
kháng Listeria.
- Lớp IIb: những bacteriocin lớp này cần có sự kết hợp của hai peptide trong hoạt

động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh. Trong hầu hết các trường hợp,
các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin nhưng hoạt tính sẽ cao hơn
khi có sự diện của peptide thứ hai.
- Lớp IIc: bacteriocin phụ thuộc nhân tố sec Phân tử bacteriocin lớp IIc được
đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc
nhân tố sec
Bacteriocin lớp IIa có tiềm năng ứng dụng trong quy mô công nghiệp nhờ khả
năng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các
bacteriocin lớp I (Nisin) do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng, không tiêu diệt
những chủng khởi động. Pediocin PA-1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ
biến nhất trong số các bacteriocin lớp IIa.
Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa), bền nhiệt. Lớp này gồm những
enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của bacteriocin.
Bacteriocin thuộc lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus.
Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm lipid và
cacbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng
của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào được tinh sạch. Bacteriocin lớp IV
là kết quả của sự tương tác đặc tính kỵ nước và tích điện dương của bacterocin với các
phân tử khác trong dòch thô. Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc lipoprotein. Ví dụ
như leuconocin S và lactocin 27.
- 7 -
Trong 4 lớp trên thì bacteriocin của lớp I và lớp II rất phong phú và có tiềm
năng thương mại.
Trong các chủng LAB thì Lactococcus lactis được quan tâm nghiên cứu rất
nhiều, một số chủng Lc.lactis có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin do
Lc.lactis gồm hai loại: lantibiotic và các bacteriocin kích thước nhỏ, bền nhiệt không
phải lantibiotic.
Lactococcus có khả năng sinh tổng hợp nisin – bacteriocin duy nhất được Tổ
chức nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép
sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm. Nisin sẽ phá vỡ chức năng vận chuyển của

màng tế bào và tế bào chất thoát ra ngoài, nó có khả năng chống cả vi khuẩn Gram âm
lẫn vi khuẩn Gram dương, ức chế sự hình thành bào tử. Nisin có phổ kháng khuẩn rộng
đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào
dinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. cũng như ức chế nảy chồi của bào tử
các loài Bacillus và Clostridoum [23].
Ngoài lantibiotic, Lc. lactis còn có khả năng sinh tổng hợp những phân tử
bacteriocin kích thước nhỏ và bền nhiệt, điển hình là lactococin A,B và M. Lactococin
có phổ kháng khuẩn hẹp hơn nisin, chúng chỉ có thể ức chế những chủng Lactococcus
khác với chủng sản xuất.
1.1.3 Nisin – Bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis
Đònh nghóa
Nisin là bacteriocin có chứa lantibiotic do Lc. lactis sản xuất và là bacteriocin
duy nhất được tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp
nhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm.
- 8 -
Chủng sản xuất nisin đầu tiên được tìm thấy trong sữa bởi Roger (1928),
Whitehead (1933), Meanwel (1943) và Hirish (1944). Từ đó người ta ước lượng được
khoảng 1/3 các chủng Lc. lactis subsp. lactis có khả năng sản xuất nisin.
Nisin có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết các chủng LAB, Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium
spp. cũng như ức chế sự nảy chồi của bào tử các loài Bacillus và Clostridium.
Đặc điểm
• Tính chất vật lý của nisin
Phân tử lượng của một phân tử nisin là 3,4 KDa. Phân tử nisin có tính phân cực
với đầu N kỵ nước và đầu C ưa nước. Tính tan của nisin phụ thuộc vào pH của môi
trường. Khi pH của môi trường tăng tính tan của nisin giảm mạnh. Ở điều kiện trung
tính và kiềm, nisin hầu như không tan. Độ bền của nisin có quan hệ chặt chẽ với tính
tan. Độ bền của nisin không chỉ phụ thuộc vào pH mà bò ảnh hưởng bởi các yếu tố
khác: thành phần môi trường, nhiệt độ, … Nisin bò bất hoạt bởi α - chymotripsin,
pancreatin và subtilopeptidase nhưng không bất hoạt bởi carboxypeptidase A, pepsin

và tripsin.
• Tính chất hóa học của nisin
Khác với bacteriocin sản xuất từ LAB hay từ các loài vi khuẩn khác, nisin có
phổ kháng khuẩn tương đối rộng. Nisin ức chế chủ yếu vi khuẩn Gram (+). Nisin ức
chế tế bào sinh dưỡng và cả bào tử vi khuẩn.
Hoạt tính sinh học của nisin phụ thuộc vào pH của môi trường. Hoạt tính sinh
học của nisin giảm khi pH môi trường tăng.
- 9 -
Đơn vò đo hoạt độ của nisin là IU (International unit), được đònh nghóa là hoạt
tính có trong 1µg Nisaplin – nisin thương mại. 1g nisin tinh sạch chứa 40 x 10
6
IU, hay
nói cách khác, hoạt tính sinh học của 40 IU tương đương với 1µg nisin tinh sạch.
1.1.4 Một vài đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bacteriocin do LAB sinh tổng hợp
Để thực hiện hoạt tính gây chết, các bacteriocin thuộc lớp I và II phải thỏa mãn
hai yêu cầu: tích điện dương và kỵ nước.
Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3-9.
Thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11. Ở điểm đẳng điện cao cho phép chúng
tương tác với bề mặt tích điện âm của tế bào vi khuẩn. Đối với các bacteriocin có phổ
kháng khuẩn rộng, các hợp chất cần thể nhận sẽ gắn phần kỵ nước vào màng vi khuẩn.
Sự liên kết các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng làm
mất gradient và gây chết tế bào.
Tính chòu nhiệt cũng là những đặc điểm chính của bacteriocin trọng lượng thấp.
Các liên kết monosulfit và disulfit trong phân tử càng nhiều thì phân tử peptide càng
ổn đònh. Hầu hết dòch nổi tế bào của chủng sinh bacteriocin vẫn còn hoạt tính khi xử lý
nhiệt hoặc hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực. Tuy nhiên, một vài loại bacteriocin tạo
bởi một số chủng Lactobacillus như helveticin bò bất hoạt khi xử lý nhiệt 60-100
o
C
trong 10 - 15 phút.

1.1.5 Quá trình sinh tổng hợp tạo bacteriocin
1.1.5.1 Cụm gen sinh tổng hợp bacteriocin
Sự sinh tổng hợp bacteriocin nhờ vào một cấu trúc gen bao gồm bốn gen khác
nhau mã hóa chức năng cơ bản cho việc sản xuất chất kháng khuẩn ngoại bào. Bốn gen
đó bao gồm:
(1) Gen cấu trúc mã hóa các prebacteriocin
- 10 -
(2) Gen miễn dòch luôn luôn nằm kế gen bacteriocin và trên cùng đơn vò
transcription.
(3) Gen mã hóa ABC-transporter có chức năng vận chuyển bacteriocin ra ngoài.
(4) Gen mã hóa một protein phụ cần thiết cho sự vận chuyển bacteriocin ra
ngoài, có vai trò nhất đònh nhưng đến nay chưa được làm rõ.
Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome. Các gen mã hóa cho việc sản xuất và
miễn dòch bacteriocin thường sắp xếp thành những cụm gen operon. Hệ thống
lactococcin A có hai operon được tìm thấy, trong khi đó đối với hệ thống pediocin PA-1
điều khiển một operon bao gồm cả bốn gen tham gia đến việc sản xuất phân tử
bacteriocin chủ động. Đối với những bacteriocin mạch thẳng không trải qua quá trình
biến đổi (gồm plantaricin, carnobacteriocin và sakacin), chúng có những pepetide cảm
ứng kích thích tổng hợp bacteriocin. Gen mã hóa các peptide này thường đònh vò trên
cùng một cụm. Các cụm gen bacteriocin có thể đònh vò trên nhiễm sắc thể (subtilin và
mersacidin), trên plasmid (divergicinA và sakicin A) hoặc các gen nhảy, transposon
(nisin và lacticin 481).
Các operon sinh tổng hợp lantibiotic thường chứa các gen mã hóa cho:
prepeptide (Lan A), các enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi (Lan B,C/Lan M),
các protease giúp loại bỏ các trình tự leader peptide (LanP), hệ thống ABC (ATP-
binding cassette), protein vận chuyển peptide (Lan T), protein điều hòa (Lan R,K),
protein liên quan đến các trình tự bảo vệ của tế bào chủ sản xuất bacteriocin (miễn
dòch) (Lan I, FEG).
Sự điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin lớp II (lactococcin A, B, M pediocin PA-1
và plantaricin A) cũng đã được nghiên cứu. Các gen mã hóa cho việc sinh tổng hợp

bacteriocin lớp II có nhiều điểm tương đồng về mặt cấu trúc di truyền, chúng gồm các
- 11 -
gen cấu trúc mã hóa cho các phân tử tiền peptide, gen miễn dòch, gen mã hóa
proteinvận chuyển ABC và gen mã hóa cho protein phụ trợ. Trong một số trường hợp
có thể có một số gen điều hòa. Các protein phụ trợ cần thiết cho quá trình tiết
bacteriocin lớp II ra môi trường
1.1.5.2 Quá trình sinh tổng hợp bacteiocin
Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp dưới dạng tiền peptide bất hoạt có mang
một trình tự leader peptide ở đầu bám và trình tự ở đầu C của propeptide.
Trong trường hợp lantibiotic, các phân tử serine, threonine và cysteine trong
phần propeptide trải qua những biến đổi sau dòch mã để hình thành Lan/MeLan.
Con đường sinh tổng hợp lantibiotic gồm những bước sau:
- Bước 1: Sinh tổng hợp phân tử tiền bacteriocin.
- Bước 2: Phân tử tiền bacteriocin bò biến đổi bởi Lan B, Lan C sau đó được vận
chuyển qua màng bởi hệ thống vận chuyển ABC Lan T, đồng thời được biến
đổi bởi LanC để phóng thích phân tử bacteriocin trưởng thành. Tuy nhiên quá
trình cắt trình tự leader peptide có thể xảy ra trước, trong hoặc sau bước xuất
bào.
- Bước 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện của bacteriocin
và tự phosphoryl hóa.
- Bước 4: Nhóm phosphoryl hóa (P) được chuyển qua nhân tố đáp ứng điều hòa
(response regulator – RR)
- Bước 5: Nhân tố RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa.
- 12 -
- Bước 6: Sự hiện diện của bacteriocin cảm ứng hoạt động tự miễn của tế bào sản
xuất. Sự tự miễn được điều khiển bởi các protein miễn dòch, Lan I, protein vận
chuyển ABC và Lan FEG.
Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp lantibiotic [20].
Bacteriocin lớp II được tổng hợp ở dạng phân tử tiền peptide chứa một trình tự
leader bảo tồn ở đầu N và một vò trí glycerin kép phục vụ cho việc phân giải protein

(ngoại trừ bacteriocin lớp IIc, được tổng hợp với một trình tự tín hiệu ở đầu N, được
biến đổi và tiết ra khỏi tế bào). Khác với lantibiotic, bacteriocin lớp IIa không trải qua
quá trình biến đổi sau dòch mã. Sau khi hình thành, phân tử tiền peptide sẽ được biến
đổi để loại bỏ leader peptide cùng lúc với việc xuất khỏi tế bào qua hệ thống vận
chuyển ABC và các protein phụ trợ của nó.
Trình tự leader peptide có thể thực hiện một số chức năng chuyên biệt:
- Là vò trí nhận biết cho các protein biến đổi và vận chuyển tiền peptide.
- Bảo vệ tế bào sản xuất tránh khỏi tác động của bacteriocin khi còn ở bên trong
tế bào bằng cách giữ chúng ở trạng thái bất hoạt.
- 13 -
- Tương tác với vùng propeptide để đảm bảo cấu trạng thích hợp cần thiết cho sự
tương tác giữa enzyme và cơ chất.
Con đường sinh tổng hợp bacteriocin lớp II:
- Bước 1: Sinh tổng hợp phân tử tiền bacteriocin và các tiền peptide của các nhân
tố cảm ứng (IF)
- Bước 2: Phân tử tiền bacteriocin và các tiền nhân tố IF được biến đổi và vận
chuyển nhờ hệ thống vận chuyển ABC, phóng thích bacteriocin trưởng thành và
nhân tố IF.
- Bước 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện của IF và tự
phosphoryl hóa.
- Bước 4: Nhóm phosphoryl hóa (P) được chuyển qua nhân tố đáp ứng điều hòa
(response regulator – RR)
- Bước 5: Nhân tố RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa.
- Bước 6: Sự hiện diện của bacteriocin cảm ứng hoạt động của các protein có
chức năng tự miễn của tế bào sản xuất [23].
1.1.5.3 Điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin
Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin được điều hòa nhờ hệ thống điều hòa hai
thành phần. Hệ thống điều hòa này chứa hai protein phát tín hiệu: histidine protein
kinase (HPK) liên kết màng và nhân tố điều hòa đáp ứng trong tế bào chất (reponse
regulator – RR). Trong quá trình truyền tải tín hiệu, HPK tự phosphoryl phân tử

histidine khi nó cảm ứng được sự hiện diện của bacteriocin ở nồng độ tới hạn trong môi
trường. Sau đó nhóm phosphoryl được huyển đến phân tử aspartic acid ở vùng RR tạo
ra sự thay đổi nội phân tử, tác động đến nhân tố điều hòa đáp ứng làm hoạt hóa quá
- 14 -
trình phiên mã của các gen được điều hòa. Các gen điều hòa gồm: gen cấu trúc, gen
xuất bào, gen miễn dòch.
Trong trường hợp nisin và subtilin, phân tử bactreiocin đóng vai trò như một tín
hiệu ngoại bào để tự điều hòa quá trình sinh tổng hợp của chúng theo con đường truyền
tải tín hiệu. Ngược lại hầu hết bacteriocin lớp II sản xuất một peptide giống bacteriocin
nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn và sử dụng nó như một nhân tố cảm ứng (IF) để
hoạt hóa quá trình phiên mã của các gen được điều hòa. IF là một peptide nhỏ, bền
nhiệt, tích điện dương và kò nước, được tổng hợp dưới dạng một tiền peptide với một
trình tự leader glycine kép. Hệ thống vận chuyển sẽ cắt bỏ peptide leader của IF cùng
lúc với quá trình xuất bào của peptide trưởng thành. IF được tiết ra đóng vai trò như
một tín hiệu ngoại bào và tác động đến quá trình phiên mã của các gen liên quan đến
việc sản xuất bacteriocin [23].
1.1.6 Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Do có sự khác nhau về cấu trúc hóa học mà bacteriocin sẽ có cách thức tác động
khác nhau với các tế bào sống. Các bacteriocin có thể tác động lên sự sao chép, phiên
mã, dòch mã, tổng hợp thành tế bào. Tuy nhiên, hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng
cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá hủy năng lượng hữu ích của tế bào sống.
Cơ chế tác động của nisin được nghiên cứu kỹ nhất. Nisin thuộc nhóm Ia, tích
điện dương, tích điện tónh điện với màng phospholipid tích điện âm. Kết quả tạo phần
tương tác kò nước giữa bacteriocin với màng tế bào chất của tế bào đích. Lysine là
amino acid tích điện âm có liên quan tới sự tương tác tónh điện này. Sự tương tác giữa
phần kò nước của nisin và màng tế bào đích tạo những kênh ion không đặc hiệu. Việc
tạo các lỗ làm giảm sự hiện diện của các ion dương hóa trò II như Mg
2+
, Ca
2+

. Bởi vì
chúng trung hòa điện tích âm của phospholipid, làm giảm sự linh động của màng. Các
- 15 -
lỗ trên màng tạo bởi nisin làm cho các ion K
+
, Mg
2+
, acid amin, acid glutamic và lysine
và ATP thoát ra ngoài nhưng các protein lớn trong tế bào chất không qua được, vì vậy
tạo thế màng, làm mất động lực proton nên sẽ gây chết tế bào.
Lipid II cũng tham gia trong việc tạo thành các lỗ, lipid II đóng vai trò như
những phân tử cắt cụt cho các liên kết đặc hiệu với màng tế bào vi khuẩn.
Ở bacteriocin như mersacidin và actagardin thì cơ chế hoạt động của chúng là
tác động lên sự tổng hợp của thành tế bào, các bacteriocin này ngăn cản việc gắn các
phân tử glucose và D-alanine và thành tế bào, sự tổng hợp DNA, RNA và protein xảy
ra một cách tự do. Cả hai bacteriocin này đều ức chế sự sinh tổng hợp petidoglycan
bằng cách tạo phức hợp với tiền chất lipid II của peptidoglycan gắn trên màng.
Nhìn chung, cơ chế hoạt động của bacteriocin lớp IIa cũng giống như nisin. Đặc
tính bacteriocin nhóm này là kháng Listeria do sự hiện diện của trình tự YGNGV ở
vùng đầu N. Giả thiết hiện nay để lý giải cơ chế hoạt động của nhóm này là liên kết
tónh điện của bacteriocin với màng tế bào đích qua trung gian phân tử receptor liên kết
trên màng. Giả thiết về receptor đáp ứng cho sự nhận diện kiểu kháng Listeria
YGNGV ở những peptide này. Người ta cho rằng bacteriocin nhóm IIa có thể tự tạo lỗ
xuyên qua màng tế bào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏ và lưỡng cực. Các
bacteriocin lớp phụ IIc theo khóa phân loại Klaenhammer được chia thành hai nhóm
khác nhau dựa vào việc có hay không có sự hiện diện liên kết disulfit bên trong phân
tử. Do đó, hoạt động của hai nhóm này hoàn toàn khác nhau.
Các nghiên cứu trên màng được tiến hành với lactococcin – bacteriocin thiếu
phần L-cysteine và thấy rằng đây là protein hoạt động trên màng. Cơ chế hoạt động
chính là sự tạo thành các lỗ trên màng tế bào. Phổ kháng khuẩn rộng của những hợp

chất này chứng tỏ có sự hiện diện của receptor bacteriocin liên kết đặc hiệu trên màng.
- 16 -
Các acid amin tích điện âm và tryptophan trong vùng ưa nước có thể thuận lợi cho các
tương tác không đặc hiệu với lớp phospholipid tích điện âm của màng tế bào đích làm
cho các lỗ xuyên màng ổn đònh hơn [12], [22].
1.1.7 Khả năng tự miễn bacteiocin của tế bào chủ
Hiện nay, có hai hệ thống tự miễn lantibiotic của tế bào sản xuất đã được nhận
đònh. Sự bảo vệ này được kiểm soát bởi các protein miễn dòch Lan I, protein vận
chuyển ABC và Lan FEG. Hai hệ thống này hoạt động hỗ trợ lẫn nhau bảo vệ tế bào
sản xuất khỏi tác động của bacteriocin do chính chúng sinh ra.
Lan I bám trên mặt ngoài của màng tế bào chất và bảo vệ tế bào bằng cách
ngăn chặn sự tạo lỗ của bacteriocin. Lan FEG hoạt động bằng việc vận chuyển các
phân tử bacteriocin đã chèn vào màng để đem chúng trở về môi trường ngoại bào, nhờ
vậy Lan FEG giúp đỡ nồng độ bacteriocin bên trong tế bào luôn ở mức thấp hơn mức
tới hạn.
Gen tự miễn của bacteriocin lớp II thường mã hóa cho một loại protein liên kết
với màng tế bào chất. Quadri và cs (1995) đã xác đònh đa phần protein miễn dòch
CbiB2 của carnobacteriocin B2 được tìm thấy bên trong tế bào chất và một lượng ít hơn
kết hợp với màng. Tương tự theo Abdel-Dayem và cs (1996) phần lớn protein miễn
dòch MesI của mesentericin Y105 tồn tại trong tế bào chất và chỉ một lượng nhỏ được
phát hiện trên màng tế bào.
Protein miễn dòch là những phân tử tích điện dương, có khoảng 51-254 acid
amin, cung cấp khả năng miễn dòch đối với bacteriocin. Sự tương tác của protein miễn
dòch với màng tế bào giúp bảo vệ tế bào sản xuất tránh khỏi tác động của bacteriocin
do chúng sản sinh ra [23].
1.1.8 Ứng dụng bacteriocin
- 17 -
Ngành công nghiệp thực phẩm có thể ứng dụng khả năng bảo quản sản phẩm
của bacteriocin bằng việc sử dụng các giống vi sinh vật sản sinh bacteriocin trong quá
trình sản xuất hoặc bổ sung các chế phẩm có chứa bacteriocin trực tiếp vào sản phẩm .

Nisin là một loại bacteriocin được ứng dụng phổ biến nhất và là lantibiotic duy
nhất đang được thương mại hóa. Nisin trên thò trường hiện nay có một loại dạng bột là
Nisaplin và một loại có thành phần là 2,5% nisin kết hợp với 77,5% NaCl và bột sữa
không béo (12% protein và 6% carbonhydrate) được gọi là Novasin. Ngoài ra, còn có
một loại bacteriocin được thương mại hóa nữa là ALTA 2431 (sản phẩm từ pediocin
PA – 1).
Ứng dụng của bacteriocin trong các sản phẩm làm từ sữa
Một ứng dụng chính của nisin là sản xuất phomai. Việc sử dụng nisin lấy từ
Lactoccoci là sự lựa chọn tuyệt vời cho việc ứng dụng nisin như một thành phần phụ
gia trong sản xuất phomai.
Davies và cs (1997) đã thử nghiệm sử dụng nisin để kiềm hãm sự sinh trưởng
của vi khuẩn L. monocytogenes gây bệnh trong phomai. Kết quả cho thấy, với mẫu sử
dụng nisin với nồng độ 2,5 mg/l sẽ kìm hãm sự phát triển của L. monocytogenes đến 8
tuần so với mẫu đối chứng chỉ với 2 tuần đã không còn an toàn. Khi đo hàm lượng nisin
ban đầu và còn lại trong sản phẩm cho thấy nisin chỉ mất đi 10 – 32% sau 10 tuần bảo
quản ở 6 – 8
0
C [20].
Ứng dụng của bacteriocin trong các sản phẩm thòt
Pawar và cs (2000) đã thử nghiệm trên thòt trâu cắt nhỏ để kiểm tra hoạt động
của nisin đơn lẻ (ở hoạt độ 400 và 800 IU/g) và kết hợp nisin với 2% sodium chloride
để chống lại sự phát triển của L. monocytogenes. Mẫu thòt đối chứng được tiêm vào 10
3
CFU/g L. monocytogenes và được bảo quản ở 4
0
C. Số lượng tế bào L. monocytogenes
trong mẫu đối chứng tăng từ 3 log
10
đến 6,4 log CFU/g sau 16 ngày bảo quản. Tuy
- 18 -

nhiên, nisin lại tác động một cách rất hiệu quả đến sự phát triển của L. monocytogenes.
Người ta thêm vào nisin có hoạt tính 400 IU/g để làm tăng pha lag của L.
monocytogenes, và nisin ở hoạt tính 800IU/g đã cho thấy kết quả số lượng tế bào L.
monocytogenes giảm xuống chỉ còn 2,4-log CFU/g, thấp hơn mẫu đối chứng sau 16
ngày bảo quản. Sự kết hợp của nisin với 2% sodium chloride cũng làm tăng hiệu quả
bảo quản [31].
Lauková và cs (1999) đã kiểm nghiệm sự hiệu quả của enterocin CCM 4231
trong việc kiểm soát L. monocytogenes nhiễm vào quá trình sản xuất xúc xích lên men.
Việc thêm vào enterocin làm giảm một cách nhanh chóng số lượng tế bào L.
monocytogenes từ 10
8
CFU/ml xuống còn 1.7-log
10
. Sau một tuần của quá trình lên
men, lượng L. monocytogenes trong mẫu đối chứng (không bổ sung enterocin) tăng lên
10
7
CFU/g, trong khi mẫu thí nghiệm (có bổ sung enterocin) chỉ còn 10
4
CFU/g, sự khác
biệt này vẫn được suy trì sau 2-3 tuần [26].
Ứng dụng bacteriocin trong các sản phẩm thủy sản
Để kéo dài thời gian bảo quản tôm biển, người ta thường sử dụng sorbic và acid
benzoic. Tuy nhiên, điều này lại đặt ra nhiều mối lo lắng cho người tiêu dùng vì sự lạm
dụng các chất này. Do đó, Einarsson và Lauzon (1995) đã nghiên cứu ứng dụng
bacteriocin vào bảo quản tôm biển để giải quyết vấn đề này. Họ đã đánh giá tính hiệu
quả của việc sử dụng nisin Z, carnocin UI49, và bavaricin A thô vào việc kéo dài thời
gian bảo quản của tôm biển. Kết quả là Carnocin UI49 không có khả năng kéo dài thời
gian so với mẫu đối chứng sua 10 ngày bảo quản. Trong khi đó bavaricin A lại có khả
năng tăng thời gian bảo quản lên 16 ngày và nisin Z tăng thời gian bảo quản lên đến 31

ngày. Tuy nhiên đây cũng chỉ là những nghiên cứu bước đầu vì thời gian bảo quản tôm
biển bằng muối benzoate và sorbate là 59 ngày. Do đó, cần phải có những nghiên cứu
sâu hơn để tìm ra biện pháp hiệu quả hơn [21].
- 19 -
Nykanen và cs (2000) đã thử nghiệm nisin và sodium lactate và kết hợp cả hai
trên thòt cá hồi xông khói. Những mẫu cá hồi được bảo quản ở 8
0
C trong 17 ngày và
3
0
C trong 29 ngày. Cả nisin và sodium lactate đều có ảnh hưởng đến sự phát triển của
L. monocytogenes trong cá xông khói, nhưng khi kết hợp cả hai thì mang lại hiệu quả
tốt hơn. Sự kết hợp của nisin và sodium lactate làm giảm số lượng vi khuẩn L.
monocytogenes từ 3.3 xuống 1.8 log
10
CFU/g trong vòng 16 ngày bảo quản ở 8
0
C. Hàm
lượng L. monocytogenes duy trì ở mức không đổi (4.7 đến 4.9 log
10
CFU/g) trong vòng
29 ngày khi bảo quản ở 3
0
C [30].
1.2 Cellulose vi khuẩn
1.2.1 Vi sinh vật sản sinh BC
1.2.1.1 Các vi khuẩn tạo màng BC
BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn khác nhau. Con đường sinh tổng hợp
và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài tương đối giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở
mỗi loài thì khác nhau. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản

phẩm cellulose chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ
polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loài mà
trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau, từ đó xác đònh các tính chất vật lý của sản
phẩm như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chòu ảnh hưởng của các tác nhân
biến tính [15,16].
Bảng 1.1. Cấu trúc màng BC của một số vi khuẩn.
Loài Cấu trúc cellulose
Acetobacter
Achromobacter
Aerobacter
Agrobacterium
Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải
Sợi
Sợi
Sợi ngắn
- 20 -
Alcaligenes
Pseudomonas
Rhizobium
Sarcina
Zoogloea
Sợi
Không có cấu trúc sợi rõ ràng
Sợi ngắn
Cellulose vô đònh hình
Chưa xác đònh
[13].
Acetobacter xylinum (A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose
hữu hiệu nhất. Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter bao gồm các
loài là G. xylinum, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius.

1.2.1.2. Vi khuẩn Acetobacter xylinum
Chủng Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Theo khóa phân loại
Bergey thì Acetobacter xylinum thuộc lớp Schizomycetes, bộ Pseudomonadales, họ
Pseudomonadaceae.
a. Đặc điểm hình thái
A. xylinum là vi khuẩn hình que dài khoảng 2µm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành
chuỗi, không di động. Là vi khuẩn Gram âm, vỏ nhầy được cấu tạo bởi cellulose. A.
xylinum thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng trên bề mặt
tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường không khí.
b. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Điều kiện tối ưu để A. xylinum sinh trưởng ở pH = 4-4,5, nhiệt độ từ 25-32
0
C.
Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của A. xylinum . Nhưng khi
lượng acid tích lũy quá cao thì sẽ ức chế chúng.
A. xylinum hấp thụ đường glucose rất tốt từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi
khuẩn, glucose sẽ kết hợp với acid béo tạo thành tiền chất nằm trên màng tế bào. Sau
đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một loại enzyme. Enzyme này có thể
- 21 -
polymer hóa thành cellulose. A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau
và tùy thuộc vào nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất [16].
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hóa của A. xylinum .
STT
Đặc điểm sinh hóa của A.xylinum
Hiện tượng Kết quả
1 Oxy hóa ethanol thành acid acetic
Acid acetic tạo ra kết hợp với
CaCO
3
làm vòng sáng rộng hơn

và tạo lớp cặn, đục rõ
+
2 Catalase Sủi bọt khí +
4 Chuyển hóa glucose thành acid Vòng sáng sung quanh khuẩn lạc +
5
Chuyển hóa glycerol thành
dihydroxyaceton
Vòng CuO xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc
+
6 Kiểm tra sinh sắc tố nâu Không thấy sắc tố nâu -
7 Kiểm tra tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện màu
lam
+
[24].
1.2.2 Cellulose vi khuẩn
1.2.2.1. Giới thiệu
Celluose là một polymer sinh học rất đa dạng trên thế giới, là thành phần lớn
nhất trong sinh khối thực vật. Bên cạnh polymer thực vật còn có polymer ngoại bào
của vi sinh vật, chúng là sản phẩm của hoạt động biến dưỡng sơ cấp được dùng như
một lớp áo bên ngoài để bảo vệ tế bào chủ, trong khi cellulose thực vật đóng vai trò
cấu trúc. Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật có cấu trúc hóa học giống nhau
nhưng tính chất vật lý và hóa học khác nhau.
1.2.2.2. Cấu trúc màng BC:
Cellulose là một polymer không phân nhánh của các liên kết β-1,4
glucopyranose. Các nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với cấu trúc của
- 22 -
cellulose thực vật. Tuy nhiên, cấu trúc đa phân tử và thuộc tính của cellulose vi khuẩn
khác với cellulose thực vật. Các chuỗi mới sinh của BC tập hợp lại hình thành nên các

siêu sợi có độ rộng khoảng 1.5nm. Các siêu sợi này lại hình thành nên các vi sợi (Jonas
and Farab, 1998), sau đó chúng được bó lại và hình thành nên các ribbon (Yamanaka
và cộng sự, 2000). Kích thước của các ribbon là 3-4 x 70-80 nm. Các BC khác nhau
thường có độ polymer hóa khác nhau thường nằm trong khoảng 2000 đến 6000, trong
một số trường hợp lên đến 16000 – 20000. Trong khi đó mức polymer hóa trung bình
của thực vật thường nằm trong khoảng 13000 – 14000 [15, 16].
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi
cấy tónh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt nuôi cấy tónh, tại ranh
giới giữa bề mặt dòch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC
trên môi trường tónh (S-BC). Các siêu sợi cellulose liên tục được tạo ra từ những lỗ
được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi, và bò đẩy xuống
sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tónh tạo nên các
mặt phẳng song song, sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo
nhau không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào Acetobacter xylinum.
Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tónh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các
sợi BC được tạo ra từ môi trường lắc (A-BC) [16].
- 23 -
Hình 1.2. Màng BC hình thành trong môi trường nuôi cấy tónh [14].
Hình 1.3. Các viên BC hình thành trong môi trường khuấy [14].
Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt
bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại. Cellulose I được
chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I.
- 24 -
Cellulose I được tổng hợp bởi đa số thực vật A. xylinum ở trong môi trường tónh.
Các chuỗi β - 1,4 – glucan ở cellulose I được sắp xếp song song với nhau theo một trục.
Trong khi đó, các chuỗi β - 1,4 – glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu nhiên,
hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn cầu nối hydrogen, làm
cho cellulose II có độ bền về nhiệt. Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp cellulose II. A.
xylinum tổng hợp được cả hai loại cellulose I và II.
Trong phân tử cellulose I có sự xuất hiện của I

α
và I
β
, do được cấu tạo bởi
glucose dạng α hay dạng β. Dạng β bền về nhiệt động hơn. Gluose dạng α hay glucose
dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai dạng đồng phân này chỉ khác
nhau ở sự đònh hướng của nhóm hydroxyl. Gai dạng này có ở các cellulose có nguồn
gốc từ tảo, vi khuẩn, thực vật. BC có dạng I
α
nhiều hơn cellulose thực vật. S-BC có
nhiều dạng I
α
hơn A-BC. Sự khác nhau về tỉ lệ I
α
giữa hai loại S-BC và A-BC làm
phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số I
α
tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh. A-BC có chỉ số
kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S-BC.
1.2.2.3. Tính chất hóa lý của màng S-BC:
Màng S-BC có thể tạo hình dạng phù hợp với thiết bò phản ứng sinh học. Hình
dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra kích thước
mong muốn. S-BC có tính chất cơ lý bền và ổn đònh. Độ chòu lực của BC khá dai, gần
bằng với độ chòu lực của nhôm. Tính chất cơ lý bền và ổn đònh giúp BC có thể chòu
được sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực. BC không tan trong
môi trường phản ứng. Giá thể BC có độ trương nở tốt. Độ trương nở giúp cho sự khuếch
tán của cơ chất, sản phẩm. Môi trường trong và ngoài chất mang không có sự khác biệt.
BC đã qua xử lý không gây tác động đến chất được hấp phụ. Sau giai đoạn xử lý, BC
- 25 -