Bước đầu khảo sát quá trình lên men và áp dụng kỹ thuật clea để thu nhận enzyme cellulase

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN
VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT CLEA ĐỂ THU NHẬN
ENZYME CELLULASE


CBHD:

TS. HUỲNH NGỌC OANH

SVTH:

NGUY
Ễ
N BÁ HUY


MSSV:

60600883

i





LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ
Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em trong suốt những năm học vừa qua, đặc biệt trong thời gian làm luận văn
tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học và cán
bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em
những kiến thức quí báu trong suốt thời gian em học tập và thực hiện khóa luận.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô Huỳnh Ngọc Oanh đã
tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn giáo viên phản biện đã giành thời gian quí báu của
mình để đọc nội dung luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn ba mẹ và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong
suốt thời gian qua.
Em xin gởi đến tất cả quý Thầy, Cô, gia đình và các bạn sự biết ơn chân thành
và sâu sắc nhất.

ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG viii
CHƯƠNG 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích đề tài 1
1.3. Nội dung thực hiện 1
CHƯƠNG 2
2.1. Enzyme cellulase 3
2.1.1. Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc 3
2.1.2. Cơ chất cellulose 4
2.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 5
2.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 7
2.2.1. Đặc điểm chung 7
2.2.2. Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis 8
2.3. Sản xuất enzyme nhờ VSV 9
2.3.1. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật 10
2.3.2. Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan 12
2.3.3. Thiết bị lên men (Fermenter New Brunswick Co. Bioflo 110) 13
2.4. Enzyme cố định 16
2.4.1. Định nghĩa 16
2.4.2. Ưu điểm của enzyme cố định 16
2.4.3. Các phương pháp cố định enzyme 17
2.5. Phương pháp tạo liên kết chéo 17
2.5.1. Giới thiệu glutaraldehyde 18

iii

2.5.2. Phương pháp cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 18
2.6. Một số ví dụ về cố định celluase 20
CHƯƠNG 3 1
3.1. Vật liệu và hóa chất 21
3.2. Một số phương pháp chung 22
3.2.1. Phưong pháp xác định hàm lượng protein 22
3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22
3.2.3. Phương pháp tính toán 23
3.3. Cách tiến hành thí nghiệm 24
3.3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 25
3.3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp 26
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp 30
3.4. Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 31
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất 31
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 32
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cố định đến hiệu suất cố định 33
CHƯƠNG 4
4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 35
4.1.1. Quan sát vi sinh vật 35
4.1.2 Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase của Bacillus subtilis 36
4.1.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis 37
4.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp 38
4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 38
4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng CMC đến khả năng 39
4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 40
4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase . 41
4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 42

iv

4.4. Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 43
4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định 43
4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến sự cố định Cellusoft 45
4.4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 46
4.5. Khảo sát khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố định dạng CLEA 48
CHƯƠNG 5
5.1. Kết luận 50
5.2. Kiến nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52
PHỤ LỤC 52
v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CLEA : Cross-linked enzyme aggregate
CMC : Carboxymetyl-cellulose
glu : Glutaraldehyde
E : Enzyme
HL : Hàm lượng
HS : Hiệu suất
HĐ : Hoạt độ
cđ : Cố định
dd : Dung dịch
bđ : Ban đầu
cl : Còn lại
UI : Đơn vị hoạt độ (của enzyme)
∑ : Tổng số

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose 3
Hình 2.2. Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose 4
Hình 2.3. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose 4
Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi 5
Hình 2.5. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson 5
Hình 2.7. Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase 8
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme 9
Hình 2.9. Cơ chế điều hòa trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm 10
Hình 2.10. Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 11
Hình 2.11. Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co. 13
Hình 2.12. Hệ thống Fermenter Bioflo 110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ) 15
Hình 2.13. Thiết kế headplate 15
Hình 2.14. Sơ đồ phân loại các phương pháp cố định enzyme 17
Hình 2.15. Cấu tạo hóa học của glutaraldehyde 18
Hình 2.16. Mô hình 3D của phân tử glutaraldehyde 18
Hình 2.17. Phương pháp CLEA 19
Hình 2.19. Phản ứng giữa poly(glutaraldehyde) với amin của protein 19
Hình 2.18. Phản ứng polyme hóa glutaraldehyde 19
Hình 3.1. Sơ đồ các bước nghiên cứu chung 24
Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 26
Hình 3.4. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả năng 27
Hình 3.5. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH lên men đến khả năng tổng hợp 28
Hình 3.6. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 29
Hình 3.7 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase 30
Hình 3.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất 31

Hình 3.9 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất cố định enzyme 32
vii

Hình 3.10. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định enzyme 33
Hình 3.11. Sơ đồ khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 34
Hình 4.1. Nhuộm Gram Bacillus subtilis và quan sát dưới kính hiển vi (x100) 35
Hình 4.2. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis sau hai ngày cấy trãi 35
Hình 4.3. Vòng thủy phân biểu hiện hoạt tính cellulase 36
Hình 4.4. Kết quả điện di 36
Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis theo 37
Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng 38
Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp 39
Hình 4.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 40
Hình 4.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp . 41
Hình 4.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng 42
Hình 4.11. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng tổng …42
Hình 4.12. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định Cellusoft 43
Hinh 4.13. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định 44
Hình 4.14. Khảo sát thời gian cố định Celusoft 45
Hình 4.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 45
Hình 4.16. Khảo sát nhiệt độ cố định Cellusoft 46
Hình 4.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 47
Hình 4.18. Đồ thị biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng 48

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis 8
Bảng 2.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis 8

Bảng 4.1. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 38
Bảng 4.2. Biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp cellulase 40
Bảng 4.3. Biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 41
Bảng 4.4. Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 41
Bảng 4.5. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 42
Bảng 4.6. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất cố định 44
Bảng 4.7. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 45
Bảng 4.8. Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định 46
Bảng 4.9. Biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 48







CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
Mở đầu
1

1.1. Đặt vấn đề
Công nghệ sản xuất enzyme ở Việt Nam còn đang ở giai đoạn nghiên cứu, đa
số phải nhập từ nước ngoài về. Trong khi các ứng dụng có liên quan đến enzyme thì
ngày càng tăng và hiệu quả ngày càng cao. Trong số các enzyme thông dụng có
cellulase - hệ enzyme thủy phân cellulose – là một enzyme có nhiều ứng dụng trong
các ngành công nghiệp như thực phẩm, môi trường, công nghiệp dệt, tẩy …. Việc
nghiên cứu các quá trình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam là cần thiết. Đối tượng
được sử dụng để sản xuất enzyme với qui mô công nghiệp đều là vi sinh vật. Chủng
Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872. Hệ enzyme của

Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase,
glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Cùng với Bacillus subtilis, hệ enzyme
cellulase đã được nghiên cứu.
Cross-linked enzyme aggregate, một phương pháp cố định enzyme mới, một
phương pháp cố định không sử dụng chất mang, một phương pháp đang được thế giới
quan tâm, một phương pháp được xem là góp phần cho cuộc cách mạng công nghệ
xanh. Phương pháp đã được áp dụng thành công trên rất nhiều loại enzyme và giờ đây
sẽ là những khảo sát ban đầu trên enzyme cellulase.
Cơ giới hóa, tự động hóa đi chung với nhiều phát minh và máy móc hiện đại, từ
đó các hệ thống lên men fermenter với khả năng hữu ích lần lượt ra đời. Việc áp dụng
những thiết bị công nghệ cao cũng là một phần thiết yếu giúp nâng cao hiệu năng và
hiệu suất của quá trình sản xuất enzyme.
Việc áp dụng những kỹ thuật và thiết bị lên men hiện đại, những phương thức
cố định enzyme tiên tiến để sản xuất chế phẩm enzyme hữu ích, đa dụng là hướng đi
của đề tài chúng tôi.
1.2. Mục đích đề tài
 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp để lên men chủng Bacillus subtilis thu
nhận chế phẩm cellulase đạt hiệu suất cao.
 Khảo sát điều kiện cố định thích hợp cho phương pháp cross-linked enzyme
aggregate để cố định chế phẩm Cellusoft đạt hiệu suất cao.
1.3. Nội dung thực hiện
 Xác định một số đặc tính sinh học của Bacillus subtilis.
 Xác định hoạt tính cellulase của dịch sau nuôi cấy.
Mở đầu
2

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của chủng
Bacillus subtilis ở điều kiện erlen.
 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến sinh tổng hợp cellulase của chủng
Bacillus subtilis ở quy mô fermenter.

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định Cellusoft theo phương
pháp cross-linked enzyme aggregate.
 Khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA.








CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan tài liệu
3

2.1. Enzyme cellulase
2.1.1. Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc
Cellulase là một phức hợp gồm nhiều enzyme. Các loại enzyme trong phức hợp
này sẽ lần lượt phân hủy cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Theo Wood
và McCrae (1979), quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi ba nhóm enzyme:
exoglucanase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiase (EC 3.2.1.21).
Exoglucanase còn gọi là 1,4 β-glucan cellubiohydrolase, enzyme này thủy phân
cellobiose từ đầu không khử của chuỗi glucan và cellodextrin. Endoglucanase còn gọi
là 1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase, enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4
glucoside trong cellulose trong lignin và β-D glucan tạo ra sản phẩm là cellodextrin,
cellobiose và glucose. Cellobiase còn gọi là β-D glucoside glucohydrolase hay
β-glucosidase, enzyme này tham gia phân hủy cellobiose và cellodextrin đến
cellohexose và cuối cùng thành glucose.

Các enzyme cellulase đã xuất hiện trên thị trường từ vài thập kỹ và được thu
nhận từ các nguồn khác nhau. Ở động vật cellulase được tìm thấy trong dịch tiết dạ
dày bò, các nhóm thân mềm… Ở thực vật cellulase có trong hạt ngũ cốc nảy mầm như
đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen… Còn ở vi sinh vật cellulase được sản sinh ra
bởi các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…Trong thực tế người ta thường
thu nhận enzyme cellulase chủ yếu từ vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật thường sử
dụng như nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…;
xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…; vi khuẩn: Acetobacter
xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…

Hình 2.1. Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose [32]

Tổng quan tài liệu
4

2.1.2. Cơ chất cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử, chúng là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách
tế bào thực vật, trong gỗ lá kim cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó
chiếm 43-52% thể tích. Ngoài ra còn có ở tế bào một số loài vi sinh vật nhưng không
có trong tế bào động vật.

Hình 2.2. Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose [31]
Cellulose có công thức cấu tạo là (C
6
H
10
O
5
)
n

hay [C
6
H
7
O
2
(OH)
3
]
n
trong đó n có
thể nằm trong khoảng 5000-14000, chúng do các mắt xích β-D-Glucose liên kết với
nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside (các liên kết này thường không bền trong các phản
ứng thủy phân). Cellulose chứa các glucose không phân nhánh và thường lệch một
góc 180
o
và có dạng như một chiếc ghế bành.

Hình 2.3. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose [31]
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết
hydro. Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3 nm và các sợi
sơ cấp này kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi
thường không đồng nhất và thường tồn tại hai vùng:
 Vùng kết tinh: cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác động
của điều kiện bên ngoài. Ở vùng này enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên bề
mặt hệ sợi.
 Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các
yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme
cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Tổng quan tài liệu

5

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục
lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa
lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc thì ngược lại, chứa nhiều cellulose vô
định hình.

Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi [30]
2.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme
cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Từ những nghiên cứu
riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme
cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay
phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều
cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa
ra được nhiều người công nhận hơn cả.

Hình 2.5. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson [2]

Tổng quan tài liệu
6

2.1.4. Một số ứng dụng phổ biến của cellulase
Cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình
chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công
nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường. Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với
enzyme amylase và protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là
không ít.
Cellulase được ứng dụng để cải thiện gía trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc,
gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đường hóa

các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol.
Trong công nghệ sản xuất bột giấy: trong giai đoạn nghiền cần bổ sung endo-
β-1,4-glucanase để làm tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá
trình nghiền cơ học. Việc bổ sung endoglucanase và hỗn hợp các hemicellulase,
pectinase trước khi nghiền hóa học làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào
phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: trong sản xuất các loại nước quả và
nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả. Bổ sung endoglucanase để tăng
hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả. Trong sản
xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế
bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường
hóa.
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: nguồn thức ăn cung cấp năng
lượng cho gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose,
β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột. Vì
thế, việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực
phẩm trong đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn
của động vật.
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: trong giai đoạn đường hóa của
quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân.
Tuy nhiên, việc bổ sung một số enzyme như cellulase, hemicelluase sẽ phá hủy tế bào,
giúp tăng lượng đường tạo thành và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với
amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu sẽ tăng.
Trong lên men tế bào và tái tổ hợp gen: sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế
bào để tạo tế bào trần, có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp
gen: dung hợp tế bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố mẹ.
Tổng quan tài liệu
7

2.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis

Có rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng hợp ra enzyme cellulase. Trong số đó
có cả vi khuẩn Bacillus subtilis, hệ enzyme của chúng rất phong phú và đa dạng gồm
protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase Vì vậy
Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là
công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase, Những nghiên cứu gần đây
cho thấy tiềm năng sản xuất ra enzyme cellulase của Bacillus subtilis là rất lớn [6].
2.2.1. Đặc điểm chung
Vi khuẩn Bacillus subtilis phân bố phổ biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô
nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô. Là những vi khuẩn gram dương, hình
que, ngắn, nhỏ, kích thước (3-5) × 0,6 µm, nhiều khi tế bào nối với nhau thành chuỗi
dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu
xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám
chặt vào môi trường thạch. Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 30-
50
o
C, thường lên men ở 37
o
C. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6-0,9 µm, phân bố
lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục
năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong
200-300 năm.
Vi khuẩn Bacillus subtilis có màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng
được điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi
khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu
bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày không màu, trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt
màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen.

Hình 2.6. Vi khuẩn Bacillus subtilis [29]

Tổng quan tài liệu

8

2.2.2. Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis
Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis [24]
Tên protein
Tên thư
ờ
ng dùng:

Endoglucanase. EC=3.2.1.4
Các tên khác:
 Carboxymethyl-cellulase
 Short name=CMCase=Cellulase
 Endo-1,4-beta-glucanase
Gen mã hóa Tên: eglS (bglC, gld)
Ordered Locus Names: BSU18130
Sinh vật Bacillus subtilis
Phân loại dòng Bacteria › Firmicutes › Bacillales › Bacillaceae ›
Bacillus
Bảng 2.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis [24]
Chiều dài chuỗi 499 AA.
Tình trạng trình tự Hoàn chỉnh.
Trọng lượng phân tử 55 287 Da
Sự tồn tại Tồn tại ở dạng protein

Hình 2.7. Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase của Bacillus subtilis [24]

Tổng quan tài liệu
9

2.3. Sản xuất enzyme nhờ VSV
Mãi đến thế kỷ 18 người ta mới biết về sự tồn tại của VSV trong thế giới sinh
vật, tuy nhiên việc ứng dụng các công nghệ có hoạt động của VSV thì có từ rất lâu
đời. Trong đó công nghệ enzyme từ VSV phát triển rất mạnh, đặc biệt ở thế kỷ 20 đầu
thế kỷ 21. Nguồn enzyme này dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng
loạt những ưu điểm về sinh lý VSV và về kỹ thuật sản xuất. Những ưu điểm đó được
tóm tắt như sau: tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh. Enzyme thu nhận từ vi sinh
vật có hoạt tính rất cao. VSV là giới rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công
nghiệp. Nguồn nguyên liệu dùng cho sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ
tiền và dễ kiếm. VSV có thể sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau.

















Hình 2.8. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme [2]

Lên men chìm

Sản xuất enzyme
không hòa tan
Ứng dụng
Ứng dụng
Sản xuất VSV cố
đ
ị
nh

Ứng dụng lên men
Nhân giống
Vi sinh vật giống
Lên men bề mặt
Sản xuất chế phẩm
enzyme

Thu nhận chế phẩm
enzyme thô
Thu nhận enzyme
tinh khiết
Tinh sạch enzyme
Ứng dụng
Tổng quan tài liệu
10

2.3.1. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật
Hoạt tính của enzyme hay sự tạo thành các enzyme ở vi sinh vật đều tuân theo
một qui luật trao đổi chất. Qui luật đó là: trong quá trình trao đổi chất, tế bào luôn
luôn tìm cho mình một con đường kinh tế nhất và hài hòa nhất. Điều này được thực
hiện bởi hai cơ chế điều hòa hoạt tính enzyme và điều hòa sự tổng hợp enzyme. Cơ

chế điều hòa hoạt tính enzyme được thể hiện qua hai cơ chế: điều hòa trấn áp và điều
hòa cảm ứng.
Điều hòa trấn áp là trong quá trình sinh tổng hợp enzyme xảy ra hiện tượng sản
phẩm cuối của phản ứng gây ức chế hay gây trấn áp làm cho tế bào không có khả năng
tạo ra enzyme tham gia quá trình tạo ra sản phẩm này nữa.

Hình 2.9. Cơ chế điều hòa trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm cuối cùng [2]
Điều hòa cảm ứng là làm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme. Trong tế bào vi
sinh vật tồn tại hai loại enzyme. Một loại luôn luôn được tổng hợp ra, không phụ
thuộc vào chất mà chúng tham gia phản ứng. Một loại chỉ được tạo ra với số lượng
nhỏ nếu không có mặt chất mà chúng tham gia phản ứng. Khi ta cho chất tham gia
phản ứng (gọi là cơ chất) vào môi trường, sự tạo thành enzyme sẽ tăng rất nhanh.
Monod và Cohn (1952) gọi loại enzyme này là enzyme cảm ứng.
Tổng quan tài liệu
11



Hình 2.10. Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme [2]
Như vậy khi không có cơ chất, chất kìm hãm có trong tế bào sẽ tương tác với
gen điều khiển, toàn bộ quả trình tổng hợp enzyme sẽ bị phong tỏa và không hoạt
động. Khi ta cho cơ chất vào môi trường lên men, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm
hãm, gen điều khiển thoát khỏi sự phong tỏa của chất kìm hãm và các gen tương ứng.
Enzyme được tổng hợp ra sẽ phân hủy cơ chất.
Muốn điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme bằng cơ chất cảm ứng phải
chú ý hai điểm:
 Thứ nhất, muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thì phải cho cơ chất cảm ứng
của enzyme đó vào môi trường. Ví dụ: muốn thu nhận amylase thì phải cho
tinh bột, muốn thu nhận protease thì phải cho protein, muốn thu nhận pectinase
thì phải cho pectin, muốn thu nhận cellulase thì phải cho cellulose. Tương tự

như vậy ta tiến hành thu nhận các enzyme cảm ứng khác cùng theo nguyên tắc
trên.
 Thứ hai: tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều lượng nhất định nào
đó. Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm. Do đó không
phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao.
Tổng quan tài liệu
12

2.3.2. Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan
Trong công nghiệp sản xuất enzyme trên thế giới đang tiến hành hai phương
pháp: phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men chìm. Phương pháp lên
men bề mặt đã được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ trong những năm đầu thế kỉ
XX. Sau đó, phương pháp lên men chìm được thay thế vào những năm 50-60 của thế
kỉ XX. Nhưng phương pháp lên men bề mặt lại được phục hồi rất mạnh mẽ từ những
năm 1970 đến nay. Mỗi phương pháp đều có những thế mạnh và yếu điểm riêng, tùy
theo từng mục đích mà ta sẽ chọn phương pháp lên men hiệu quả.
Phương pháp lên men bề mặt: là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật
phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt người ta sử dụng môi trường
lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (bán rắn) [2].
Phương pháp lên men chìm: là phương pháp ở đó VSV phát triển hẳn trong
lòng môi trường [2]. Phương pháp này được sử dụng trong nghiên cứu của đề tài.
Phương pháp lên men chìm có những ưu điểm cơ bản sau:
 Phương pháp lên men chìm thường cần ít diện tích. Quá trình lên men thường
được thực hiện trong các thiết bị lên men. Các thiết bị lên men thường rất gọn.
 Phương pháp lên men chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao.
Trong lên men chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống
thổi khí. Kiểm soát quá trình thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể
thực hiện được với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men. Ngoài ra, ta còn
có thể kiểm soát được nhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống
điều khiển tự động.

 Phương pháp lên men chìm có thể thực hiện liên tục bằng hệ thống nhiều thiết
bị lên men nối tiếp nhau. Do đó, việc kiểm soát chất lượng lên men trở nên rất
dễ dàng.
Quá trình lên men chìm có thể thực hiện theo ba phương pháp: lên men theo
chu kỳ (batch), lên men theo chu kì có bổ sung (fed-batch) hay lên men liên tục.
Phương pháp lên men theo chu kì đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên hiệu suất không
cao do sự tích lũy cơ chất, độc chất. Phương pháp lên men theo chu kì có bổ sung có
thể khắc phục được nhược điểm này, tuy nhiên sự tự động hóa không cao. Lên men
liên tục có ưu điểm ở khả năng tự động hóa cao nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và
phải tiệt trùng liên tục.

Tổng quan tài liệu
13

2.3.3. Thiết bị lên men (Fermenter New Brunswick Co. Bioflo 110)
Thiết bị lên men đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ vi sinh vật. Đây là
một lĩnh vực rất phức tạp và nhiều trường hợp thay đổi thiết bị lên men hợp lý sẽ thu
được kết quả lên men rất tốt. Việc thiết kế chế tạo thiết bị lên men có ảnh hưởng rất
lớn đến quá trình sinh lý của vi sinh vật.
Một thiết bị lên men hoàn chỉnh sẽ là tổ hợp của nhiều hệ thống có kiểm soát:
Hệ thống cánh khuấy, hệ thống thổi khí,


BioFlo 415 BioFlo 510
(7 đến 19.5 lít) (19.5 đến 40 lít)

BioFlo 610 BioFlo Pro
(65 đến 125 lít) (75 đến 3.000 lít)
Hình 2.11. Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co. [26]

Tổng quan tài liệu
14

2.3.3.1. Thiết bị có hệ thống thổi khí
Thiết bị có hệ thống thổi khí chỉ sử dụng trong các quá trình lên men hiếu khí.
Hệ thống thổi khí được lắp đặt trong các thiết bị lên men có những tác dụng sau:
 Giúp cung cấp oxy trong các trường hợp lên men hiếu khí, đặc biệt là quá trình
thu nhận sinh khối (nấm men, nấm sợi hay vi khuẩn).
 Giúp cung cấp CO
2
(trường hợp lên men tảo đơn bào Chlorella Spirulina hay
Scenedesmus).
 Giúp khuấy đảo môi trường làm tăng quá trình trao đổi chất, quá trình phát
triển và quá trình sinh sản.
 Giúp giải phóng các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đổi chất, làm giảm
ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men.
2.2.4.2. Thiết bị có cánh khuấy
Các thiết bị có lắp đặt cánh khuấy đều được ứng dụng trong quá trình lên men
hiếu khí cũng như trong lên men yếm khí. Cánh khuấy trong hai trường hợp này có
những tác dụng như sau:
 Làm tăng khả năng tiếp xúc giữa chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật
 Làm tăng khả năng hòa tan của oxy với trường hợp lên men trong điều kiện
hiếu khí
 Làm tăng nhanh các quá trình sinh sản của vi khuẩn nấm men và nấm sợi
2.2.4.3. Fermenter New Brunswick Co. Bioflo 110
Fermenter Bioflo110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ) là hệ thống lên men
có tính năng hiện đại, giao diện dễ sử dụng. Hệ thống được trang bị đầu dò pH, oxy
hòa tan (DO), bộ điều khiển tốc độ khuấy và nhiệt độ. pH được đo bằng đầu dò thuỷ
tinh (Ingold) và điều khiển nhờ bộ điều khiển; Proportional/ Integral/ Derivative
(PID). Đầu dò DO (Ingold) được sử dụng để đo oxy hoà tan. Điều khiển PID kiểm

soát tốc độ khuấy trộn. Nhiệt độ môi trường được đo nhờ đầu dò platinium
(Resistance Temperature Detector, RTD) và điều khiển bởi PID.
Ngoài ra còn có bơm nhu động được gắn với hệ thống để cung cấp giống và
các thành phần cần thiết khác trong quá trình lên men. Không khí vô trùng được cung
cấp nhờ máy nén khí và điều chỉnh lưu lượng nhờ đồng hồ đo lưu lượng. Headplate
(mâm nhập liệu) được thiết kế với nhiều cổng dành cho các đầu dò pH, oxy, ống nhập
liệu, ống lấy mẫu, khí thải (ngưng tụ). Tất cả được điểu khiển và hiển thị qua bộ điều
khiển trung tâm (Primary Control Unit, viết tắt là PCU). PCU là trung tâm điều khiển
cho tất cả các vessel được kết nối và các bộ điều khiển khác.