tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng pcr đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các promoter wp, cp và qp c

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các
quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung
thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu
lại có tỷ lệ rất thấp. Các nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ
UTVMH trung bình. Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác
và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm
mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất.
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô
không biệt hóa và tồn tại các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ
các gen quan trọng là EBNA1, LMP1 và 2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV
trong tế bào chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên
quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào
và có khả năng sinh ung thư trong các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm xa
nhau trong bộ gen và được biểu lộ nhờ những promoter khác nhau. EBNA1
được biểu lộ trong các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter, bao
gồm Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên trong ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp
và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều hòa biểu lộ gen EBNA1.
Ngoại di truyền được cho là có vai trò rất quan trọng trong điều hòa biểu
lộ gen, chúng bao gồm methyl hóa ADN vùng promoter, sửa chữa histon và
nucleosom. Mức độ methyl hóa xảy ra ở các vị trí CpG của ADN tại vùng
promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu
lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ.
Việc xác định mức độ methyl hóa vùng khởi động của một gen có ý nghĩa
quan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng
gen đó trong nhiều quá trình bệnh lý như ung thư, đồng thời dấu ấn này cũng
2
góp phần trong chẩn đoán sớm trong ung thư. Ngoài ra, việc làm mất methyl
hóa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng,
giúp cho việc điều trị những rối loạn hay bệnh lý khác nhau.

Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác
định được mức độ methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen. Các
kỹ thuật này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức
tạp, nhưng có những ký thuật đơn giản và thông dụng. Chúng tôi sử dụng kỹ
thuật PCR đặc hiệu methyl hóa theo nguyên lý xử lý ADN bằng phương pháp
bisulfite để xác định mức độ methyl hóa các promoter Wp, Cp và Qp liên
quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các
promoter đó. Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa giúp ích cho
nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN của nhiều gen, đặc biệt là các gen
ức chế ung thư.
Đề tài này nhằm mục đích sau:
1. Tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl
hóa cho các promoter Wp, Cp và Qp của EBV, sử dụng các nguyên liệu
là các tế bào dòng.
2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa các
promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 trong các mẫu sinh thiết bệnh
nhân ung thư vòm mũi họng.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào
biểu mô nằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại đứng hàng đầu trong số
các ung thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là liên
quan tới địa lý. Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3
vùng rất khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung
Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm. Ngược lại,
vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ chỉ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm.
Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng
lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam Á với tỷ lệ từ 8 -

12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5 trong các ung
thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu mặt cổ [4]
1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH
1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr .
Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được
nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH.
Người ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng
thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT) và EBV được phát hiện là từ tế
bào UTVMH chứ không phải từ lympho thâm nhiễm đã được chứng minh từ
chuột trụi lông được truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u này
không chứa lympho thâm nhiễm (Klein và cs 1974) [trích từ 89]. Ngoài ra,
các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định
ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô
4
vòm họng gồm những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp
với giả thuyết cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong cả quá
trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [124].
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng,
người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh
bệnh nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân
UTVMH cao hơn 8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác
hoặc người khỏe về lâm sàng (Henle và cs 1970, 1973; Klein và cs 1970)
[trích từ 89 c.binh]. Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét
nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có
Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],[156] , có giá trị để theo dõi và phát hiện
nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng theo
dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao( ref). Người ta cho rằng sự tái hoạt
hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình
phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA [89].
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt

Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô
nhiễm liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn
uống. Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết
quả phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc
(vùng Quảng Đông) là nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan
này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm
tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên
quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh
hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển dạng do EBV. Các bằng chứng
khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có giá trị thấp trong bệnh sinh
ung thư vòm họng.
5
1.2.3. Yếu tố di truyền
Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ
mắc thấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ
mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung [2]. Điều đó cho thấy rằng yếu tố di
truyền có vai trò trong bệnh sinh của UTVMH. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu
mối liên quan giữa HLA và UTVMH cho thấy có tăng nguy cơ mắc UTVMH
với tăng tần suất các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng
A2-B17, A11- B17 [13],[20]. Việc xác định các gen khác liên quan với tính
cảm thụ bệnh lý cũng đã được nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa
nitrosamine), glutathion transferase M1 [111],[153]. Cơ chế tác động của
chúng cho đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang
được khẳng định là sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp tác động của 3
yếu tố môi trường sống, EBV và HLA
1.3. Virut Epstein-Barr
1.3.1. Sinh học của EBV
Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và
nó tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm. Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua
nước bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có

triệu chứng. Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng
có thể qua sữa của mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình
dục. EBV nhân lên trong tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi
xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào. Sau khi
đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ
nguyên liệu của tế bào. Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào DNA của nhiễm
sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nó tích hợp vào nhiẽm sắc
thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu lộ rất ít
kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào lympho
6
B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch. Khi ở thể dung
giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế bào
lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên trong
cơ thể.
Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho
rằng virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra
là sự tiếp cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B
đi vào chu trình dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số
lượng lớn các hạt virus mới cho các tế bào khác trên một diện rộng (Bayliss
và Wolf 1980,1981) [trích từ 89]. Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu
mô bởi hiện tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey và Yao,
1992) [trích từ 89]. Ngoài ra, phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính
virus xâm nhập vào tế bào biểu mô [10]. Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu
mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế bào máu khác như đai thực bào,
lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Nature Killer cell).
1.3.2. Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng
172-kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid. Suốt chiều
dài của gen có thể chia làm 4 vùng chính: 1 chuỗi ngắn duy nhất (US- short
unique ), 1 chuỗi lặp ( IR- internal repeat), 1 chuỗi dài duy nhất (UL - long

unique ) và 1 chuỗi lặp cuối cùng ( TR - terminal repeat ). EBV hình thành
phân tử DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm bởi đầu TR của nó.(hình 1A). Khi
xử lý EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn
gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần.
(hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Theo mỗi chữ là ký
hiệu cho từng đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp ( trái hoặc phải) và số bắt đầu
7
theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ như BARF0, BARF1. EBV của dòng tế bào B95-8
được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555 [1].
Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử
protein lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng
nguyên được sản xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn [2]
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của EBV
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV
Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt
động trong tế bào bị nhiễm. Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10
gen trong số này được phiên mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là
kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,,3A,3B,3C, -LP; 3 loại
protenin màng tiềm ẩn ( Latent Membrane Protein): LMP1, 2A, 2B; 2 loại
RNA không mã hóa (EBV Early RNA) : EBER1&2. Có bốn thể tiềm ẩn được
phân loại dựa trên sự biểu lộ gen của virut ( được liệt kê theo bảng dưới) [11].
BamHI
IR UL TRUSTR
C
B
A
A
EBER1&2: EBV Early RNA
EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen
LMP1&2: Latent Membrane Protein

8
Bảng 1:
Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen
EBV
Người thường và các bệnh liên quan
0 EBER1 & 2
LMP2A +/-
Người thường
I EBER1 & 2
EBNA1
U lympho Burkitt,
NPC
II EBER1 & 2
EBNA1
LMP1
LMP2A&2B
NPC, U lympho loại Hodgkin
U lympho tế bào T, ung thư
tuyến nước bọt…
III EBER1&2
EBNA1- 6
LMP1
LMP2A & B
U lympho sau ghép tạng. U lympho ở
bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn
khuẩn, DLBCL?
1.3.4. Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn
1.3.4.1. EBNA1
Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng
khoảng 66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay

đổi ở các chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-
Ala) [58]. Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ
ràng: một vùng cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala
gồm 239 acid amin, vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có
chiều dài từ 459-641 [59, 60] (Hình 3).
EBNA1 là protein biểu lộ ở tất cả các tế bào nhiễm EBV [61-64] và nó
đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng)
trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut [65, 66]. Vùng
gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm ở vùng oriP của
9
prômôtơ Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa
20 đoạn nucleitid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có 4 vị trí gắn, và
một vùng có hai vị trí gắn xuôi chiều của Qp.
Hình 2. Cấu trúc của EBNA1
Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và
khi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA. Các gen này được
biểu lộ dưới sự kiểm soát của prômôtơ Cp hay các prômôtơ Wp. EBNA1
cũng có thể liên kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của prômôtơ Qp làm tự
điều hòa biểu lộ protein EBNA1 [72]. Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các
prômôtơ Cp không hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp.
Cp không hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [73, 74].
1.3.4.2. EBNA2
Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa. Do có trình tự
gen khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và
EBNA2B, cũng là dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I và typ II [78]. Các
protein EBNA2A và EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương
ứng và giống nhau về trình tự khoảng 57% [79, 80]. EBNA2 là một trong
những protein virut đầu tiên được biểu lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm,
xuất hiện 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV ở nuôi cấy tế bào in vitro[81]. Protein
này là mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu của virut và tế bào bao gồm

cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc [82, 83], và là cần thiết cho
sự bất tử của tế bào B trong in vitro [84, 85] . EBNA2 không gắn trự tiếp với
ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác như RBP-JK), PU1 các
protein các tế bào khác.
1.3.4.3. Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C)
10
Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ở
giữa bộ gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử
từ 140-180 kDa. Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ 1
và II có giống nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng [89]. Các
protein này hoạt động có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với
các protein RBP-JK [90].
1.3.4.4. EBNA-LP
Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20-
130 kDa, là kết quả của hoạt động prômôtơ Wp . Cùng với EBNA2, EBNA-
LP là một trong những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào
lympho B in vitro
1.3.4.5. LMP1
Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu
3'của bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng
virus [104, 105]. Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có ba
vùng, (i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ
nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và hai vòng nội bào (iii) một vùng
đầu C có 200 acid min bao gồm hai lĩnh vực chức năng quan trọng[104, 106]
được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Trminal Activation Region1: aa194-
232) và CTAR2 ( aa 351-386).
LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng , di căn và chống
lại chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung
thư vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm,
biến đổi tế bào Rat-1 trong ống nghiệm để tăng trưởng độc lập, và là

tumorigenic ở chuột nude [109]. Biểu hiện của LMP1 cũng tác động ảnh
hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của
11
chúng, gây biến đổi hình thái của một số dòng tế bào biểu mô [110, 111], và
làm tăng biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR [112].
1.3.4. 6. LMP2A/2B
LMP2 được mã hóa bởi chỗ ghép nối hình thành dạng vòng của EBV
[119]. LMP2 có hai loại là LMP2A và LMP2B, được phiên mã từ hai
prômôtơ khác nhau và chỉ khác là LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin ở đầu
N tận còn LMP2 thì không có. Mặc dù chưa biết được chức năng cụ thể của
LMP2B, nhưng việc biểu hiện mạnh mẽ của nócho thấy rằng nó đóng vai trò
quan trọng trong sinh học của EBV [120]. Trong khi chức năng của LMP2A
đã được kiểm tra trong các tế bào B Tuy nhiên, protein này biểu lộ ở một tỷ
lệ thấp trong các khôi u vòm họng.
1.4. Yếu tố ngoại di truyền trong UTVMH
Ngoại di truyền là nghiên cứu các cơ chế làm không biểu lộ gen mà
không liên quan đến sự thay đổi trình tự nucleotid của gen. Những biến đổi
ngoại di truyền có thể di truyền được từ thế hệ tế bào này sang tế bào khác.
Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh 3 yếu tố là: methyl
hóa ADN, sửa chữa histon và nucleosom. Các thay đối này là độc lập với
nhau và methyl hóa xảy ra ở mức độ ADN trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ở
mức độ protein.
1.4.1. Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen.
Methyl hóa ADN là sự kiện diễn ra do một nhóm CH3 liên kết đồng
hóa trị với vị trí cacbon số 5 của Xytosin nằm ở vị trí hai nu cleotid Xytosin-
Guanin viết tắt là CpG (p là liên kết phosphodiester). Khi CpG tập hợp nhiều
trong khoảng 200bp tại một ví trí nào đó trong gen có GC chiếm hơn 50% thì
người ta gọi là đảo CpG. Khoảng 10-15% CpG ở động vật có vú nằm ở vùng
đảo CpG và đảo CpG thường xuất hiện ở vị trí vùng prômôtơ và exon1của
khoảng 40% các gen của động vật có vú. Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN

12
trong quá trình phân bào nhờ các enzym methyltransferase (DNMT). Có 4
loại DNMT được xác định ở động vật có vú và cả 4 enzym đều chuyển nhóm
CH3 từ S-adenosyl methionin sang ADN. Trong các mô bình thường các đảo
CpG thường không methyl hóa. Khi chúng bị methyl hóa ở vùng khởi động
dẫn đến hai cơ chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế các yếu tố điều hòa
biểu lộ gen gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Xytosin, cơ chế này
được minh họa trong hình (?). Hai là, có các protein gắn đặc hiệu với CpG
methyl hóa làm mất axetyl của histon và làm cấu trúc sợi chromatin co lại ,
cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đó của
DNA (Hình ?).
Hình
13

Chú thích (Hình ): Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.
A: Hai nucleotid CpG ở vùng prômôtơ không methyl hóa, cho phép
phiên mã xảy ra trong các tế bào bình thường.
B: Phiên mã bị chặn bởi tăng methyla hóa trong vùng prômôtơ.
Do đó sự methyl hóa ADN của các gen trong các tế bào ung thư hiện
nay là một mục tiêu hấp dẫn điều trị và là một kiến thức mới trong lĩnh vực
chẩn đoán phân tử, tức là, phát hiện sớm bệnh bằng sử dụng PCR để xác định
methyl hóa ADN. [ luận án]
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1
14
EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các
promoter khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu
kỳ dung giải (Fp). Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt
hóa, trong khi các promoter khác không hoạt động. Ngược lại, trong thể
nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng
thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạt

động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai promoter Wp và Cp hoạt động. Hai
promoter này hoạt động luân phiên và Wp được hoạt động trước ở một thời
gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn
Hình 4. Các vùng promotor của EBV điểu khiển phiên mã.
Việc các promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khác
nhau, trong đó có methyl hóa các CpG vùng promoter. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I
và II, các promoter Wp và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do
Qp như trong trường hợp UTVMH. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa biết tại sao
trong ung thư vòm mũi họng EBV lại chỉ có biểu lộ một số gen như đã nêu,
khác với trong một số ung thư liên quan đến EBV. Nghiên cứu về methyl hóa
giúp tìm hiều cơ chế biểu lộ gen, đồng thời nó cũng là những dấu ấn giúp cho
15
chẩn đoán cũng như điều trị liên quan đến ngoại di truyền vì rối loạn này có
thể được sửa chữa nhờ những chất hóa học được bổ sung vào tế bào .
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
-Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011.
- Mẫu được thu thập tại Khoa xạ trị tổng hợp, Bệnh viện K Hà Nội.
16
- Các kỹ thuật được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của bộ môn Miễn
dịch – Sinh lý bệnh; Labo Trung tâm Y - Sinh học, Trường Đại học Y Hà
Nội; Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội.
2.2. Đối tượng nghiên cứu.
2.2.1. Nhóm bệnh nhân
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
- Bệnh nhân mới nhập viện, được chẩn đoán xác định là UTVMH dựa
vào triệu chứng lâm sàng và kết quả giải phẫu bệnh trên mô sinh thiết lấy từ
khối u vòm họng.
Các bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu này được xếp loại giai đoạn từ

II đến IVB với T
1-4
N
0 – 3
M
0
theo cách phân loại T. N. M và giai đoạn lâm
sàng của Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 1997
- Tiêu bản mô sinh thiết.
Những tiêu bản mô sinh thiết tươi và tiêu bản mô sinh thiết đúc farafin
của bệnh nhân đã được chẩn đoán là UTVMH thể không biệt hóa.
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ.
- Các thể mô bệnh học khác ngoài UCNT
- Các bệnh nhân ở giai đoạn 1 hoặc đã có di căn.
- Bệnh nhân đến khám định kỳ
2.3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu:
- Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Trình tự kỹ thuật cần thực hiện:
+ Thiết kế mồi.
17
+ Chiết tách AND, ARN, Protein.
+ Xử lý AND bằng Bisulfite
+ Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi.
+ Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu.
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu:
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin
- Quan sát và ghi kết quả xét nghiệm
- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục
kèm theo)

2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được làm sạch trước khi nhập vào máy tính. Xử lý số liệu
bằng phần mềm chương trình SPSS 15.0 với các test thống kê thích hợp trong
y học
18
2.5. Sơ đồ nghiên cứu
RT-PCA
Mẫu
ADN
MSP
Bisulfite
MMSP
CDNA
PCR
ProteinARN
Tách chiết mẫu
19
CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ
20
CHƯƠNG 4
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
21
DỰ KIẾN KẾT LUẬN
22
KHUYẾN NGHỊ
23
KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU
1. Tiến độ về thời gian
Các hoạt động triển

khai
1,2,3 4,5,6,7 8 9 10 11,12
Nghiên cứu tài liệu và
viết, bảo vệ đề cương
Thu thập số liệu
Nhập số liệu
Xử lý số liệu
Viết báo cáo và bảo vệ
2.Dự trù kinh phí
Công việc Thành tiền
1.Chuẩn bị đề cương
- Công thu thập tài liệu tham khảo
- Photo tài liệu tham khảo
- Hoàn thiện đề cương
500.000đ
200.000đ
100.000đ
200.000đ
2. Thu thập số liệu
- Triết tách mẫu
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ Bisufite
+ DNTPs
+ Enzym (Buffer)
+ Mồi
28.000.000
4000.0000
8000.000/1kit
7.500.000
5000.000/250 mẫu

3.500.000/40 Nucleotid
4. In ấn tài liệu 1.000.000đ
5. Chi phí phát sinh 500.000đ
Tổng số tiền 30.000.000đ
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
TỔNG QUAN 3
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam 3
1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH 3
1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr 3
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt 4
1.2.3. Yếu tố di truyền 5
1.3. Virut Epstein-Barr 5
1.3.1. Sinh học của EBV 5
1.3.2. Cấu trúc của EBV 6
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV 7
1.3.4. Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn 8
1.4. Yếu tố ngoại di truyền trong UTVMH 11
1.4.1. Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen. 11
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1 13
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15
2.2. Đối tượng nghiên cứu 16
2.2.1. Nhóm bệnh nhân 16
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ 16
2.3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu: 16
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu: 16
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu: 17
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin 17

2.4. Phương pháp xử lý số liệu 17
2.5. Sơ đồ nghiên cứu 18
DỰ KIẾN KẾT QUẢ 19
DỰ KIẾN BÀN LUẬN 20
DỰ KIẾN KẾT LUẬN 21
KHUYẾN NGHỊ 22