chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá bằng kết hợp phương pháp công nghệ sinh học (công nghệ đơn bội, chỉ thị phân tử...) với phương pháp truyền thống

2
BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Tên đề tài:
CHỌN TẠO GIỐNG LÚA LAI HAI DÒNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ
BẰNG KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ SINH HỌC (CÔNG
NGHỆ ĐƠN BỘI, CHỈ THỊ PHÂN TỬ) VỚI PHƯƠNG PHÁP
TRUYỀN THỐNG
MỞ ĐẦU
Hiện nay, lúa lai đã trở nên không thể thiếu được trong cơ cấu giống
cây trồng ở Việt Nam, lúa lai đã đóng góp không nhỏ
vào gia tăng sản lượng
lương thực Quốc gia bảo đảm an ninh lương thực. Diện tích lúa lai trong
những năm gần đây không tăng mà còn có phần giảm, nguyên nhân hạn chế
chủ yếu là lúa lai hiện nay chưa kháng được bệnh bạc lá.
Ở Việt Nam, bệnh bạc lá thật sự gây tác hại, nó làm giảm năng suất từ 30-
60% [15], Trường Đại học NN1,[14] Viện Bảo vệ Thực vât, Viện DTNN, đã
thu thậ
p, phân lập được nhiều nòi bạc lá khác nhau từ nước ngoài và các nòi
mới được phân lập trong nước. Kết quả đánh giá thử nghiệm của các viện,
trường, cho thấy có 3 gen kháng được phần lớn các nòi miền Bắc Việt Nam là
xa5, Xa7 và Xa21, tuy nhiên hiện nay một số gen như Xa21 vẫn kháng được
nhiều nòi bạc lá khác nhau nhưng mức độ kháng đã giảm đáng kể, vì vậy
muốn tăng cường khả
năng kháng bệnh bền vững cần phải quy tụ nhiều gen
kháng vào một giống lúa.
Bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo, chỉ có thể có kết luận, cá thể này
kháng bệnh bạc lá, cá thể khác không kháng hoặc kháng nhiều, kháng ít, khó
có thể biết được các thể nào mang 1 gen kháng, cá thể khác mang hai hay
nhiều gen là những gen nào. Nhờ chỉ thị phân tử, không những có thể xác
định nhanh chóng, chính xác những cá thể mang một hay nhiều gen mà là

những gen nào để định hướng ch
ọn giống kháng bền với bệnh bạc lá.

3
Viện lúa quốc tế đã quy tụ được những gen kháng bệnh bạc lá khác
nhau vào các giống từ IRBB1 đến IRBB 63 trong đó có giống có tới 3 hoặc 4
gen vì vậy việc sử dụng vật liệu quy tụ của IRRI kết hợp với chỉ thị phân tử
để quy tụ vào các giống lúa [28] khác nhau là hoàn toàn có thể được trong
điều kiện Việt Nam. Dòng IRBB 62 mang 3 gen trội Xa4, Xa7, Xa21 kháng
rất tốt với các nòi bạc lá của Việt Nam liên kết vớ
i các chỉ thị phân tử MP1-
MP2, P3, pTA248 vì vậy việc sử dụng dòng này làm vật liệu để lai quy tụ vào
các giống lúa khác nhau là rất tiện lợi.
Các nhà khoa học Thái Lan đã sử dụng thành công MAS và phương
pháp nuôi cấy bao phấn lúa để quy tụ gen kháng bạc lá Xa21 và gen chịu úng
SUB1 vào giống lúa KDML 105 (Khao Dak Mali).
Đối với lúa lai do sử dụng hiệu ứng trội và siêu trội là chính nên những
vật liệu, dòng, giống có chứa gen trội rất có ý nghĩa trong công tác chọn tạo
gi
ống lúa lai kháng bệnh bạc lá. Nếu ta quy tụ được hai gen Xa7 và Xa21 vào
dòng mẹ TGMS và các dòng bố khác nhau sau đó sử dụng chúng trong sản
xuất lúa lai thì có thể tạo được tổ hợp lai kháng được bệnh bạc lá[14].
Tuy vậy, các giống lúa lai chủ yếu vẫn nhập nội từ Trung Quốc và là
lúa lai hệ ba dòng nên năng suất bị hạn chế. Muốn có ưu thế lai cao cần các tổ
hợp giữa các phân loài phụ Indica/ Japonica, xong khi lai xa con lai thường b
ị
lép do không tương thích giữa dòng bố và mẹ. Để có được lúa lai cao sản cần
phải lai xa giữa các phân loài phụ và dòng bố hoặc mẹ phải có gen tương hợp
rộng S
5

n. Dòng mẹ PA64S mang gen tương hợp rộng S
5
n liên kết với chỉ thị
phân tử RM225 và RM253 đồng thời mang gen bất dục đực mẫn cảm với
nhiệt độ có thể sử dụng làm vật liệu cho chọn tạo dòng bố mẹ mang gen
tương hợp rộng.
Phương pháp nuôi cấy bao phấn là một phương pháp đã được sử dụng
rộng rãi ở nhiều nước tiên tiến trên thế giới và là một phương pháp rất tiện l
ợi

4
giúp nhanh chóng tạo dòng đơn bội kép. Đặc biệt, sử dụng phương pháp này
rút ngắn thời gian chọn dòng TGMS từ 5-6 năm ở điều kiện thường xuống chỉ
còn 1-2 năm và không phải phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Muốn
mở rộng diện tích lúa lai cần chọn tạo lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá và
trước hết phải chọn tạo dòng bố, mẹ kháng bệnh bạ
c lá vì vậy chúng tôi chọn
hướng nghiên cứu “Chọn tạo lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá bằng CNSH
(nuôi cấy đơn bội, chỉ thị phân tử) kết hợp với phương pháp thông thường” là
khoa học và có ý nghĩa thực tiễn cao.
Mục tiêu của đề tài
- Làm chủ được công nghệ tạo dòng bố, mẹ mang gen tương hợp rộng và
gen kháng bệnh bạc lá.
- Tạo được 2-3 dòng bố, 1-2 dòng mẹ ngắ
n ngày mang gen tương hợp
rộng và gen kháng bệnh bạc lá.
- Chọn được 1-2 tổ hợp lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá có triển vọng.
Đối tượng nghiên cứu
Kế thừa một số vật liệu của đề tài “nghiên cứu chọn tạo giống lúa thuần
kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử”. Đối tượng nghiên cứu là những dòng

bố, mẹ lúa lai hai dòng, gen kháng bệnh bạc lá Xa7, Xa21 và gen tương hợp
r
ộng S
5
n.
Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu chọn tạo dòng bố, mẹ lúa lai hai dòng
kháng bệnh bạc lá, sử dụng những công nghệ nuôi cấy bao phấn, chỉ thị phân
tử kết hợp với phương pháp lai truyền thống nên rút ngắn được thời gian.
Dòng bố, mẹ có gen kháng bệnh bạc lá trội Xa7, Xa21 sẽ dễ tạo được lúa lai
kháng bệnh bạc lá nên mang tính ứng dụng cao.



5
Tính cấp thiết
Hiện nay, lúa lai nhiễm bệnh bạc lá nên khó mở rộng diện tích. Lý do
chủ yếu là chưa tạo được dòng bố, mẹ mang gen trội Xa7, Xa21 kháng được
với các nòi gây bệnh bạc lá của Việt Nam. Nếu chọn tạo được những dòng bố,
mẹ mang gen này sẽ tạo được các tổ hợp lúa lai kháng bệnh bạc lá có thể mở
rộng được diện tích lúa lai ở vụ Mùa.
Ý nghĩa khoa học và th
ực tiễn
Đề tài đưa ra quy trình chọn tạo dòng bố, mẹ lúa lai hai dòng kháng
bệnh bạc lá bằng CNSH (công nghệ đơn bội, chỉ thị phân tử) nên có ý nghĩa
khoa học cao.
Các dòng bố mẹ kháng bệnh bạc lá là cơ sở chọn tạo lúa lai kháng bệnh
bạc lá, mang gen tương hợp rộng là cơ sở khai thác ưu thế lai xa nên có ý
nghĩa thực tiễn cao.

6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA
ĐỀ TÀI
1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai trong nước và trên thế giới
1.1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai trên thế giới
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng không chỉ đối với Việt
Nam mà cả trên thế giới, đặc biệt quan trọng hơn đối với những nơi mà dân
nghèo sinh sống. Vì vậy các quốc gia Châu Á hàng năm tiêu thụ tới 90% sản
lượng lúa gạo của th
ế giới. Để đảm bảo được nguồn lương thực, đáp ứng cho
mức độ tăng dân số của thế giới, trong 30 năm tới sản lượng lúa gạo yêu cầu
tăng từ 470 triệu tấn hiện nay, lên 740 triệu tấn. Do diện tích cây trồng nói
chung và cây lúa nói riêng ngày một giảm, sản lượng lương thực buộc phải
tăng mạnh hàng năm mới mong nuôi nổi lượng dân số trên thế
giới đang ngày
một tăng nhanh vì vậy cần phải chọn tạo giống lúa mới năng suất cao, chống
chịu tốt. Việc sử dụng ưu thế lai nhằm tăng năng suất lúa là rất cần thiết,
Trung Quốc là nước đầu tiên trên thế giới thành công đưa ra sản xuất lúa lai

trên thế giới, ngày nay diện tích lúa lai chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa
của nước này và đã góp phần không nhỏ
vào việc gia tăng sản lượng lương
thực xoá đói của quốc gia đông dân nhất hành tinh này.
Hiện nay, ngoài Trung Quốc, lúa lai đã được nghiên cứu ở nhiều nước
trên thế giới, Ấn Độ, Việt Nam là hai nước đã thu được những thành tựu nhất
định trong nghiên cứu và sản xuất, lúa lai đã được mở rộng và khẳng định chỗ
đứng không thể thiếu được trong sản xuất.[8]
Diện tích lúa lai
ở các nước ngoài Trung Quốc như Bănglades 40 000 ha,
Ấn Độ 560 000 ha, Philippin gần 200 ngàn ha, Mỹ 43 000 ha, ngoài ra các
nước khác như Srilanca, Ai Cập, Nhật bản cũng trồng lúa lai.
Trong những năm cuối của thế kỷ trước, lúa lai trong sản xuất chủ yếu là
lúa lai thuộc hệ ba dòng, sử dụng con lai dựa trên cơ sở của dòng mẹ là dòng

7
CMS, ngày nay trong sản xuất lúa lai hệ ba dòng vẫn còn giữ một vị trí quan
trọng vì khá ổn định và không phụ thuộc vào nhiệt độ, xong lúa lai ba dòng
còn một số hạn chế, khó duy trì và làm thuần dòng mẹ, phổ phục hồi thấp,
giá thành hạt lai cao, khó sử dụng ưu thế lai xa vì vậy đã kịch trần về năng
suất. Trung quốc đã đưa vào sản xuất nhiều giống lúa lai hệ hai dòng trong đó
có tổ hợp Pêi ả
i 64S/ 9311 cho năng suất siêu cao sản 17,1T/ ha/ vụ.[5] Trong
các năm gần đây, các công ty giống của Trung Quốc, Ấn Độ đang khảo
nghiệm nhiều tổ hợp lúa lai hai dòng ở Việt Nam và đang có kết quả tốt.[13]
Để khắc phục những khó khăn của lúa lai hệ ba dòng, các nhà khoa học đã
tìm ra hướng lúa lai hệ hai dòng và lúa lai 1 dòng. Tuy vậy lúa lai hệ 1 dòng
đang còn trong nghiên cứu về lý thuyết, vì vậy việc nghiên cứu và sử dụng
lúa lai hệ hai dòng là kinh tế, thu
ận lợi và có giá trị thực tiễn hơn cả. Lúa lai

hệ hai dòng dựa trên nền tảng sử dụng dòng bất dục đực mẫn cảm với ánh
sáng ngày ngắn (PGMS), bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ (TGMS) được
quan tâm và hiện thực hơn cả ngoài ra còn có dòng bất dục đực mẫn cảm với
nhiệt độ ngược (Anti-TGMS)
Do sự ưu việt của lúa lai hai dòng hệ TGMS so với lúa lai ba dòng,
đặc
biệt đối với các nước nhiệt đới, biên độ chiếu sáng trong ngày chênh lệch ít
trong đó sự chênh lệch nhiệt độ giữa các tháng trong năm khá lớn và tương
đối ổn định rất thuận tiện cho nghiên cứu và phát triển lúa lai hệ hai dòng, sử
dụng dòng bất dục đực nhân nhậy cảm với nhiệt độ (TGMS). Vì vậy nhiều
nước trên thế giới đầu tư nghiên cứu, chọn tạo dòng bấ
t dục đực TGMS đã
tìm được nhiều dòng có nguồn gốc khác nhau, dòng 5460S của Trung Quốc
có gen tms1 nằm trên nhiễm sắc thể số 8, dòng đột biến từ Norin PL12 có gen
tms2 nằm trên nhiễm sắc thể số 7, dòng đột biến từ IR32364 của IRRI có gen
tms3 nằm trên nhiếm sắc thể số 6,
dòng TGMS-VN-1 của Việt Nam,[23] đột
biến từ giống Chiêm Bầu có gen tms4 nằm trên nhiễm sắc thể số 2, dòng SA2
của Ấn Độ có gen tms5 nằm trên nhiễm sắc thể số 9, Dòng TGMS-VN-6 thu

8
được từ đột biến D84-1 của Việt Nam có gen tms6 nằm trên nhiễm sắc thể số
4, dòng Anti-TGMS có gen rtms1 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 của lúa.
Hàng năm Trung Quốc có hàng trăm tổ hợp lúa lai mới và đang xuất khẩu
sang các nước khác mang lại nguồn ngoại tệ đáng kể và tạo them công việc
nâng cao thu nhập cho nông dân.
1.1.2 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai trong nước
Ở Việt Nam, sản lượng lúa chiếm gầ
n 90% tổng sản lượng các cây lương
thực. Ngoài ra, trong khẩu phần dinh dưỡng của người Việt Nam, cơm cung

cấp tới 68% lượng ca-lo cần thiết cho cơ thể. Do diện tích cây trồng nói
chung và cây lúa nói riêng ngày một giảm, sản lượng lương thực buộc phải
tăng mạnh hàng năm mới mong nuôi nổi lượng dân số trên thế giới đang ngày
một tăng nhanh. Riêng đối với Việt Nam, các nhà kinh tế nước ngoài cho rằng
t
ừ nay cho đến năm 2020, sản lượng lúa cần phải tăng thêm 1,43% mỗi năm
thì mới đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ của người dân (Evenson, 1999).
Từ năm 1991, lúa lai đã được nhà nước ta quan tâm, đầu tư nghiên cứu,
sản xuất và ứng dụng. Đến nay, lúa lai đã được đưa vào cơ cấu giống chính
thức của hầu hết các tỉnh và trở thành không thể thiếu được,[7] đặc biệt r
ất
cần cho vùng trồng cây vụ Đông. Năng suất lúa lai trong vụ Xuân tương đối
ổn định và đã góp phần không nhỏ vào việc gia tăng sản lượng lương thực ở
nước ta. Chất lượng lúa lai ngày được cải thiện, nhiều giống lúa lai hiện nay
được người tiêu dùng đánh giá cao, giá thành gạo của nhiều giống lúa lai cao
hơn một số giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc đang được tr
ồng phổ
biến ở Miền Bắc như Q5, Khang Dân 18.
Diện tích lúa lai hàng năm khoảng 600 ngàn ha (tương đương 18.000 tấn
hạt lai) và được trồng phổ biến ở Miền Bắc. Các giống lúa lai mới ngắn ngày,
dễ chăm sóc, tỏ ra có sức chống chịu với một số điều kiện bất lợi với thời tiết
và điều kiện ngoại cảnh tốt hơn lúa thu
ần nên có đóng góp vào sự gia tăng sản
lượng lương thực trong cả nước.
Mặc dù chúng ta đã làm chủ được công nghệ sản xuất hạt lai F1,[8] nhưng
giống lúa lai đang được trồng chủ yếu nhập khẩu từ Trung Quốc nên không
chủ động trong sản xuất, nhiều khi bị ép giá đến 120-130 ngàn đồng/ kg. Tuy
một số tổ hợp lúa lai của Trung Quốc có thể sản xuất được ở Vi
ệt Nam nhưng
các dòng CMS chúng ta vẫn chưa làm thuần đủ số lượng và chất lượng để đáp

ứng nhu cầu của sản xuất. Đây là một việc khó mà đến nay nhiều đơn vị
nghiên cứu, sản xuất lúa lai trong nước phải chấp nhận.

9
Qua nhiều năm thử nghiệm, đến nay các nhà khoa học Việt Nam đã khẳng
định, lúa lai hai dòng hệ TGMS rất tiện lợi cho việc chọn và nhân dòng mẹ,
sản xuất hạt lai ở nước ta.[3] Nhiều dòng bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt
độ TGMS đã được tạo ra ở Việt Nam, dòng TGMS-VN1 đột biến từ giống lúa
Chiêm Bầu của Việt Nam, mang gen tms4 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 c
ủa
lúa, TGMS-VN-6 có gen tms6 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội là nơi có đội ngũ nghiên cứu lúa lai
rất mạnh đã tạo được các dòng T1S-96, 103S, T4S, T7S đang được đưa ra
sản xuất đại trà. Các dòng TGMS của Việt Nam [23] đã có đủ những đặc tính
tốt của dòng mẹ, thấp cây, ngắn ngày, tỷ lệ thò vòi nhuỵ ra ngoài sau khi nở
hoa cao, khả năng nhận hạt phấ
n từ bên ngoài tốt, độ bất dục đực ở nhiệt độ
cao ổn định có khả năng kêt hợp cao.[3], [7] Một số tổ hợp lúa lai của Việt
Nam ngắn ngày, năng suất cao, nhiều tổ hợp có chất lượng tốt như VL 20, VL
24, TH3-1, TH3-3, TH3-4, TH5-1, TH5-4, TH7-2 đã được sản xuất chấp
nhận và ngày càng chiếm được niềm tin cuả nông dân, các đơn vị sản xuất và
cung ứng giống lúa lai trong nước. (S
ơ kết sản xuất lúa lai vụ Đông-Xuân
2007-2008 và vụ Mùa 2008 và vụ Đông-Xuân 2008-2009 các tỉnh Phía Bắc
của cục Trồng trọt ngày 9-7-2008)
Trung tâm Nghiên cứu Lúa lai- Viện CLT và CTP đã tạo được nhiều
dòng TGMS khác nhau như AMS30S, AMS31S, AMS32S, AMS33S…và
nhiều tổ hợp lúa lai HYT83, HYT100, HYT 103, HYT 106, HYT 107…
Công nghệ sản xuất hạt lai đã được nhà nước ta quan tâm từ năm 1991,
đến nay không những nhà khoa học mà cả nông dân cũng có thể sản xuất

được hạt lúa lai, đây là một kết qu
ả rất đáng trân trọng trong đó phải kể đến
hệ thống Khuyến nông Quốc gia. Năng suất hạt lai đã đạt được khá cao từ 3-4
tấn/ ha, như vậy việc sản xuất lúa lai trong nước đã trở thành một nghề nông
mang lại hiệu quả thu nhập cao và còn đóng góp lớn vào sự nghiệp phát triển
lúa lai nước nhà. Hiện nay, nhiều công ty giống cây trồng trong nước đã đầu
tư khá l
ớn vào nghiên cứu và sản xuất hạt lai F
1
mang lại hiệu quả kinh tế và
góp phần vào phát triển lúa lai ở nước ta. Tuy chúng ta đã làm chủ được hầu
hết các khâu trong quá trình nghiên cứu và sản xuất lúa lai, xong tổng số hạt
giống lúa lai sản xuất được trong nước mỗi năm mới đáp ứng khoảng 25-30%
diện tích lúa lai trong cả nước.
Các giống lúa lai đang được trồng phổ biến nhập nội và sản xuất trong
nước hiện vẫn bị nhi
ễm bệnh bạc lá nên khó mở rộng diện tích ở vụ Mùa.
Theo kế hoạch của Bộ NN & PTNT đặt ra là đến năm 2010 số lượng hạt
giống lúa lai sản xuất được trong nước cần phải đáp ứng được 70% diện tích

10
trồng lúa lai. Diện tích lúa lai trong những năm gần đây không tăng mà còn có
phần giảm, nguyên nhân hạn chế chủ yếu là lúa lai hiện nay chưa kháng được
bệnh bạc lá, số lượng các tổ hợp lúa lai của Việt Nam còn ít, số dòng mẹ
TGMS chọn ra từ trong nước còn ít và chưa thật ổn định, chưa có các gen trội
kháng bạc lá như Xa7, Xa21 để có thể tạo ra lúa lai kháng bệnh bạc lá. Một số
dòng mẹ nhập nộ
i từ Trung Quốc như Pêi ải 64S có dạng cây đẹp, có gen
tương hợp rộng xong vòi nhuỵ nhỏ, tỷ lệ vòi nhuỵ thò ra ngoài thấp dẫn đến
khả năng nhận phấn từ bên ngoài thấp, năng suất hạt lai thấp. Các dòng bất

dục đực thu thập từ IRRI cũng vậy, mặc dù khả năng kháng sâu, bệnh và chất
lượng gạo khá hơn nhưng tỷ lệ thò vòi nhuỵ kém, khó sản xuất h
ạt lai.
1.2 Bệnh bạc lá và những nghiên cứu bệnh bạc lá
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 –
1885, sau đó Takasi (1908) và Bokusa (1911) đã nghiên cứu và phân lập
thành công vi khuẩn, rồi tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng vi khuẩn
vừa phân lập được. Tiếp sau Nhật Bản, một loạt các nước đã thông báo về
bệnh bạc lá lúa ở nước mình. Năm 1970, bệnh xuất hiệ
n ở hầu hết ở các nước
Châu Á (trừ Tây Á), ở các nước Châu ÂU vào năm 1973 và ở Châu Mỹ La
Tinh vào năm 1975. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa (vi khuẩn bạc lá lúa) được
nhiều nhà khoa học nghiên cứu, phân lập nên nó được gọi với nhiều tên khác
nhau như: năm 1927, theo khái niệm đặt tên của EF. Smit vi khuẩn này được
gọi là Bacterium Oride (Uyed et ishitama) Nakata, sau đó được đặt tên là
Xanthomonas Oryzae (Uyed et ishitama) Dowson, đến năm 1982, vi khuẩn
này được đặt tên là X. Campestri pv. Oryzea (Uyed et ishitama) Dowson
1.2.1 Đặc đi
ểm, triệu chứng bệnh bạc lá lúa.
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas Campestris p.v.oryzae
Dowson gây ra, bệnh này phổ biến ở các nước trồng lúa trên thế giới. Tác hại
chủ yếu của bệnh là làm cho lá lúa đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanh chóng
bị khô, chết, bộ lá khô ảnh hưởng tới khả năng quang hợp và tạo ra các chất
sống cho hạt. Từ đó, những ruộng lúa bị bạc lá có tỉ lệ lép rất cao, làm n
ăng
suất giảm lớn.

11
Bệnh bạc lá lúa gây hại trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của
cây lúa, vết bệnh điển hình thời kỳ cấy trên đồng ruộng, sau đó khi đẻ nhánh -

trỗ - chín sữa, trường hợp nghiêm trọng bệnh xuất hiện ngay giai đoạn mạ.
- Trên mạ: Triệu chứng không biểu hiện đặc trưng như trên cây lúa, do
đó nếu ta không quan sát kĩ thì rất dễ nhầm lẫn sang bệnh khô đầu lá lúa sinh
lý, vi khuẩn gây bệnh gây ra các tri
ệu chứng ở mép lá, múp lá với những vết
dài ngắn khác nhau, có màu xanh vàng, nâu bạc, rồi khô xác và chết.
- Trên lúa: Triệu chứng vết bệnh thể hiện rõ hơn, tuy nhiên nó có
thể thay đổi ít hay nhiều tùy thuộc vào từng giống và điều kiện ngoại cảnh.
Vết bệnh từ mép lá, phiến lá rồi lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo
gân chính, nhưng cũng có khi xuất hiện từ gân lá rồi lan rộng ra. Vết bệnh lan
rộng theo đường g
ợn sóng, vết bệnh có màu vàng, mô bệnh tái xanh, vàng
lục, lá màu bạc khô xác. Thông thường ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe
phân biệt nhau rất dễ dàng có giới hạn theo đường gợn sóng màu vàng hoặc
khô vàng có khi chia lá thành những đường viền màu nâu đứt quãng hoặc
không đứt quãng. Trong điều kiện độ ẩm cao trên bề mặt ngọn khoảng vài
phân, vết bệnh được phát triển dọc phiến lá cả về chiều dài và chiều rộng.
Quanh vết bệnh thườ
ng có những viền gợn sóng để phân biệt phần bị bệnh và
phần không bị bệnh. Trên những cây bị nhiễm bệnh, lá bệnh thường bị héo
tàn có màu bạc trắng rồi chết. Trên mô bệnh còn tươi vào buổi sáng ta quan
sát thấy những giọt dịch vi khuẩn có hình tròn nhỏ, có màu vàng đục, khi keo
đặc có màu nâu hổ phách. Giọt dịch này chuyển sang màu vàng rơm đọng lại
thành hình cầu nhỏ li ti trên lá.
- Trên hạt: Quan sát thấy hạt bị bệnh có nhữ
ng vết bệnh không màu,
xung quanh cso viền nước. Các vết bệnh được thấy rõ khi hạt thóc còn non và
xanh, khi hạt chín vết bệnh màu vàng tím hoặc màu nâu nhạt.

12

Hình 1.2. Ruộng lúa bị cháy do bệnh bạc lá
1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá.
Vi khuẩn bạc lá lúa trước đây có tên là Pseudomonas oryzae, hoặc
Phytomonas oryzase, về sau Dowson đặt tên Xanthomonas Campestris
p.v.oryzae Dowson xâm nhập vào cây có tính chất thụ động. Nó có thể xâm
nhiễm qua thủy khổng, qua các lỗ khí trên mút lá, mép lá, đặc biệt là qua vết
thương xây xát trên lá. Khi tiếp xúc với bề mặt lá có màng nước, vi khuẩn dễ
dàng di động, xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thương. Sau đó
sinh sản và nhân lên nhanh chóng về mặt số lượng, theo các bó m
ạch dẫn lan
rộng đến các xị trí khác của lá. Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc
phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt lá tiết ra các giọt dịch vi khuẩn. Thông
qua sự va chạm giữa các lá lúa, nhờ gió, mưa truyền bệnh sang các lá khác để
tiến hành xâm nhiễm nhiều lặp lại lần trong thời kỳ sinh trưởng của cây lúa,
cho nên bệnh bạc lá tuy có phạm vi lan truyền rộng nhưng còn phụ thu
ộc rất
nhiều vào điều kiện thời tiết như mưa, bão
1.2.3 Thành phần nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá.
Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI đã khẳng định tính chuyên hóa kí
sinh của vi khuẩn gây bệnh trên bộ giống chỉ thị nòi. Người ta chỉ ra rằng
phản ứng khác biệt giữa các giống chỉ thị với các nòi vi khuẩn đã chứng minh
một cách đúng đắn về sự tồ
n tại của các nòi vi khuẩn bạc lá lúa. Các nhà khoa

13
học đã dựa vào sự khác nhau về khả năng lây nhiễm của vi khuẩn và khả năng
chống nhiễm của các bộ chỉ thị nòi với các nòi vi khuẩn để chia vi khuẩn
thành các nòi sinh lý. Ở Nhật Bản nghiên cứu nòi được tiến hành từ năm 1957
khi phát hiện thấy giống Aisacase chống bệnh trở nên nhiễm bệnh, họ đã xác

định được ở Nhật Bản có 5 nhóm nòi, Philippin đã xác định có 4 nòi và ở
Indonesia có 9 nhóm nòi.
Ở nước ta trong những năm gần đây vấn đề này mới được nghiên cứu.
Theo tác gia Lê Lương Tề thì ở đồng bằng sông hồng có ít nhất là 3 nòi bạc
lá. Tác giả Tạ Minh Sơn sử dụng tổng hợp bộ giống chỉ thị nòi của Nhật Bản
và IRRI đã xác định ở Việt Nam có 10 nhóm nòi vi khuẩn đặt tên từ 1 – 10,
tác giả còn cho biết các nhóm nòi vi khuẩn ở Việt Nam có đặc tính khác hẳn ở
Nhật Bản và Philippin.
Viện bảo vệ thực vật có nhận xét: “Vi khuẩn bạc lá phân lập từ các giống
chống bệnh có sức gây bệnh cao hơn hẳn các vi khuẩn phân lập từ các giống
nhiễm bệnh”.
1.3 Những thành công và hạn chế của chọn giống lúa bằng phương
pháp lai cổ điển.
Chọn giống lúa bằng phương pháp cổ điển được áp dụng từ r
ất sớm, bao
gồm các phương pháp chính như: nhập nội, gây đột biến, lai chuyển gen
kháng bệnh bạc lá rồi cho phân ly và chọn lọc.
Lai tạo là một phương pháp tạo giống truyền thống, nhờ lai tạo ta có thể
quy tụ được nguồn gen ở các giống khác nhau. Nếu đột biến tạo ra nguồn
nguyên liệu sơ cấp thì lai tạo tạo ra nguồn nguyên liệu thứ cấp cung cấp
nguồn vật liệ
u cho chọn lọc. Nhiều dòng, giống mới mang những đặc điểm
phù hợp mục đích của con người được tạo ra nhờ lai tạo kết hợp nguồn gen
quý từ dòng bố và dòng mẹ. Ngày nay người ta thường áp dụng phương pháp
lây nhiễm bệnh nhân tạo để chọn các dòng kháng bệnh ngay từ đầu xong khó

14
phát hiện dòng có 2 hay nhiều gen kháng bạc lá khi sử dụng nhiều gen khó
biết là gen nào.
1.4 Những nghiên cứu sinh học phân tử về gen kháng bạc lá lúa

Cho đến nay, có 35 gen điều khiển tính trạng kháng bệnh bạc lá lúa đã
được tìm ra từ các giống lúa hoang dại, [31] lúa trồng hoặc được tạo ra từ sự
thay đổi di truyền. Các gen kháng bệnh bạc lá đã được xác định nằm trên 8/12
nhiễm sắc thể của lúa và được kí hiệu theo thứ t
ự lần lượt từ Xa1 đến
Xa31,[27] xa32,[45], xa33, Xa35 [31]. 22 gen trội (dominant) (Xa), 13 trong
số đó là gen lặn bao gồm: xa5, xa5 (t), xa8, xa13, xa15, xa19, xa20, xa24,
xa28, xa31 và xa32, ba gen khác là xa15, xa19, xa20 được tạo ra bởi sự thay
đổi di truyền. Các gen kháng bạc lá có thể bị kiểm tra một gen đơn trội (Xa1,
Xa2, Xa3, Xa7,…), một gen đơn lặn (xa5, xa8, xa13,…) hoặc do hai gen liên
kết với nhau như Xa1/Xa4, Xa1/Xa7, Xa1/Xa10…. Vì vậy mức độ chống bệnh
theo đó cũ
ng khác nhau. Một số gen kháng bệnh có cấu trúc protein tương đối
giống nhau, các nhà khoa học kết luận là do chúng liên kết chặt chẽ hoặc do
chúng allen với nhau như Xa26 có protein giống Xa21, Xa22(t), Xa23. [41],
[43], [ 44], [45]
Một số gen kháng bạc lá và các chỉ thị phân tử liên kết gần với các gen
này đã được định vị trên bản đồ nhờ sử dụng phương pháp RFLP, RAPD,
STS, SSR [41]. Các gen này nằm trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau
như: gen Xa29t, xa32 nằm trên NST 1[45]; xa24 nằm trên tay dài c
ủa NST số
2 [43]; gen Xa1, Xa2, Xa12, Xa14, xa31 cùng nằm trên NST số 4 [27] ; gen
Xa7, Xa27 (t) nằm trên NST số 6[30], chỉ thị phân tử liên kết gần với gen Xa7
là L263, R276, G329, R11; gen xa8 trên NST số 7, gen lặn xa13 liên kết với
marker RG136 trên NST số 8[33]; gen Xa3, Xa4, Xa21, Xa22t, Xa23, Xa26t,
xa32t định vị trên NST 11,[45], gen Xa21 liên kết với marker RG 103 (Ronal
và ctv, 1992). Gen Xa25t, xa32 định vị trên NST số 12 [31]. Hiện nay trên
NST 3, 9, 10 chưa phát hiện gen kháng bạc lá.

15

Theo IRRI 2007, gen kháng bạc lá được phát hiện trên các giống lúa và
vị trí của chúng trên NST như bảng sau:
Bảng 1.1: Nguồn gốc một số gen kháng bệnh bạc lá ở lúa.
R-gene Donor Chrom R-gene Donor Chrom
Xa1
Kogyoku 4
Xa17
Asominori -
Xa2
Tetep 4
Xa18
IR24, Toynishiki -
Xa3
Wase Aikoku 11
xa19
XM5 -
Xa4
TKM6 11
xa20
XM6 -
xa5
DZ192 5
Xa21
O. longistaminata 11
Xa7
DV85 6
Xa22(t)
Zhachanglong -
xa8
PI231129 7

Xa23
Oryza rufipogon -
Xa10
CAS 209 11
xa24(t)
DV86 -
Xa11
IR8 -
xa25
Nep Bha Bong To -
Xa12
Kogyoku 4
Xa26
Arai Raj -
xa13
BJ1 8
xa27
Lota Sail -
Xa14
TN1 -
Xa29(t)
O. barthii 1
xa15
XM41 -
Xa33(t)
Ba7
Xa16
Te-tep -
Xa35(t)
Oryza minuta

Các gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 được các chuyên gia lưu tâm nhất do các
gen này khi tổ hợp cùng với nhau có phổ kháng rộng. Ấn Độ đã tạo ra các
dòng mang nhiều gen kháng làm nguồn vật liệu để chuyên tổ hợp các gen này
vào các giống lúa thương mại làm tăng khả năng kháng bạc lá của các giống
lúa.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2002) sử dụng phương pháp RAPD,
với hai mồi PB 7, PB 8 liên kết với gen Xa21, STS marker Npb181 liên kết
với gen Xa4, RFLP marker RG556 liên kết với gen xa5
, các gen này đã được
xác định ở quần thể F
2
của lúa mùa địa phương lai với giống lúa cải tiến.

16
Dùng kỹ thuật PCR phát hiện có 8/120 giống lúa địa phương thu từ các tỉnh
vùng núi phía Bắc chứa gen Xa7.
Trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, ta đã sử dụng nhiều gen
kháng bệnh bạc lá như Xa4, xa5, Xa7, Xa13, Xa21, Xa23,… và một số trình
tự mồi kháng bệnh bạc lá liên kết với các gen đã được công bố.
1.5 Thành tựu khoa học trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong
chọn tạo giống lúa (Maker Assisted Selection).

Cho đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh bạc lá lúa vì vậy việc tạo ra
giống lúa mang gen kháng bệnh là việc cần thiết và hữu hiệu nhất để phòng
trừ và giảm bớt thiệt hại do bệnh này gây ra [28].
Trên thế giới nhiều nước đã sử dụng phương pháp MAS (marker RFLP)
để tạo ra nhiều giống lúa kháng bệnh bạc lá. Sự kết hợp của phương pháp lai
tạo quy tụ gen kháng bạ
c lá và MAS đưa đến những thành công lớn cho

ngành sản xuất lúa. Những nghhieen cứu cho thấy nếu quy tụ nhiều gen
kháng hữu hiệu vào cùng một giống lúa thì khả năng kháng sẽ cao và phổ sẽ
rộng hơn [33],[46].
Ở Philippin, các nhà khoa học đã quy tụ thành công 3 gen kháng trội vào
dòng mẹ bất dục đực phản ứng với nhiệt độ TGMS [38].
Ở Ấn Độ các nhà khoa học đã quy tụ kết hợp 2 gen Xa4, Xa21 vào cùng
mộ
t giống lúa (Davierwala et al, 2001). Sing et al (2001), đã sử dụng MAS để
quy tụ 3 gen kháng xa5, xa13, Xa21 vào giống lúa trồng PR106.
Ở Trung Quốc phương pháp MAS cũng được các nhà khoa học sử dụng
trong chọn tạo giống lúa. Họ đã quy tụ được một số gen kháng chủ yếu như
xa5, xa7, Xa21… vào cùng một giống lúa. Dòng phục hồi Shuhui207 được
quy tụ 2 gen trội kháng bạc lá Xa4, Xa21, qua kiểm tra thấy khả năng kháng
cao hơn và có phổ kháng rộng hơn so v
ới dòng chưa được quy tụ gen kháng
ban đầu Minghui725 [46]. Chuyển gen Xa21 vào dòng phục hồi Minghui63,
tạo thành dòng Minghui (Xa21) khi lai với Zhenshan97A tạo con Shanyou63

17
(Xa21) kháng được bệnh bạc lá, cho trọng lượng hạt và năng suất cao hơn
dòng đối chứng Shanyou63 [46].
Ở Thái Lan phương pháp MAS được sử dụng để tạo ra nhiều giống mới
vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, đặc biệt kháng được bệnh bạc lá, rầy
nâu… hơn hẳn giống Khoa Dok Mali truyền thống. Họ đã sử dụng thành công
phương pháp MAS và phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa để
quy tụ gen
kháng bạc lá Xa21 và gen chịu úng (SUB trên NST số 9) vào giống lúa
KDML 105 (Khoa Dok Mali). MAS cũng được sử dụng kết hợp với nuôi cấy
bao phấn để quy tụ gen kháng bạc lá ở giống lúa chất lượng cao Jao Hom Nin
và gen chịu hạn ở giống lúa DN15 bằng cách lai giữa giống lúa JHN Và

DN15 và đưa 6 dòng BC1F3 mang cả 2 gen trên vào nuôi cấy bao phấn. Kết
quả thu 154 dòng nhị bội mang cả gen bạc lá và gen chịu hạn.
Ở Việt Nam, nghiên cứu tìm hiểu các gen kháng bệnh bạ
c lá các nhà
khoa học đã kết luận: các gen Xa4, Xa7, xa5 và Xa21 chống được hầu hết các
nòi bạc lá ở Miền Bắc Việt Nam. Hiện nay, tổ hợp 2-3 gen trong số các gen
xa5, Xa7, Xa21 có thể chống được hầu hết các nòi bạc lá ở đồng bằng Bắc
Bộ.[ thủy]. Năm 2005, TS Phan Hữu Tôn và cộng sự đã ứng dụng kĩ thuật
PCR phát hiện 4 gen kháng bạc lá từ 500 giống lúa địa phương, thu được kết
quả: 56 giống chứa gen Xa4, 36 giống chứa gen xa5, 16 giống chứa gen Xa7,
không có giống nào chứa gen Xa21.
Nguyễn Thị Lang và cộng sự tìm ra marker liên kết với gen Xa4, xa5
trên giống lúa cao sản, marker RM144 (Xa4) là giống OM2517, OM3428 và
marker RM122 (xa5) là các giống OM2492, OMCS2000. Đồng thời tìm ra
gen kháng với quần thể trên giống lúa mùa đối với gen xa13 thông qua STS
marker (RG136) trên quần thể IR24/NangSom. Ứng dụng marker phân tử để
hỗ trợ chọn lọc các quần thể
trong lai Backcross để chuyển gen kháng bạc lá
[2], [8].

18
Tác giả Dương Thanh Tài và các cộng sự tại Công ty Giống cây trồng
Miền Nam đã chọn tạo thành công giống lúa lai Bắc Ưu 903 kháng bệnh bạc
lá. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp hồi giao kết hợp thanh lọc
bệnh nhân tạo để chuyển gen Xa21 vào giống bố Quế 99, từ đó tạo ra Bắc Ưu
903KBL (có kết hợp dòng bất dục BoA). Giống lúa lai Bắc Ưu 903KBL gần
như giữ
nguyên đặc tính di truyền của giống Bắc Ưu 903 đồng thời kháng
bệnh bạc lá rất tốt. Bắc Ưu 903KBL đã chính thức được Bộ NN – PTNN công
nhận giống mới. [1]

Viện Nghiên cứu Lúa, trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội đã thành công
trong việc chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào giống lúa Bắc thơm 7 và giống
lúa lai Bắc Ưu 253. Tác giả Nguyễn Văn Hoan và cộng sự đã chuyển giao
thành công công nghệ sản xu
ất hạt giống cho tỉnh Hải Dương. Các mô hình
sản xuất của hai giống lúa trên ở Hải Dương đã cho năng suất cao, an toàn
trong sản xuất do đã kháng được bệnh bạc lá, nhất là khi canh tác trên các
vùng đất trũng, có nguồn bệnh bạc lá. [7]
Tuy đã có nhiều nghiên cứu về bệnh bạc lá và cũng có nhiều giống lúa
kháng bệnh bạc lá được chọn tạo ở Việt Nam nhưng các giống lúa này chủ
yế
u chỉ mang gen đơn nên tồn tại trong sản xuất không lâu vì tính kháng bệnh
không bền vững và nhanh chóng bị phá vỡ trong vài năm. Chính vì vậy chọn
tạo giống lúa mang từ 2 gen kháng bệnh hữu hiệu trở lên là cần thiết hiện nay.
1.6 Thành công của phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo
giống lúa.
1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong phần lớn các chương trình chọn giống, việc tạo giống mới cải tiến
bao g
ồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn
trong các thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp
tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các

19
dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do đó tiết kiệm
nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới [32].
Theo Miah và cộng sự (2000), khả năng hình thành callus bằng nuôi
cấy bao phấn lúa có tính di truyền. Các tác giả nghiên cứu sử dụng kỹ thuật
luân giao, các bao phấn chứa tiểu bào tử đơn nhân của hai giống japonica
(Minehikari và Taipei 309), hai giống indica (Mingolo và Suweon 290), và 12

con lai F1 của lai luân giao (diallel crosses) của 4 bố m
ẹ được nuôi cấy trên
môi trường Chaleffs R2 và đánh giá tạo callus. Các bố mẹ biểu hiện sự sai
khác có ý nghĩa hình thành callus từ bao phấn, từ 41.9% (Taipei 309) đến 0%
(Suweon 290). Như vậy khả năng hình thành callus có khả năng là đặc điểm
di truyền lặn của một khối đơn gen. Kiểu gen japonica dường như hình thành
cullus tốt hơn so với các bố mẹ khác.[32]
Trong nuôi cấy bao phấn, tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu được tỷ lệ

số cây đơn bội khác nhau, có thể thu được các cây có mức độ bội thể cao. Các
bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ các cây của quần thể F1 nhằm
tạo ra sự đa dạng di truyền tối đa trong quần thể các cây đơn bội được tạo
thành. Nhiễm sắc thể của cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn, sau khi được
lưỡng bội hoá, sẽ trở thành cây lưỡ
ng bội thuần nòi, từ các cây này sẽ tạo
thành quần thể các dòng thuần, qua đánh giá chọn lọc và tạo ra giống mới.
Kiểu gen được cho là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh
hưởng đến sự hình thành callus và tái sinh cây xanh khi nuôi cấy bao phấn
lúa. Niizeki (1983) và Heberle-Boss (1985) đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của
kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen và môi trường có ảnh hưởng đến sự
hình thành callus và tái sinh cây xanh.
Nuôi cấy bao phấn chính là một phương pháp
để tạo ra các dòng đồng
hợp tử trong quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng
phương pháp truyền thống. Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của quá

20
trình nuôi cấy bao phấn. Chúng có đặc điểm là đồng hợp tử rất cao và được
coi là nguồn vật liệu đa dạng, phong phú cho chọn giống [9], [12]
Đối với chọn giống lúa lai, nuôi cấy bao phấn nhằm:

Tinh lọc và chọn nhanh dòng bố, mẹ trong lúa lai hai dòng:
- Rút ngắn quá trình chọn tạo dòng bố
- Rút ngắn quy trình chọn tạo dòng mẹ TGMS
- Tách ra được những dòng thuần có năng suất cao từ cây lai dị hợp tử.
Các bao phấn dùng để nuôi c
ấy thường được lấy từ các cây lúa của quần
thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự di truyền tối đa trong quần thể [5], [8], [10].
Nhiều nước trên thế giới đã sử dụng rất thành công phương pháp nuôi
cấy bao phấn lúa trong chọn tạo giống mới. Ở Trung Quốc, một lượng lớn các
giống lúa mới được tạo ra nhờ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa và được trồng
trên di
ện tích hàng nghìn ha (Chen 1986). Năm 2002, Zeng và công sự đã
nuôi cấy 2600 bao phấn của dòng phục hồi Minghui 81 đã được chuyển gen
cry1Ac trên môi trường SK3. Các tác giả đã thu được 83 cây xanh tái sinh,
trong đó có 43 cây đơn bội kép và 40 cây đơn bội. Kết quả chạy PCR cho
thấy có 55/83 dòng mang gen chuyển cry1Ac (tỷ lệ 2:1). Các tác giả đã khẳng
định: Nuôi cấy bao phấn lúa có giá trị rất lớn trong chọn giống lúa phân tử
[24], [25].
Ở Hàn Quốc, chọn giống nhờ công nghệ đơn b
ội được đưa vào chương
trình chọn giống quốc gia năm 1977, chỉ trong 7 năm 4 giống lúa đã được tạo
ra (Chung 1992). [43] Các nhà khoa học Philippin đã sử dụng phương pháp
nuôi cấy bao phấn để cải tạo và tạo ra rất nhiều giống lúa cho năng suất cao,
chất lượng gạo tốt và mang các gen kháng như: Kháng bệnh bạc lá, đạo ôn,
rầy nâu [38]. Victoria và cộng sự đã nuôi cấy bao phấn tổ hợp lai F1-506
(con lai giữa C4044-2B-2-2 và IR13540-56-3-2-1, tác gi
ả đã thu được 10
dòng đơn bội kép.

21

Hiện nay, sử dụng chỉ thị phân tử (MAS) trong chọn giống lúa đã có hiệu
quả cao, tuy vậy chọn giống nhờ MAS vẫn phải tuân theo quy luật hỗn gen
(dị hợp tử). Nuôi cấy bao phấn có thể khắc phục điều đó chỉ trong một
năm.[24], [25], [32].
Các nhà khoa học Thái Lan đã sử dụng kết hợp thành công MAS và
phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa để quy tụ gen kháng bạc lá (Xa21) và gen
chịu úng SUB vào gi
ống lúa chất lượng KDML 105 (Khoa Dok Mali). [24]
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học phương pháp nuôi cấy
bao phấn giúp công tác chọn tạo giống lúa đã trở nên thuận lợi hơn, đặc biệt
là đối với các dòng TGMS. Nếu không sử dụng phương pháp nuôi cấy bao
phấn, muốn chọn tạo được một dòng TGMS phải mất rất nhiều thời gian (ít
nhất phải mất 6-7 năm), công sức ngoài đồng ruộng và phải ph
ụ thuộc rất
nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn, các
nhà chọn giống lúa lai có thể tiết kiệm thời gian chọn tạo dòng TGMS từ 2-3
năm trong điều kiện thường [14], kỹ thuật nuôi cấy bao phấn thực sự đã trở
thành công cụ đắc lực của các nhà chọn giống lúa lai [10], [11], [17], [20],
[24], [25], [32], [43].
1.6.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phương pháp nuôi cấ
y bao
phấn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cấy bao phấn cho kết quả rất tốt. Năm 1976, tại Viện
Công nghệ sinh học Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy bao phấn và
thu được kết quả ban đầu. Kỹ thuật này cũng được nghiên cứu và ứng dụng
thành công ở những cơ quan như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện cây
Lương thực, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long. [5], [8], [9], [10], [12]
Năm 1997, các nhà nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp cải tiến quy
trình nuôi cấy bao phấn mới. Quy trình này cho phép nâng cao tỷ lệ tạo mô
sẹo và khả năng tái sinh cây xanh lưỡng bội. [5]

22
Tác giả Đào Hải Lý và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy bao
phấn 3 tổ hợp lai F1 5B, 6B, 7B, xử lý lạnh 2, 4, 6 ngày. Tác giả nhận xét
thấy bao phấn được sử lý lạnh 2-4 ngày cho phản ứng tốt hơn với môi trường
nuôi cấy. Tác giả cũng đưa ra kết luận rằng: Nguồn gen khác nhau sẽ cho
phản ứng khac nhau với môi trường nuôi cấy bao phấn. [10]
Từ năm 1994 đến nay, nhiều công trình nghiên cứu về
nuôi cấy bao phấn
lúa để chọn tạo giống lúa mới. Bằng phương pháp lai tích luỹ kết hợp với
nuôi cấy bao phấn người ta đã có thể cùng một lúc chọn được nhiều tính trạng
khác nhau như: dòng chất lượng cao, chịu mặn, chịu hạn, chịu rét [8] để tạo
nguồn vật liệu mới sử dụng trong chọn tạo giống.
Tác giả Nguyễn Thị Lang và cộng sự tạ
i Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu
Long đã tiến hành nuôi cấy 3 tổ hợp lai: C53/Pokkali, C53/đốc Phụng,
C53/C51 trên môi trường N6. Tác giả thu được 72 dòng lúa đơn bội kép. Qua
đánh giá khả năng chịu mặn và đánh giá bằng chỉ thị phân tử SSR (RM 223),
tác giả đã chọn được 11 dòng triển vọng cho năng suất cá thể cao và có đặc
tính nông sinh học tốt đặc biệt là có khả năng chịu mặn [8]
Năm 2004, Trần Đình Giỏ
i và Vương Đình Tuấn đã lai giống lúa IR64
với các giống lúa mới (new plant type), IR69146-15, IR69146-25, IR68530,
IR70441. Tổ hợp lai IR64/IR69146-25 cho tỷ lệ callus cao nhất (8,85%). Tác
giả khẳng định môi trường N6 có bổ xung 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA cho tỷ
lệ cây tái sinh cao nhất (5,29%).
Các dòng TGMS đơn bội kép được tạo ra có độ di truyền rất ổn định như
dòng TGMS-NC1, TGMS-NC3 [17]. Bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn
các tổ hợp lai F1, các nhà khoa học Việt Nam đã tạo ra nhiều dòng đơn bội
kép cho năng su

ất cao, chất lượng tốt như giống lúa: OM 3007-16-37, OM
3007-42-94, giống lúa AC5 (Viện cây lương thực), Giống lúa SL12 (Viện Di
truyền Nông nghiệp), giống lúa VH1, VH2 của viện Công nghệ sinh học) [9],
[10]

23
Năm 2003, Nguyễn Thị Kim Tiến và cộng sự, đã sử dụng 2 môi trường
N6 và MS để nuôi cấy bao phấn 8 tổ hợp lai F1, bố, mẹ là các giống lúa bản
địa chất lượng cao như DS20, IR68144, Kloong Luang 1, Suphan Buri. Tác
giả đã chọn được 300 dòng lúa đơn bội kép trong đó có một số dòng rất triển
vọng, hơn hẳn bố mẹ về năng suất mà chất lượng gạo ngon. Các tác giả kết
luậ
n: Sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa chất
lượng rất có hiệu quả.
Năm 2005, Các nhà khoa học Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã
kết hợp lai hữu tính và nuôi cấy bao phấn, chọn tạo thành công giống lúa
NC2, PĐ211. [11]

24
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu.
- Vật liệu gồn 9 dòng mẹ ngắn ngày, có đặc tính nông sinh học tốt và 35
dòng bố trong đó có dòng Japonica và các dòng NILS. Một số dòng sử dụng
chính trong thí nghiệm được tập hợp vào bảng 2.1.
Bảng 2.1: Xuất sứ của một số dòng vật liệu chính sử dụng trong nghiên cứu.
STT Dòng bố, mẹ Xuất sứ Mang gen kháng
1 IR24 IRRI
-0-
2 IRBB4 IRRI
Xa4
3 IRBB7 IRRI
Xa7
4 IRBB21 IRRI
Xa21
5 IRBB60 IRRI Xa4+xa5+xa13+Xa21
6 IRBB61 IRRI Xa4+xa5+Xa7
7 IRBB62 IRRI
Xa4,Xa7,Xa21
8 R25
Trung tâm KKN GCT &PBQG
Chưa rõ

9 RT9 Viện CLT và CTP Chưa rõ
10 Pêi ải 64S Trung Quốc (từ DA15) Chưa rõ
11 TGMS-VN1 Viện Di truyền Nông nghiệp Chưa rõ
12 BoS Viện Di truyền Nông nghiệp Chưa rõ
13 DBoS Viện Di truyền Nông nghiệp Chưa rõ
14 TGMS1 Trung tâm KKN GCT &PBQG Chưa rõ
15 TGMS2 Trung tâm KKN GCT &PBQG Chưa rõ
16 TGMS3
Trung tâm KKN GCT &PBQG
Chưa rõ
17 103S Trường ĐH NN Hà Nội Chưa rõ
18 TGMS-H20 Viện CLT và CTP Chưa rõ
- Các nòi vi khuẩn bạc lá: Nòi 3 - (HAU01043), Nòi 9 - (HAU02009-2),
Nòi 19 - (HAU02034-6),

25
- Các cặp mồi SSR liên kết với gen kháng bạc lá Xa4, Xa7, Xa21: MP1-MP2,
P3, pTA248,
- Các cặp mồi liên kết với gen S
5
n: RM225, RM253
- Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi liên kết với các gen chính sử dụng trong PCR
nghiên cứu chọn tạo
KH mồi Gen Trình tự mồi
P3 Xa7
F5
’

cagcaattcactggagtagtggtt 3
’

R5
’
catcacggtcaccgccatatcgga 3
’
pTA248 Xa21
F: 5’agacgcggaagggtggttcccgga3’
R: 5’agacgcggtaatcgaaagatgaaa3’
MP1-MP2 Xa4
F: 5’ atcgatcgatcttcacgagg3’
R: 5’gtgctataaaaggcattcggg3’
RM225 S
5
n
F: 5’tgcccatatggtctggatg3’
R: 5’gaagtggatcaggaaggc3’
RM253 S
5
n
F: 5’tccttcaagagtgcaaaacc3’
R: 5’gcattgtcatgtcgaagc3’
2.2. Nội dung nghiên cứu.
Nội dung 1: Thu thập và đánh giá vật liệu bằng phương pháp thông thường
và bằng chỉ thị phân tử, sàng lọc chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng
bạc lá và gen tương hợp rộng.

Nội dung 2: Chọn tạo dòng bố, mẹ (TGMS) lúa lai hai dòng mang gen kháng
bệnh bạc lá và gen tương hợp rộng.

Nội dung 3: Tìm tổ hợp lai ngắn ngày, năng suất cao, chất lượng tốt, kháng
b
ệnh bạc lá.
Nội dung 4: Nghiên cứu công nghệ sản xuất hạt lai và trình diễn tổ hợp lai có
triển vọng.

26
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1 Phương pháp đánh giá các đặc tính nông sinh học của các dòng
lúa.Theo phương pháp của IRRI (1996)[7]
Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá khảo nghiệm.
- Thời vụ: Vụ Xuân gieo ngày 25 tháng 1 đến 5 tháng 2, vụ Mùa gieo từ 5-
15 tháng 6.
- Thí nghiệm được bố trí bố trí kiểu khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD),
nhắc lại 3 lần, giống đối chứng BTST.
- Diện tích ô thí nghiệm 10 m
2
, mật độ cấy 45 khóm/ m
2
.
+ Bón phân: Lượng phân tổng số bón cho 1 ha: Phân vi sinh, 120 N, 85
P
2
O
5
, 110 K
2
O.
Các tính trạng theo dõi:

- Thời gian sinh trưởng: Tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các
khóm.
- Chiều cao cây: Đo từ mặt đất đến đỉnh bông cao nhất không kể râu
- Chiều dài bông
- Chiều dài cổ bông
- Chiều dài lá đòng
- Dảnh hữu hiệu: Đếm tất cả các bông trong một khóm.
- Tỷ lệ hạt chắc, hạt lép trên bông
- Chiều dài, chiều rộng hạt
- Khối lượng 1000 hạt(g): Phơi khô hạt đạt độ
ẩm 13%.
Số liệu thô của các đặc tính nông sinh học trên được xử lí bằng phần
mềm.
- Màu lá, cách sắp xếp lá
- Khả năng kháng bệnh bạc lá
- Năng suất lý thuyết = Mật độ × Số bông hữu hiệu/khóm × Số hạt chắc/bông
× khối lượng 1000 hạt (g) × 1/100