ứng dụng vi khuẩn methylobacterium sp. trong việc kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành

Báo cáo nghiệm thu

i



SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH


CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16 tháng 8 năm 2010)


ỨNG DỤNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. TRONG
VIỆC KÉO DÀI TUỔI THỌ HOA CẮT CÀNH


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: KIỀU PHƯƠNG NAM
CÁN BỘ THAM GIA: PGS.TS Bùi Văn Lệ; CN. Trần Minh Tuấn; CN. Phan Nguyễn Quang
Hưng; CN. Trần Thị Trinh; CN Nguyễn Ngọc Trinh; CN. Nguyễn Nhữ; CN. Lại Trịnh Anh Khoa
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ


THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 9/ 2010

Báo cáo nghiệm thu

ii

XÁC NHẬN CHỈNH SỬA BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 16/8/2010)
Tên đề tài: Ứng dụng vi khuẩn Methylobacterium sp. trong việc kéo dài tuổi thọ
hoa cắt cành
Chủ nhiệm đề tài: Kiều Phương Nam
Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
TT

Góp ý của Hội đồng Chỉnh sửa của chủ nhiệm đề tài
Trang
1
Dư về vật liệu, chủng
thí nghiệm
Xóa tên loài vi khuẩn Methylobacterium
extorquens (mục 2.2.1)
15
2
Phương pháp định
lượng protein sai
Hiệu chỉnh phương pháp xác định hàm
lượng protein tổng số (mục 2.3.2)
17
3
Thiếu phương pháp xác
định phytohormone
Bổ sung phương pháp ly trích và xác định
hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội
sinh (mục 2.3.5)
21

4
Chú thích tài liệu tham
khảo thiếu
Bổ sung và chỉnh sửa tài liệu tham khảo
cho thống nhất.

78
5
Chệch mục tiêu. Khó
theo dõi kết quả
Bố cục lại báo cáo để nêu bật vai trò của
vi khuẩn Methylobacterium cũng như theo
nội dung đề tài được duyệt.

6
Bố cục thí nghiệm với
MMS, CMS không
logic
Lược bỏ nội dung thí nghiệm với môi
trường MMS để bố cục thí nghiệm được
hợp lý.
25
7 Thiếu tên latin Bổ sung tên latin cây hoa cẩm chướng 15
8
Chỉ tiêu hàm lượng diệp
lục tố có ý nghĩa gì?
Chú giải mục tiêu xác định hàm lượng
diệp lục tố.
16
9

Thiếu sản phẩm bài báo
giao nộp
Bổ sung bài báo khoa học, tóm tắt công
trình
76
Báo cáo nghiệm thu

iii

10
Thời gian sử dụng chế
phẩm 1 tháng hay 2
tháng
Kết luận lại thời gian sử dụng chế phẩm là
một tháng. 75
11 Điều kiện thí nghiệm Điều kiện cắm hoa 15
12
Định dạng lai cách đánh số bảng biểu,
hình ảnh minh họa.

13
Chỉnh sửa lại hình ảnh minh họa thí
nghiệm ảnh hưởng của bạc nitrate.
46
14
Bổ sung các chú thích về phân hạng kết
quả xử lý thông kê ở các bảng kết quả.

15 Biện luận rõ hơn các kết quả thu được.

CƠ QUAN CH
Ủ

TRÌ

Giám đốc





CH
Ủ

NHI
Ệ
M Đ
Ề

TÀI




Kiều Phương Nam
PH
Ả
N BI
Ệ

N 1




PGS. TS.
Nguyễn Thị Quỳnh
PH
Ả
N BI
Ệ
N 2




TS. Nguyễn Du Sanh
CH
Ủ

T
Ị
CH H
Ộ
I Đ
Ồ
NG

GS. TS Nguyễn Văn Thanh

Báo cáo nghiệm thu

iv

BÁO CÁO NGHIỆM THU
Tên đề tài: Ứng dụng vi khuẩn Methylobacterium sp. trong việc kéo dài tuổi thọ hoa
cắt cành
Chủ nhiệm đề tài: KIỀU PHƯƠNG NAM
Cơ quan công tác: Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Chuyển hóa Sinh học,
Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 10/2007 – 1/2010
Kinh phí được duyệt: 70 triệu đồng
Kinh phí đã cấp: theo TB số : 147 /TB-SKHCN ngày 31/10/2007
Mục tiêu: - Chứng minh tiềm năng sử dụng vi khuẩn Methylobacterium sp. để tạo
chế phẩm có hoạt tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành.
- Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm từ vi khuẩn ứng dụng trong
việc kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành. Hướng tới tạo chế phẩm cho người sử dụng hoa
và phân phối hoa cắt cành.
Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt và hợp đồng đã ký)
Công việc dự kiến
Công việc đã thực
hiện
Xác định: canh trường nuôi cấy vi khuẩn, canh trường loại
bỏ sinh khối hay sinh khối vi khuẩn có hoạt tính kéo dài
tuổi thọ của hoa cúc và hoa cẩm chướng
Đã thực hiện

So sánh sự lão suy của hoa trong điều kiện có bổ sung vi
khuẩn Methylobacterium sp. với các hóa chất khác như:
cytokinine, auxin, AgNO
3
, aspirine, acetaldehyde, 8-
hydroxyquinoline, ethanol theo các chỉ tiêu cảm quan (thời
gian hoa tàn, mầu sắc hoa, hiện tượng thối gốc, rụng cánh,
Đã thực hiện
Báo cáo nghiệm thu

v

rụng lá…).
Phối hợp các thành phần thích hợp để xây dựng công thức
một chế phẩm từ vi khuẩn Methylobacterium sp. có tác
dụng gia tăng tuổi thọ của hoa cắt cành
Đã thực hiện
Xác định các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm: màu sắc
chế phẩm, mùi của chế phẩm, mật độ vi sinh, hàm lượng
các hóa chất bổ sung vào chế phẩm.
Đã thực hiện
Xác định hiệu quả của chế phẩm và tính toán giá thành của
chế phẩm so với chế phẩm đã thương mại hóa trên thị
trường (chế phẩm NH của Trung tâm nghiên cứu khoai tây,
rau và hoa)
Đã thực hiện

Báo cáo nghiệm thu

vi

TÓM TẮT
Sinh khối vi khuẩn Methylobacterium có đặc tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành. Việc
phối hợp sinh khối với các thành phần bổ trợ đã tạo nên chế phẩm có giá thành thấp và
hiệu quả. Chế phẩm bao gồm: sinh khối vi khuẩn Methylobacterium raditolerans H2T
2.1011 tế bào/lít; Đường sucrose 1,5%, AgNO3 35 ppm, GA3 8 ppm có khả năng kéo
dài tuổi thọ hoa cẩm chướng lên 2,5 lần, hoa đồng tiền, hoa hồng, hoa cát tường, hoa
cúc tăng lên khoảng 2 lần so với cắm trong nước máy. Chế phẩm không những gia tăng
tuổi thọ của hoa cắt cành mà còn gia tăng khả năng nở của nụ hoa, hoa nở to, cánh hoa
cứng, màu sắc tươi, cuống hoa cứng và lá vẫn còn xanh. Giá thành chế phẩm khoảng 2
ngàn đồng/15g (pha thành 1 lít dung dịch cắm hoa). Chế phẩm cải tiến có tính chất
tương tự nhưng giảm tính gây ô nhiễm (kim loại năng) do thay thế AgNO3 35 ppm
bằng calcium nitrat 200 ppm và tannic acid 400 ppm.
ABSTRACT
Methylobacterium bacteria biomass is characterized by long product life cut flowers.
The coordination of biomass components should be created off preparations with low
cost and effective. We had developed a bioproduct to prolong the life of cut flower,
which consists of 2.1011 CFU/L of Methylobacterium radiotolerans H2T; 1.5%
sucrose; 35 ppm AgNO3; 8 ppm GA3. This product not only increases the life of
Gerbera and Carnation by 2.5 and 1.6 fold, respectively; but also proliferates flower
blossoming; flower size; color and leaves. As our rough calculating; its price is
approximately 2000 dong/15g. Preparations have improved similar properties but
reduce contaminants (heavy metals) by replacing 35 ppm AgNO3 with 200 ppm
calcium nitrate and 400 ppm tannic acid.
Báo cáo nghiệm thu

vii

MỤC LỤC
MỤC LỤC vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x
DANH MỤC BẢNG xi
DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ - ĐỒ THỊ xiii
DANH MỤC HÌNH xv
MỞ ĐẦU 1
TỔNG QUAN 3
1.1 Hoa cắt cành 3
1.1.1 Hiện tượng lão suy ở thực vật 3
1.1.2 Kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành 5
1.2 Vi khuẩn Methylobacterium 6
1.2.1 Vi khuẩn Methylobacterium trong tự nhiên 7
1.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Methylobacterium 8
1.2.3 Sự tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium và thực vật 10
1.2.4 Giả thuyết về sự phân hủy tiền chất trực tiếp tổng hợp ethylene 12
2 NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP 15
2.1 Thời gian & Địa điểm 15
2.2 Vật liệu 15
2.2.1 Đối tượng thí nghiệm 15
2.2.2 Điều kiện thí nghiệm 15
2.2.3 Môi trường 16
2.2.4 Hóa chất 16
Báo cáo nghiệm thu

viii

2.3 Phương pháp thu nhận kết quả 16
2.3.1 Định lượng hàm lượng diệp lục tố 16
2.3.2 Định lượng protein tổng số 17
2.3.3 Định lượng hàm lượng đường tổng số 19
2.3.4 Phương pháp đánh giá dựa trên cảm quan 20

2.3.5 Ly trích và định lượng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 22
2.4 Bố trí thí nghiệm 25
2.4.1 Khảo sát sự lão suy của hoa cẩm chướng cắt cành trong điều kiện bình
thường (cắm hoa với nước) 25
2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của Methylobacterium sp. 25
2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ trợ cho vi khuẩn Methylobacterium
sp. trong chế phẩm 27
2.4.4 Phối hợp nồng độ carbon, AgNO
3
và sinh khối vi khuẩn Methlobacterium
sp. 32
2.4.5 Khảo sát kết hợp các dạng chế phẩm từ canh trường nuôi khuẩn và các
chất bổ trợ lên việc kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành 33
2.4.6 Cải tiến chế phẩm 1. 34
2.4.7 Thử nghiệm chế phẩm trên các loại hoa cắt cành khác 36
2.4.8 Các thông số kĩ thuật của chế phẩm 37
3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 38
3.1 Khảo sát sự lão suy của hoa cẩm chướng cắt cành trong điều kiện bình thường
(cắm hoa với nước) 38
3.2 Khảo sát ảnh hưởng của Methylobacterium 42
Báo cáo nghiệm thu

ix

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ trợ cho vi khuẩn Methylobacterium sp.
trong chế phẩm 44
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của AgNO
3
44
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của Aspirin 46

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của Javel 48
3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của Ethanol 50
3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của Acetaldehyde 52
3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của GA
3
54
3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của NAA 56
3.3.8 Khảo sát ảnh hưởng của BA 58
3.4 Phối hợp nồng độ carbon, AgNO
3
và vi khuẩn tối ưu 60
3.5 Khảo sát kết hợp các dạng chế phẩm 63
3.6 Cải tiến chế phẩm 1. 67
3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của Calcium nitrate 67
3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của Tannic acid 68
3.6.3 Khảo sát khả năng thay thế AgNO
3
trong chế phẩm CP1 bởi Tannic acid
và Calcium Nitrate 70
3.7 Thử nghiệm chế phẩm trên các loại hoa cắt cành khác 71
3.8 Các thông số kĩ thuật của chế phẩm 73
3.9 Kết luận 76
3.10 Đề nghị 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
Báo cáo nghiệm thu

x


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
ACO ACC oxidase
ACS 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase
IAA indole-3-acetic acid
IPA isopentenyladenosine
PPFM Pink-Pigmented Facultative Methylotrophic bacteria
SAM S-adenosyl methionine
STS Silver Thiosulfate
Báo cáo nghiệm thu

xi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng mô tả dựng đường chuẩn 18
Bảng 2.2. Khảo sát sự tương quan giữa OD
530nm
và nồng độ IAA (mg/l) 23
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm 2.4.4 33
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.5 34
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của dịch A lên tuổi thọ của hoa cẩm chướng 42
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dịch B lên tuổi thọ của hoa cẩm chướng 42
Bảng 3.3. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ dịch A
43
Bảng 3.4. Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong AgNO
3
khi hoa đối
chứng tàn 44
Bảng 3.5. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức AgNO

3
44
Bảng 3.6. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Aspirin 46
Bảng 3.7. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ Aspirin
tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 47
Bảng 3.8. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Javel 48
Bảng 3.9. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ Javel
tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 49
Bảng 3.10. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Ethanol 50
Bảng 3.11. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ
Ethanol tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 51
Bảng 3.12. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Acetaldehyde 52
Bảng 3.13. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ
Ethanol tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 53
Báo cáo nghiệm thu

xii

Bảng 3.14. Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong GA
3
khi hoa đối
chứng tàn 54
Bảng 3.15. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức GA
3
55
Bảng 3.16. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức NAA 56
Bảng 3.17. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ NAA
tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 57
Bảng 3.18. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức BA 58
Bảng 3.19. Hàm lượng Chlorophyll, đường, protein, phytohormone của nồng độ BA

tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn 59
Bảng 3.20. Kết quả tính điểm theo cảm quan của thí nghiệm phối hợp nồng độ carbon,
AgNO
3
và vi khuẩn tối ưu 60
Bảng 3.21. Hàm lượng Chlorophyll, đường, protein tại thời điểm đối chứng tàn 61
Bảng 3.22. Kết quả tính điểm theo cảm quan của thí nghiệm phối hợp các dạng chế
phẩm từ sinh khối vi khuẩn và các chất bỗ trợ. 63
Bảng 3.23. Hàm lượng Chlorophyll, đường, protein của chế phẩm tối ưu so với đối
chứng tại thời điểm đối chứng tàn 63
Bảng 3.24. Số lượng tế bào vi khuẩn còn sống ở các phương pháp bảo quản 66
Bảng 3.25. Thành phần chế phẩm 1 66
Bảng 3.26. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Calcium nitrate 67
Bảng 3.27. Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong Calcium nitrate khi
hoa đối chứng tàn 67
Bảng 3.28. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức Tannic acid 68
Bảng 3.29. Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong Tannic acid khi hoa
đối chứng tàn 68
Báo cáo nghiệm thu

xiii

Bảng 3.30. Kết quả tính điểm theo cảm quan của các nghiệm thức CP2 70
Bảng 3.31. Các thông số sinh hóa của hoa cẩm chướng cắm trong các chế phẩm khi
hoa đối chứng tàn 70
Bảng 3.32. Thành phần chế phẩm 2 kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành 74

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ - ĐỒ THỊ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trình ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Ly trích được

thực hiện trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút không khí 23
Sơ đồ 2.2. Các loại dung dịch cắm hoa A, B 26

Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll của hoa cẩm chướng 38
Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi hàm lượng protein của hoa cẩm chướng 38
Biểu đồ 3.3. Sự thay đổi hàm lượng đường của hoa cẩm chướng 39
Biểu đồ 3.4. Sự thay đổi hàm lượng auxin của hoa cẩm chướng 39
Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hàm lượng cytokinin của hoa cẩm chướng 40
Biểu đồ 3.6. Sự thay đổi hàm lượng gibberelin của hoa cẩm chướng 40
Biểu đồ 3.7. Hàm lượng sắc tố, protein và đường của hoa cẩm chướng cắm trong dung
dịch AgNO
3
tại thời điểm đối chứng tàn 45
Biểu đồ 3.8. Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Aspirin khi đối chứng tàn 47
Biểu đồ 3.9. Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Javel khi đối chứng tàn 49
Biểu đồ 3.10. Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Ethanol khi đối chứng tàn . 51
Biểu đồ 3.11. Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Acetaldehyde khi đối chứng
tàn 53
Báo cáo nghiệm thu

xiv

Biểu đồ 3.12. Hàm lượng sắc tố, protein và đường của hoa cẩm chướng cắm trong
dung dịch GA
3
tại thời điểm đối chứng tàn 55
Biểu đồ 3.13. Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức Acetaldehyde khi đối chứng
tàn 56
Biểu đồ 3.14. Hàm lượng Chlorophyll ở các nghiệm thức BA khi đối chứng tàn 58
Biểu đồ 3.15. Hàm lượng chlorophyll ở các nghiệm thức phối hợp nồng độ carbon,

AgNO3 và mật độ vi khuẩn tối ưu tại thời điểm đối chứng tàn (ngày 8) 61
Biểu đồ 3.16. Hàm lượng chlorophyll của hoa cắm trong các dạng chế phẩm tại thời
điểm đối chứng tàn (ngày 8) 64

Đồ thị 3.1. Sự biến đổi lượng vi khuẩn trong chế phẩm theo thời gian 74
Đồ thị 5.1. Tương quan tuyến tính giữa log (N/ml) và OD
610nm
phụ lục 0
Đồ thị 5.2. Tương quan tuyến tính giữa OD
595nm
và nồng độ albumin chuẩn 0
Đồ thị 5.3. Tương quan tuyến tính giữa OD
490nm
và nồng độ albumin chuẩn 1
Báo cáo nghiệm thu

xv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vòng đời của hoa (theo chiều kim đồng hồ) 4
Hình 1.2. Ảnh chụp vi khuẩn Methylobacterium sp. từ kính hiển vi điện tử [26] 7
Hình 1.3. Vi khuẩn Methylobacterium xâm nhiễm vào cây chủ qua khí khẩu [19] 8
Hình 1.4. Tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium sp và cây chủ. 11
Hình 1.5. Mô hình minh họa giả thuyết các bước phức tạp trong việc làm giảm nồng
độ ethylene thực vật và đặc tính khác của vi khuẩn Methylobacterium trong việc kích
thích tăng trưởng thực vật 14
Hình 2.1. Bảng điểm độ tươi của hoa 21
Hình 2.2. Bảng điểm thân và lá Cẩm chướng 21
Hình 3.1. Hoa cẩm chướng lúc còn tươi và lúc tàn 41
Hình 3.2. Mức độ lão suy của hoa trong các nghiệm thức AgNO

3
khi đối chứng tàn . 46
Hình 3.3. Mức độ lão suy của hoa trong dung dịch Aspirin 400 và 1000 ppm khi đối
chứng tàn 47
Hình 3.4. Mức độ lão suy của hoa trong dung dịch Javel 1:5 và 1:10 khi đối chứng
tàn. 49
Hình 3.5. Mức độ lão suy của hoa trong dung dịch Ethanol 0,6% và 1,0% khi đối
chứng tàn 51
Hình 3.6. Mức độ lão suy của hoa trong Acetaldehyde 4,5 % và 2,5% khi đối chứng
tàn 53
Báo cáo nghiệm thu

xvi

Hình 3.7. Mức độ lão suy của hoa trong NAA 10 ppm khi đối chứng tàn 57
Hình 3.8. Mức độ lão suy của hoa trong BA 6 ppm và 10 ppm khi đối chứng tàn 59
Hình 3.9. Tình trạng hoa cẩm chướng trong dung dịch S1,5; E1 và G1 61
Hình 3.10. Tình trạng hoa cẩm chướng cắm trong các dung dịch SK-ESG, ESG, SK-
ASG, ASG và nước cất sau 8 ngày 64
Hình 3.11. Mức độ lão suy của hoa trong các nghiệm thức Tannic acid khi đối chứng
tàn 69
Hình 3.12. Hoa cẩm chướng cắm trong chế phẩm CP1 và CP2 71
Hình 3.13. Hoa đồng tiền cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 8 ngày 72
Hình 3.14. Hoa cúc cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 10 ngày 72
Hình 3.15. Hoa hồng cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 6 ngày 73
Hình 3.16. Hoa Cát tường cắm trong nước cất (đối chứng) và CP2 sau 6 ngày 73

Báo cáo nghiệm thu

1

MỞ ĐẦU
Ngành công nghiệp hoa cắt cành là một ngành công nghiệp năng động và đa dạng.
Những thử thách khác nhau trong cuộc cạnh tranh về nguồn giống, kĩ thuật sản xuất
cũng như thị trường tiêu thụ hoa đã tạo nên một “ngành công nghiệp đầy màu sắc” diễn
ra bên cạnh các ngành công nghiệp truyền thống khác. Hiện nay, nhu cầu tiêu thụ hoa
tươi đang ngày càng nâng cao, và đi đầu trong ngành công nghiệp này đó chính là các
nước: Hà Lan, Mỹ, Mexico, Colombia, Ecuador, Kenya… Tình hình phát triển ngành
công nghiệp hoa cắt cành của Việt Nam đang có dấu hiệu phát triển rõ rệt, doanh thu từ
việc xuất khẩu hoa tăng liên tục theo từng năm, từ 5,3 triệu USD năm 2004 lên 13 triệu
USD năm 2007, 8,4 triệu USD trong 8 tháng đầu năm 2008; thị trường tiêu thụ chủ yếu
là Nhật, Trung Quốc và một số nước Châu Âu. Tuy nhiên, các thị trường trên đòi hỏi
ngày càng cao về chất lượng, mẫu mã Do đó, yêu cầu cần thiết để hoa cắt cành Việt
Nam có thể cạnh tranh được với các nước khác đó chính là cải tiến chất lượng hoa cắt
cành, giảm giá thành sản phẩm. Để đáp ứng được nhu cầu của thị trường cũng như
nâng cao khả năng cạnh tranh với các nước khác, công tác xử lý trước và sau thu hoạch
cần được tập trung vì nó quyết định chất lượng của hoa thành phẩm [39].
Một số nghiên cứu về sinh lý hoa khi bảo quản cũng như các phương pháp bảo quản và
các phương thức gia tăng tuổi thọ hoa cắt cành đã được công bố. Trong đó, một số tác
giả đã thành công trong việc xây dựng quy trình bảo quản nhiều loại hoa cắt cành như
hồng, cẩm chướng, layơn [1]. Để cải thiện chất lượng hoa cũng như tuổi thọ hoa cắt
cành, hiện nay người ta sử dụng các khoáng chất ở dạng dung dịch để bổ sung vào dịch
cắm hoa [2], [38], [39].
Một số nghiên cứu ở Việt Nam đề cập đến vi khuẩn hiếu khí sắc tố hồng và dinh dưỡng
methyl tùy ý, gọi tắt là PPFM (Pink-Pigmented Facultative Methylotrophic bacteria),
được xếp vào chi Methylobacterium. Đây là loài thường sống trên bề mặt lá cây và có
nhiều hoạt tính sinh học. Nghiên cứu gần đây cho thấy PPFM và một số vi khuẩn dinh

dưỡng methyl khác (Methylomonas methanica, Methylovorus may) có chứa 1-
aminocyclopropan-1carboxylate (ACC deaminase) một enzyme phân cắt tiền chất
Báo cáo nghiệm thu

2

trung gian trong quá trình sinh tổng hợp ethylene, và khả năng tổng hợp cytokinin,
giberrelin, auxin [18], [24]; hơn thế nữa, việc phun PPFM lên cây trồng sẽ làm tăng
năng suất cây trồng [40]. Từ các bằng chứng về mối tương tác giữa các chủng PPFM
và cây chủ, và chiến lược phát triển ngành công nghệ hoa cắt cành của Việt Nam,
chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“ỨNG DỤNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. TRONG VIỆC KÉO
DÀI TUỔI THỌ HOA CẮT CÀNH”
Nhằm vào các mục tiêu sau:
- Chứng minh tiềm năng sử dụng vi khuẩn Methylobacterium sp. để tạo chế phẩm có
hoạt tính kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành.
- Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm từ vi khuẩn ứng dụng trong việc kéo dài
tuổi thọ của hoa cắt cành. Hướng tới tạo chế phẩm cho người sử dụng hoa và phân phối
hoa cắt cành.
Báo cáo nghiệm thu

3

TỔNG QUAN
1.1 Hoa cắt cành
Hoa cắt cành là một phần của cây, mang đặc tính của một phát hoa và không
bao gồm rễ cũng như đất trồng. Chúng thường nhanh chóng hỏng vì chỉ có thể duy trì
thời gian sống ngắn; quá trình duy trì sự sống này chủ yếu bằng cách hút nước thông
qua thân.
Các phương pháp sản xuất hoa chủ yếu phụ thuộc vào điều kiện môi trường

của khu vực trồng và nhu cầu chất lượng. Năm 2007, diện tích trồng hoa ở Hoa Kỳ
xấp xỉ 46 triệu m
2
, và sau đó mở rộng ra gấp 10 lần và đến nay đã hơn 80 triệu m
2
.
Việc chấm điểm hoa cắt cành thường được thực hiện để đảm bảo các tiêu chuẩn nhất
quán. Thân thường dài từ 50 – 55 cm cho hầu hết các loại hoa và được cắt ngắn bỏ
những phần thân bị hỏng, những hoa trong tình trạng bệnh hoặc già. Việc phân loại
bằng máy có thể tính điểm cho hoa theo chiều dài thân, tuy nhiên tất cả các yếu tố đó
vẫn phải do con người quyết định. Những cây hoa cúc được tính theo chùm 250 đến
340 g chứa cả thân, ngoài ra hoa cúc tiêu chuẩn cần có kích thước đồng đều. Hoa sau
đó được bọc kín bằng nilon trong điều kiện nhiệt độ thấp, độ ẩm 98% và được vận
chuyển đến trung tâm phân phối [29].
1.1.1 Hiện tượng lão suy ở thực vật
Lão suy là một quá trình tự nhiên có thể coi như một sự phân hóa cuối cùng và
có thể là hoàn toàn nội sinh của thực vật do di truyền quyết định. Ở thực vật, khi hoàn
thành chu trình phát triển (sản xuất hột chứa phôi) sẽ vào trạng thái lão suy và chết
(cây hàng năm), hay tiếp tục sản xuất trái và hạt trong nhiều năm nữa (cây lâu năm)
[1], [37].
Lão suy là giai đoạn sống sau cùng của thực vật, bao gồm một chuỗi sự kiện
bình thường không thể đảo ngược dẫn đến sự phá hủy tổ chức tế bào và sự chết của
thực vật [1]. Các biểu hiện rõ nhất của sự lão suy là sự mất khả năng phân chia tế bào,
sự giảm hàm lượng RNA do tăng cường độ các quá trình phân giải và ngừng tổng hợp
chúng, các biến đổi về protein và diệp lục tố (ở lá). Song song với sự biến đổi đó,
Báo cáo nghiệm thu

4

cường độ quang hợp và cường độ hô hấp giảm sút nhanh chóng. Đặc biệt sự cân bằng

phytohormone thay đổi nhanh theo hướng làm tăng hàm lượng abscisic acid, ethylene
và giảm hàm lượng các chất tăng trưởng đặc biệt là cytokinin. Abscisic acid được xem
là nhân tố hóa già. Cùng với ethylene, abscisic acid được hình thành nhanh chóng khi
có những biểu hiện cảm ứng sự hóa già và sự rụng như thiếu nước, thiếu chất dinh
dưỡng, quang chu kỳ không thuận lợi. Đối kháng với abscisic acid và ethylene trong sự
hóa già là cytokinin. Cytokinin lại kích thích quá trình tổng hợp chlorophyll, nucleic
acid và protein, kích thích quá trình phân chia tế bào, kéo dài tuổi thọ của hoa, lá Vì
vậy, có thể xem cytokinin là nhân tố trẻ hóa trong thực vật. Auxin và gibberellin cũng
có tác dụng kiềm hãm sự lão suy. Trong một số trường hợp, chúng được sử dụng để
kìm hãm sự lão suy của cam chanh [11].

Hình 0.1. Vòng đời của hoa (theo chiều kim đồng hồ)
Mốc đánh dấu kết thúc đời sống của hoa cắt cành là khi hoa đi vào tình trạng lão
suy và bắt đầu tàn. Điều này đặc biệt đúng với hoa hồng: khi cắt cành, hoa thường
không nở, gãy cổ và héo cánh rất sớm so với hoa còn trên cây. Ở hoa cẩm chướng, sự
Báo cáo nghiệm thu

5

héo rũ của cánh hoa đi kèm với sự giảm hấp thu nước, mặc dù không có sự cản trở vận
chuyển của bó mạch nhưng cánh hoa vẫn mất khả năng hấp thu nước [8].
1.1.2 Kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành
Các sản phẩm kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành đều chứa hoạt chất diệt khuẩn để
ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật. Các sản phẩm hydrate hóa dễ dàng được hấp
thụ vào thân cây, dịch hòa tan có pH từ 3,0 – 3,5 sẽ giúp cây hút nước tốt hơn. Dung
dịch giữ hoa thường có thành phần đường cung cấp năng lượng cần thiết để hoa tiếp
tục nở. Ánh sáng có thể gia tăng chất lượng cũng như tuổi thọ của hoa cắt cành. Thông
thường hoa cắt cành được xử lý cắm đứng trong dung dịch trong thời gian ngắn,
thường ít hơn 24 giờ ở nhiệt độ thấp, sau đó được vận chuyển đi. Hiện nay, mối quan
tâm đến công tác bảo quản hoa cắt cành, đặc biệt là hoa cẩm chướng đã được nhiều

công trình nghiên cứu công bố. STS là một trong những chất được sử dụng rộng rãi
trong việc bảo quản hoa cẩm chướng thương mại, mục đích làm kéo dài thời gian sống
của hoa cẩm chướng cắt cành sau khi thu họach. STS là một tác nhân gây ức chế hoạt
động của ethylene, làm chậm sự lão suy nhanh chóng của hoa. Tuy nhiên, điều lo lắng
của các nhà nghiên cứu hiện nay chính là vấn đề ô nhiễm môi trường do kim loại nặng
bởi các chất thải STS được đưa ra môi trường ngày càng gia tăng trong những năm gần
đây, điều đó đòi hỏi phải phát triển một chất thay thế khác. Takashi Onozaki và cộng
sự (1998) đã chứng tỏ ảnh hưởng của calcium nitrate kết hợp với AIB (α-
aminoisobutyric acid) để kéo dài tuổi thọ hoa trong điều kiện cắm bình. Trong khi đó
Michalczuk và cộng sự (2001) đã chứng tỏ hiệu quả kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành bằng
việc kết hợp calcium nitrate và tannin. Theo đó, thời gian kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành
có thể gia tăng từ 1,2 đến 1,4 lần so với đối chứng [28], [29], [20], [35].
Ở hoa lan cắt cành, GA
3
, abscisic acid, ABA, indole – 3 – acetic acid có ảnh
hưởng đến mức độ lâu tàn của hoa với các mức độ khác nhau phụ thuộc nổng độ sử
dụng [20]. Đó cũng chính là cơ sở để tìm ra các hoạt chất có thể kết hợp với vi khuẩn
Methylobacterium để tạo ra một sản phẩm kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành có hiệu quả
cao.
Báo cáo nghiệm thu

6

1.2 Vi khuẩn Methylobacterium
Chi Methylobacterium gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng, dinh dưỡng
methyl tùy ý (PPFM – Pink Pigmented Faculatively Methylotrophic). Chúng phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, hiện diện trong nhiều môi trường khác nhau bao gồm: đất, đất
bùn ao hồ, nước sạch, nước mưa, không khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các
loại hạt giống, thực phẩm, mỹ phẩm, môi trường bệnh viện. Một vài loài được tìm thấy
trên băng ở hai cực và trong miệng của bệnh nhân (chủng độc)…Đa số vi khuẩn thuộc

chi Methylobacterium có khả năng sử dụng các hợp chất một carbon như methane,
methanol, formaldehyde, formate…cũng như các hợp chất nhiều carbon làm nguồn
cung cấp năng lượng và nguồn carbon chủ yếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển
[13], [18], [23], [30], [34].
Trong giới vi sinh vật, chi Methylobacterium có vị trí phân loại như sau [18]
Giới : Bacteria
Ngành: Proteobacterium
Lớp : Alphaproteobacteria
Bộ : Rhizobiales
Họ : Methylobacteriaceae
Báo cáo nghiệm thu

7


Hình 0.2. Ảnh chụp vi khuẩn Methylobacterium sp. từ kính hiển vi điện tử [33]
A. Nhóm vi khuẩn Methylobacterium phân lập từ diệp quyển hoa đồng tiền
B. Vi khuẩn Methylobacterium sp.bơi nhờ một roi đơn
C. Vi khuẩn M. extorquens phân lập từ căn quyển hoa đồng tiền
1.2.1 Vi khuẩn Methylobacterium trong tự nhiên
Vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các hợp chất có độc tính đối
với các sinh vật khác nên loài vi khuẩn này có khả năng tồn tại ở nhiều môi trường
khắc nghiệt khác nhau, kể cả trong môi trường chứa muối Ag
+
, một chất diệt khuẩn
mạnh. Vi khuẩn Methylobacterium thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, do vậy chúng
Báo cáo nghiệm thu

8

thường được phân lập từ các nguồn nước sạch chứa oxy hòa tan và các tầng mặt nước
của ao hồ. Chính vì khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau nên
Methylobacterium giữ vai trò quan trọng trong các chu trình carbon trong tự nhiên
đồng thời tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học có giá trị [21].
Đa số các công trình nghiên cứu đều cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn
Methylobacterium sp. trên bề mặt lá, thân của thực vật (như: cây Lolium perenne,
dương xỉ, Phaseolus vulgaris và gần đây là rêu Funaria hygrometrica [14], [22], [21],
[24]. Khi sử dụng các phương pháp lai tại chỗ với các mẫu dò đặc trưng cho chi
Methylobacterium, đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp. có hiện diện bên trong
chồi của cây Thông (Pinus sylvestris) hay nằm bên trong các bó mạch các cây họ Cam
Chanh. Gần đây chúng còn được ghi nhận trên nhụy và rễ cây hướng dương [22], [31],
[33].

Hình 0.3. Vi khuẩn Methylobacterium xâm nhiễm vào cây chủ qua khí khẩu [26]
1.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Methylobacterium
Hầu hết các vi khuẩn chi Methylobacterium đều có sắc tố hồng, tế bào hình que
(0,8 – 1,0 µm), thường có dạng phân nhánh hoặc một số dạng bất thường khác đặc biệt
thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng tạo nên dạng kết hoa hồng
Báo cáo nghiệm thu

9

(rosettes) [18]. Chúng có khả năng di động nhờ vào một tiêm mao ở cực hay gần cực,
tuy nhiên một số loài lại không có khả năng di động. Đa số các loài vi khuẩn
Methylobacterium sp. là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi. Tế bào của
chúng thường chứa một lượng lớn các thể bắt màu với thuốc nhuộm sudan hay các hạt
volutin. Tuy nhiên một số loài có cấu trúc thành tế bào nhiều lớp và con đường biến
dưỡng citrate đặc trưng của nhóm vi khuẩn Gram âm.
Khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Methylobacterium chậm, khuẩn lạc thường
có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một vài chủng không tăng trưởng được trên môi

trường nutrient agar. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường glycerol – pepton (GP) agar
sau 7 ngày nuôi cấy sẽ có màu từ hồng nhạt đến đỏ cam, trong khi đó trên môi trường
Methanol Mineral Salt (MMS) agar thường có màu hồng nhạt đồng nhất. Ở môi trường
nuôi cấy lắc lỏng tĩnh, vi khuẩn tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt và bám nhiều
vào thành bình lắc, điều này chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp. hầu hết là các
chủng vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Các chủng vi khuẩn này là những vi khuẩn hóa dị
dưỡng, có khả năng tăng trưởng trên môi trường bổ sung formaldehyde (ở nồng độ
thấp), formate và methanol. Tuy nhiên, cũng có một số loài sử dụng được các hợp chất
methylamine, trừ loài M. organophilum là loài duy nhất có khả năng sử dụng methane
làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Ngoài ra, trong một vài điều kiện nuôi cấy
đặc biệt, Green và cộng sự (1992) đã đề cập đến một số loài vi khuẩn
Methylobacterium có khả năng hình thành sắc tố bacteriochlorophyll (màu hơi lục,
tương tự chlorophyll ở thực vật ) [18].
Chu trình serine là phương thức chuyển hóa các hợp chất một carbon của tất cả
các loài vi khuẩn PPFM. Trong đó, sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình
tricarboxylic acid (TCA) sẽ tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử
dụng. Bên cạnh đó, các chu trình này cũng liên kết với chu trình PHB để tạo ra các sản
phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly – β – hydroxybutyrate). Nhiệt độ phát triển tối ưu cho
vi khuẩn Methylobacterium là 30
o
C trong môi trường pH trung tính. Tuy nhiên một số
loài đặc biệt có thể sống ở nhiệt độ cao 37
o
C hoặc thấp 4
o
C, vẫn phát triển ở pH 4 và