Quy trình định lượng clostridium perfringens

QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM
PERFRINGENS
II
II
II
II
IV
IV
I
I
Giới thiệu về
clostridium
perfringens
Quy trình
phân tích
Kết quả
Thiết bị,
Dụng cụ
và môi
trường
Giới thiệu về clostridium perfringens
Giới thiệu về clostridium perfringens

Giới (regnum) Bacteria

Ngành (phylum) Firmicutes

Lớp (class) Clostridia

Bộ (ordo) Clostridiales


Họ (familia) Clostridiaceae

Chi (genus) Clostridium

Loài (species) C. perfringens

Phân loại khoa học
Đặc điểm
Giới thiệu về clostridium perfringens
Giới thiệu về clostridium perfringens
Vi khuẩn Gram
dương
Hình gậy
Kị khí không bắt buộc
Sinh bào tử
Tạo các khuẩn lạc màu đen
trong môi trường phân lập quy
định
Khử nitrate thành nitrite
Không chuyển động
L
ê
n

m
e
n

đ
ư

ờ
n
g


g
l
u
c
o
s
e

v
à

l
a
c
t
o
s
e
,

h
ó
a

l

ỏ
n
g

g
e
l
a
t
i
n
Đ
ô
n
g

t
ụ

s
ữ
a
Đ
ô
n
g

t
ụ

s
ữ
a
Giới thiệu về clostridium perfrigens
Giới thiệu về clostridium perfrigens

Hình thái vi khuẩn Clostridium perfrigens
Tác hại clostridium perfrigens
Tác hại clostridium perfrigens

Tạo ra độc tố gây ra một số bệnh như

Toxin α gây hoại tử sinh hơi

Toxin gây viêm ruột hoại tử

Độc tố ruột gây nhiễm độc thức ăn

Bùn đất, nước cống rãnh
Phân người, phân động
vật
Trong thực phẩm nhất
là thực phẩm đồ hộp

Nơi sống của Clostridium perfrigens
Giới thiệu về clostridium perfringens
Giới thiệu về clostridium perfringens
Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị Dụng cụ

Cân Dao lấy mẫu, pH kế, Erlen
Bể điều nhiệt Que cấy thẳng và que cấy vòng
Nồi tiệt trùng Phiến kính và lam kính
Tủ ấm Ống nghiệm
Thiết bị nuôi cấy kị khí Pipet
Tủ cấy Hộp Petri
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfringens
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfringens

Môi trường thạch Tryptose - Sulfide - Cycloserine (TSC agar)
Tryptose (Difco) 15g
Men thủy phân 5g
Soyton 5g
Sắt ammonium citrat 1g
Natri metabisunfit 1g
Agar 20g
Nước cất 900ml
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfrigens
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfrigens

Môi trường di động nitrat
Cao thịt bò 3 g
Pepton (Difco) 5g
KNO
3
1g
Na
2
HPO
4

2,5g
Thạch 1,0-5g(tùythuộcvàosứcđông
củathạch)
Galactoza 5g
Glyxerol 5g
Nước cất 1lít

Môi trường Iron - Milk cải tiến
Sữa tươi toàn phần
1lít
Sắt sunfat.7H
2
O
1g
Nước cất
50ml
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfringens
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfringens

Môi trường lactoza - gelatin
Peptontừcasein 15,0g
Caonấmmen 10,0g
Lactoza 10,0g
Gelatin 120,0g
Phenolđỏ 0,05g
Nước 1000ml
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfrigens
CácmôitrườngnuôicấyClostridium perfrigens

Môi trường thioglycolat lỏng

Peptontừcasein
15,0g
L-Xystin
0,5g
D-Glucoza
5,5g
Caonấmmen
5,0g
Natriclorua
2,5g
Natrithioglycolat(mercaptoaxetat)
0,5g
Thạch
0,5gđến2,0g
a
Resazurin
0,001g
Nước
1000ml
a
Tùythuộcvàosứcđôngcủathạch.
Môi trường canh thang bào tử (Sporulation broth)
Polypepton 15g
Men thủy phân 3g
Starch, soluble 3g
MgSO
4
khan 0,1g
Natri thioglycolat 1g
Na

2
HPO
4
11g
Nước cất 1lít
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích
10g mẫu + 90ml dung dịch đệm 10
-1
Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10
-2
, 10
-3
,10
-4
…
10g mẫu + 90ml dung dịch đệm 10
-1
Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10
-2
, 10
-3
,10
-4
…
Lấy mỗi nồng độ pha loãng 1ml mẫu vàođĩa(mỗinồngđộ2mẫu), rót khoảng 15-20ml môi trường TSC
ở 45
0
C, xoay đều, đợi đông
Lấy mỗi nồng độ pha loãng 1ml mẫu vàođĩa(mỗinồngđộ2mẫu), rót khoảng 15-20ml môi trường TSC

ở 45
0
C, xoay đều, đợi đông
Đếm tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là Clostridiumperfringens
Đếm tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là Clostridiumperfringens
Phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml môi trường TSC, ủ 37
0
C ±2
0
C, 20-24h trong bình kỵ khí
Phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml môi trường TSC, ủ 37
0
C ±2
0
C, 20-24h trong bình kỵ khí
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình (tròn, lồi, nhẵn, có màu đen) vào môi trường lỏng thioglycolate và môi
trường tạo bào tử nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 35
0
C, 18 – 24h) ta được canh trường thuần
nhất
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình (tròn, lồi, nhẵn, có màu đen) vào môi trường lỏng thioglycolate và môi
trường tạo bào tử nuôi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 35
0
C, 18 – 24h) ta được canh trường thuần
nhất
Từ canh trường thioglycolatelấy
mẫunhuộmgram
Từ canh trường thioglycolatelấy

mẫunhuộmgram
Clostridiumperfringenslàtrựckhuẩnngắn,
bắtmàuvớithuốcnhuộmgram(+)
Clostridiumperfringenslàtrựckhuẩnngắn,
bắtmàuvớithuốcnhuộmgram(+)
Từ canh trường tạobàotửlấymẫu
nhuộmgram
Từ canh trường tạobàotửlấymẫu
nhuộmgram
Trựckhuẩnngắn,đầutròn,giữacókhoảngtrắng
sángkhôngbắtmàuthuốcnhuộm
Trựckhuẩnngắn,đầutròn,giữacókhoảngtrắng
sángkhôngbắtmàuthuốcnhuộm
ThửnghiệmkhảnăngđôngtụsữatrênmôitrườngIron-Milk, thử nghiệm tính di động, thử nghiệm
khả năng khử nitrate, lên men lactose, sinh acid, khí, khả năng hóa lỏng gelatin
ThửnghiệmkhảnăngđôngtụsữatrênmôitrườngIron-Milk, thử nghiệm tính di động, thử nghiệm
khả năng khử nitrate, lên men lactose, sinh acid, khí, khả năng hóa lỏng gelatin
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc màu đen ở môi trường TSC, không di động, trực khuẩn ngắn,
gram (+), có khả năng sinh bào tử, làm đông tụ canh trường Iron-Milk, khử nitrate thành nitrite,
sinh acid và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin được coi là Clostridium perfringers
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc màu đen ở môi trường TSC, không di động, trực khuẩn ngắn,
gram (+), có khả năng sinh bào tử, làm đông tụ canh trường Iron-Milk, khử nitrate thành nitrite,
sinh acid và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin được coi là Clostridium perfringers
Thử nghiệm sinh hóa các khuẩn lạc điển hình
Thử nghiệm sinh hóa các khuẩn lạc điển hình
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích


Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình
Lấy1mlcanhtrườngthuầnnhấtchovàoốngnghiệmchứamôitrườngIron-Milk
Đặt ống nghiệm vào bể điều nhiệt ở 46
0
Cvàủtrong2giờ
C.perfringenslàmđôngsữanhanhởđáyốngnghiệmvàtạoralớpnhũtươngở
trên

Thử nghiệm khả năng đông tụ sữa trên môi trường Iron - Milk
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích

Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

Thử nghiệm tính di động
Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc sang môi trường nitrat để thử tính di động
Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 24 h
Kiểm tra ống môi trường để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu
Nếu nó mọc dọc theo đường cấy đâm sâu mà không phát triển lan rộng vào môi trường cách
xa đường cấy đâm sâu => không di động
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích

Thử sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

Thử nghiệm khả năng khử nitrate thành nitrite
Lấy từ 0,2 ml đến 0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrite
Cho vào mỗi ống môi trường nitrate di động (tiến hành trong tủ HOP)
Sự hình thành màu đỏ khẳng định sự khử nitrate thành nitrite. Nếu màu đỏ không hình
thành trong 15 phút, thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút. Nếu màu đỏ hình

thành sau khi thêm bụi kẽm thì không xảy ra sự khử nitrate thành nitrite
Quy trình phân tích
Quy trình phân tích

Thử nghiệm sinh hóa các khuẩn lạc điển hình

Xác định khả năng hóa lỏng gelatin
Cấy các khuẩn lạc đã phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường gelatin – lactose
Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 24h
Nếu có sinh khí và có xuất hiện màu vàng (do hình thành axit) cho thấy sự lên men lactoza
Làm lạnh 1h ở 5
o
C và kiểm tra sự hóa lỏng gelatin. Nếu môi trường đã đông đặc thì ủ lại thêm 24h để
kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin
Kết quả
Kết quả

Nếu nhiều hơn hoặc bằng 80% số khuẩn lạc điển hình đếm được xác định là
clostridium perfringens
thì toàn bộ số khuẩn lạc đếm được được coi là
clostridium
perfringens.

Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc màu đen ở môi trường TSC, không di động, trực khuẩn ngắn,
gram (+) có khả năng sinh bào tử, Làm đông tụ canh trường Iron-Milk, khử nitrate thành
nitrite, sinh acid và khí từ lactose, hóa lỏng gelatin được coi là Clostridium perfringers
Kết quả
Kết quả
Số khuẩn lạc Clostridium perfringens trên 1g mẫu:
Trong đó:

•
a: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch 1 ở cùng nồng độ
•
b: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch 2 ở cùng nồng độ
•
n: số lượng đĩa đếm
•
f: độ pha loãng tương ứng
•
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa
•
R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ gữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ
•

Kết quả
Kết quả
Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch
- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 32 khuẩn lạc
- Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 38 khuẩn lạc

=> Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm có 31,5. 10
4
vi khuẩn
C.perfringens
•
Tính số tế bào Clostridium perfringens trên 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc đếm được ở 10
-4
là 70 và có
9 trong 10 khuẩn lạc được chọn được xác nhận là Clostridium perfringens khi kiểm tra bằng phản ứng
sinh hoá => R =

•


Ví dụ
Tài liệu tham khảo
Tài liệu tham khảo
1. TCVN 4991-2005
2. Lê Văn Việt Mẫn, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh, năm
2010
3. http://
thuvienphapluat.vn/archive/Quyet-dinh/Quyet-dinh-3348-2001-QD-BYT-Thuong-quy-ky-thuat-dinh-luong-Clostridium
-perfringens-trong-thuc-pham-vb69974t17.aspx
4. />-25023
/
5. />