Báo cáo khoa học Tạo kháng nguyên bề mặt của hbv (hepatitis b virus) bằng kỹ thuật gen và tạo kháng thể đa tròng

ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HỒ CHÍ MINH
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ



BÁO CÁO NGHIỆM THU


Đề tài :


TẠO KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA
HBV (HEPATITIS B VIRUS)
BẰNG KỸ THUẬT GEN
VÀ TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG












Cơ quan chủ trì: HỘI SINH HỌC TP.HCM


Chủ nhiệm đề tài

: PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC



TP. HCM 6/2008

1
PHẦN I.

TÓM TẮT THÔNG TIN- MỤC TIÊU - NỘI DUNG ĐĂNG KÝ

1. Tên đề tài:
Tạo kháng nguyên bề mặt của HBV (Hepatitis B virus) bằng kỹ thuật gen
và tạo kháng thể đa dòng

2. Tên chủ nhiệm đề tài:
TRẦN LINH THƯỚC, PGS.TS
Đòa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q. 5, TP. Hồ Chí Minh
ĐT: 8308557 (CQ) / 9316262 (NR) / Fax: 8308557 / Mobile: 0913-901644
E-mail: ;


3. Đơn vò chủ trì đề tài:
HỘI SINH HỌC TP.HCM (LIÊN HIỆP CÁC HỘI KH&KT TP.HCM)

4. Danh sách cán bộ trực tiếp tham gia đề tài:
TT Họ và Tên Học vò Cơ quan công tác

1 Nguyễn Lê Trang TSKH/PGS Viện Pasteur TP.HCM
3 Đặng T. Phương Thảo ThS Trường ĐH KHTN

3 Huỳnh Ngọc Vi Ca Học viên cao học Trường ĐH KHTN
4 Đặng Trần Hiền Thảo SV Trường ĐH KHTN
5 Lê Thái Hoàng SV Trường ĐH KHTN
6 Nguyễn Thò Huỳnh Nga SV

5. Mục tiêu đề tài
Mục tiêu của đề tài này là ứng dụng kỹ thuật gen để tạo kháng nguyên bề
mặt của vi rút HBV gây bệnh viêm gan siêu vi B, sản xuất kháng thể đa dòng đặc
hiệu ở quy mô phòng thí nghiệm.

6. Nội dung đăng ký

6.1. Tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS
1
hoặc PreS
2
của HBV
- Thu nhận đoạn gen mã hóa kháng nguyên từ máu bệnh nhân viêm gan siêu
vi B bằng phản ứng PCR.
- Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên trong E. coli (dòng hóa gen vào vectơ
tạo dòng, biến nạp vào E. coli, chọn lọc và kiểm tra dòng E. coli mang gen mục
tiêu);

2
- Tái tạo dòng trong E. coli (tái tạo dòng gen đã thu nhận vào vectơ biểu
hiện, biến nạp vào E. coli, chọn lọc và kiểm tra dòng E. coli mang gen mục tiêu)

6.2. Biểu hiện và tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp
- Biểu hiện kháng nguyên và kiểm chứng (điện di SDS-PAGE, lai miễn
dòch).

- Tinh chế kháng nguyên bằng sắc ký ái lực chuyên biệt.

6.3. Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên
- Gây miễn dòch chuột hoặc bằng kháng nguyên tái tổ hợp.
- Thu nhận kháng thể đa dòng IgG.
- Tinh chế IgG bằng sắc ký ái lực chuyên biệt.

6.4. Đánh giá kháng thể: hiệu giá, độ đặc hiệu

7. Thời gian, kinh phí và tiến độ thực hiện

7.1. Thời gian và kinh phí
- Thời gian: 24 tháng, từ 11/2004 – 10/2006
- Kinh phí: 180 triệu đồng

7.2. Tiến độ thực thiện các nội dung và sản phẩm
- Giai đoạn I
Từ tháng 11/2004 đến tháng 10/2005 - Kinh phí 120.000.000đ

TT Tóm tắt nội dung Sản phẩm cần đạt
1 Thu nhận gen mã hóa Pre-S
1
(hoặc PreS
2
) từ
máu bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng PCR
Gen mã hóa Pre-S
1
(hoặc
PreS

2
)
2 Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên trong E.
coli
Các vector mang gen mã
hóa kháng nguyên
3 Tái tạo dòng trong E. coli Dòng E. coli mang gen
mục tiêu
4 Biều hiện kháng nguyên mục tiêu và kiểm
chứng
Kết quả điện di SDS-
PAGE, lai miễn dòch
5 Tinh chế kháng nguyên bằng sắc ký ái lực Kháng nguyên tinh chế
6 Báo cáo sơ kết giai đoạn I Báo cáo kết quả

- Giai đoạn II
Từ tháng 11/2005 đến tháng 10/2006 - Kinh phí 60.000.000đ

TT Tóm tắt nội dung Sản phẩm cần đạt
1 Gây miễn dòch chuột/thỏ bằng kháng nguyên Chuột/thỏ đáp ứng miễn

3
tái tổ hợp dòch
2 Xác nhận hiệu giá kháng thể bằng phản ứng
tủa và ELISA
Kết quả đánh giá
3 Thu nhận IgG, tinh chế Kháng thể đa dòng tinh
chế
4 Báo cáo nghiệm thu Báo cáo kết quả

4
PHẦN II.
TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯC CỦA ĐỀ TÀI

1. CÁC NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN

1.1. Tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS
1
hoặc PreS
2
của
HBV
Đã tiến hành tạo dòng bằng 4 phương án khác nhau và thu được 4 dòng E.
coli mang vector biểu hiện kháng nguyên bề mặt:
- Dòng E. coli BL21(DE3)/pET-PreS
1
mang vector tái tổ hợp pET-PreS
1
có
thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS
1
ở dạng dung hợp 6XHis-
PreS
1
.
- Dòng E. coli BL21(DE3)/pGEX-PreS
1
mang vector tái tổ hợp pGEX-PreS

1
có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS
1
ở dạng dung hợp GST-
PreS
1
.
- Dòng E. coli BL21(DE3 plysS)/pGEX-PreS
2
26 mang vector tái tổ hợp
pGEX- PreS
2
26

có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS
2
26 ở dạng
dung hợp GST-PreS
2
26. PreS
2
26 là kháng nguyên tái tổ hợp chỉ chứa 26 axít amin
đầu tiên của PreS
2
.
- Dòng E. coli BL21(DE3)/pET-PreS
1
-S
2
26 mang vector tái tổ hợp pET-

PreS
1
-S
2
26 có thể biểu hiện kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp PreS
1
-S
2
26 ở dạng
dung hợp 6XHis-PreS
1
-S
2
26. PreS
1
-S
2
26 là kháng nguyên tái tổ hợp bao gồm
PreS
1
và 26 axít amin đầu tiên của PreS
2
.

1.2. Biểu hiện và tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp

1.2.1. Biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp
- Đã cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp bằng IPTG ở 4 dòng E. coli
thu nhận được (BL21(DE3)/pET-PreS
1

, BL21(DE3)/pGEX-PreS
1
, BL21(DE3
plysS) /pGEX-PreS
2
26 và BL21(DE3)/pET-PreS
1
-S
2
26)
- Chứng minh sự biểu hiện của 4 kháng nguyên tái tổ hợp bằng điện di SDS-
PAGE và lai Western blot 6XHis-PreS
1
, GST- PreS
2
26

1.2.2. Tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp
Đã tiến hành tinh chế 3 kháng nguyên tái tổ hợp:
- Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS
1
được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực
chuyên biệt Ni-NTA agarose.
- Kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS
2
26 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực
chuyên biệt Glutathione sepharose.
- Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS
1
-S

2
26 được tinh chế bằng cột sắc ký
ái lực chuyên biệt Ni-NTA agarose.

5


1.3. Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên
Đã tiến hành gây đáp ứng miễn dòch trên chuột và thu nhận kháng thể đa
dòng bằng cách sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS
1
-S
2
26 tinh chế.
- Sử dụng phương pháp ELISA đã chứng minh được rằng ở độ pha loãng
kháng 1/25.600, kháng huyết thanh chuột vẫn nhận diện và gắn vào kháng
nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS
1
-S
2
26.
- Đã tinh chế kháng thể đa dòng từ kháng huyết thành chuột kháng 6XHis-
PreS
1
-S
2
26 (sử dụng cột sắc ký ái lực chuyên biệt Protein G Sepharose).

1.4. Đánh giá hiệu giá, độ đặc hiệu của kháng thể
Đã kiểm chứng tính đặc hiệu của kháng thể nhận được dựa trên khả năng

nhận biết và gắn lên kháng nguyên bề mặt của virút HBV bằng phương pháp
Sandwich ELISA.

2. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI THEO NỘI DUNG ĐÃ ĐĂNG KÝ

TT Nội dung đăng ký Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt được
1 Thu nhận gen mã hóa
kháng nguyên Pre-S
1

(hoặc PreS
2
)
Gen mã hóa Pre-S
1

(hoặc PreS
2
)
4 gen mã hóa 4 kháng nguyên:
- Pre-S
1
- PreS
2
-S (kháng nguyên M)
- PreS
2
-S
- PreS
1

-S
2
26
2 Tạo dòng gen mã hóa
kháng nguyên trong E.
coli
Các vector mang gen
mã hóa kháng
nguyên
4 vector pBlueScript tái tổ hợp
gen mã hóa kháng nguyên:
- pBlue-PreS
1
- pBlue-PreS
2
-S
- pBlue-PreS
2
-S
- pBlue-PreS
1
-S
2
26
3 Tái tạo dòng trong E.
coli
Dòng E. coli mang
gen mục tiêu
4 dòng E. coli mang gen mã hóa
k

háng nguyên:
- BL21(DE3)/pET-PreS
1
- BL21(DE3)/pGEX-PreS
1
- BL21(DE3 plysS)/pGEX-
P
reS
2
26
- BL21(DE3)/pET-PreS
1
-S
2
26
4 Biều hiện kháng
nguyên mục tiêu và
kiểm chứng
Kết quả điện di SDS-
PAGE, lai miễn dòch
Biểu hiện kháng nguyên và kiểm
chứng bằng SDS-PAGE, lai
Western ở 4 dòng E. coli
5 Tinh chế kháng
nguyên bằng sắc ký ái
Kháng nguyên tinh
chế
3 kháng nguyên tái tổ hợp tinh
chế:

6
lực - 6XHis-PreS
1

- GST-PreS
2
26
- 6XHis-PreS
1
-S
2
26
6 Gây miễn dòch
chuột/thỏ bằng kháng
nguyên tái tổ hợp
Chuột/thỏ đáp ứng
miễn dòch
Gây đáp ứng miễn dòch chuột
bằng kháng nguyên 6XHis-PreS
1
-
S
2
26
7 Xác nhận hiệu giá
kháng thể bằng phản
ứng tủa và ELISA
Kết quả đánh giá - Xác nhận hiệu giá kháng thể
bằng phương pháp ELISA
- Xác nhận tính đặc hiệu của

kháng thể bằng phương pháp
Sandwich ELISA
8 Thu nhận IgG, tinh chế Kháng thể đa dòng
tinh chế
Kháng thể đa dòng kháng 6XHis-
PreS
1
-S
2
26


3. SẢN PHẨM KHÁC
- Kết quả đào tạo đại học và sau đại học:
+ 03 khóa luận tốt nghiệp đại học
* Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên PreS
1
của virus
viêm gan siêu vi B - Hepatitis B virus (HBV) trong E . coli; Trần Đặng Hiền Thảo,
2004.
* Tạo dòng & biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên PreS
2
của virus
viêm gan siêu vi B - Hepatitis B virus (HBV) trong E . coli; Lê Thái Hoàng, 2004.
* Tinh chế và khảo sát tính miễn dòch nguyên của protein tái tổ hợp
PreS
1
S
2
26 của virus gây bệnh viêm gan siêu vi B (HBV), Nguyễn Thò Huỳnh Nga,

2006.
+ 01 luận văn thạc só:
* Tạo kháng nguyên tái tổ hợp, kháng thể đa dòng để ứng dụng
trong chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B, Huỳnh Ngọc Vi Ca, 2006.
- Bài báo công bố: 01
* Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa đoạn peptide PreS
2
26 của virus
gây bệnh viêm gan B trong E. coli, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 149-155, 2004.






7
PHẦN III.

BÁO CÁO KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

3.1. MỞ ĐẦU
Nhiễm siêu vi B là một vấn đề y tế và xã hội quan trọng cho toàn thế giới,
đặc biệt là các nước đang phát triển trong khu vực Á - Phi, chiếm khoảng 3/4 số
nhiễm siêu vi B mạn tính trên toàn thế giới. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế
giới, viêm gan siêu vi B được xếp hàng thứ 9 trong những nguyên nhân gây tử
vong.
Con đường lây nhiễm quan trọng nhất là từ mẹ sang con. Ngoài ra, bệnh còn
lây qua đường tình dục, qua các dụng cụ bén nhọn có dính máu và dòch tiết làm
rách da - niêm. Nhân viên y tế là một trong những đối tượng có nguy cơ bò nhiễm
cao do phải tiếp xúc thường xuyên với các loại dòch thể và máu. Do đó, viêm gan

siêu vi B còn được công nhận là một bệnh nghề nghiệp và là một bệnh lây nhiễm
trong bệnh viện.
Hiện nay, ước tính có khoảng 2 tỷ người bò nhiễm hoặc đã bò nhiễm HBV,
trong đó khoảng 350 triệu người bò nhiễm mãn tính, làm chết hàng năm khoảng 1
triệu người. Tỷ lệ phát bệnh sau khi nhiễm thay đổi phụ thuộc vào lứa tuổi. Có
khoảng 80-90% trẻ sơ sinh dưới 1 năm tuổi nhiễm HBV sẽ trở nên mãn tính; tỷ lệ
này là 30-50% ở lứa tuổi 1-4 tuổi và 25% người bò nhiễm mãn tính sẽ chết vì ung
thư hoặc xơ gan. Ở người lớn, 30-50% trường hợp bò nhiễm sau lần tiếp xúc đầu
tiên, 2-6% sẽ trở thành nhiễm mãn tính và 15% số này sẽ chết vì bệnh gan
( />).
Nước ta thuộc vùng dòch tễ lưu hành của viêm gan, đặc biệt đối với viêm gan B. Số
liệu điều tra năm 1998 trên 1.570 người tại tỉnh Thanh Hóa cho kết quả tỷ lệ nhiễm HBV
trung bình là 17,2%, trong đó trẻ em là 12,5%, lứa tuổi vò thành niên là 20,5% và người
lớn là 18,8%. Hiện nay, tỷ lệ lưu hành bệnh viêm gan siêu vi B rất cao (ước tính khoảng
20% dân số có mang mầm bệnh) và thường dẫn đến xơ gan, ung thư gan và gây tử vong
(
).
Mức độ phổ biến và nguy hiểm do nhiễm HBV nêu trên đã tạo ra nhu cầu
bức bách trong việc tiêm phòng và chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B. Việc tiêm
phòng có thể thực hiện ở trẻ mới sinh, tuy nhiên liều lượng sẽ thay đổi tùy thuộc
vào người mẹ có mang mầm bệnh hay không. Đối với các lứa tuổi còn lại, trước
khi tiêm phòng, cần tiến hành chẩn đoán xem đã bò nhiễm HBV chưa. Mặt khác,
việc chẩn đoán cũng cần thiết nhằm xác đònh bệnh khi cơ thể có những biểu hiện
bệnh lý về gan, để có biện pháp trò liệu thích hợp. Do vậy, hiện nay nhu cầu chẩn
đoán viêm gan siêu vi B là rất lớn, ước tính không dưới 100 xét nghiệm/ngày/đơn
vò xét nghiệm.
Sự hiện diện của kháng nguyên bề mặt trên vỏ virút gây viêm gan B
(HBsAg) là một trong những chỉ điểm huyết thanh quan trọng trong chẩn đoán các
thể bệnh lâm sàng, trong xét nghiệm để tiến hành tiêm thuốc chủng ngừa cũng

8
như theo dõi sự tiến triển của bệnh trong quá trình điều trò. Ở Việt Nam, phương
pháp được chủ yếu dùng trong chẩn đoán HBV là ELISA. Phương pháp này có ưu
điểm là nhanh, nhạy, rẻ tiền, có thể tiến hành kiểm tra cùng một lúc nhiều mẫu,
và thao tác tương đối đơn giản. Tuy nhiên, hiện nay, tất cả các đơn vò xét nghiệm
HBV bằng kỹ thuật ELISA tại Việt Nam đều phụ thuộc vào bộ hóa chất (Kit)
nhập từ nước ngoài, được cung cấp bởi nhiều công ty khác nhau (Abott, Bayer,
Pharmatech…). Do đó, gây không ít khó khăn trong việc thực hiện do phải phụ
thuộc vào nguồn cung cấp từ ngoài nước, đồng thời làm tăng chi phí xét nghiệm.
Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào trong nước được thực hiện
nhằm phát triển các bộ Kit miễn dòch để chẩn đoán HBV do hạn chế về khả năng
kỹ thuật trong việc tạo kháng nguyên để sản xuất kháng thể. Đề tài này nhằm tạo
kháng nguyên HBV tái tổ hợp và tạo kháng thể đa dòng tạo cơ sở cho việc phát
triển phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu B ở Việt Nam.

3.2. TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN
Viêm gan siêu vi B là một vấn đề về sức khỏe mang tính toàn cầu. Theo
thống kê của WHO, năm 1994, trên thế giới có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus
viên gan siêu vi B trong đó có 350 triệu người nhiễm bệnh ở thể mãn tính, 25%-
40% số người nhiễm virus mãn tính sẽ chuyển thành xơ gan và ung thư tối cấp.
Ước tính hàng năm có khoảng 2 triệu người viêm gan mãn tính chết vì xơ gan và
ung thư gan. Hiện nay, cơ sở phân tử về cấu trúc, chức năng các thanh phần và về
miễn dòch học của bệnh viêm gan do siêu vi B đã được biết rất rõ.

3.2.1. Cơ sở phân tử cấu trúc và chức năng các thành phần của HBV
Bộ gen của HBV chứa bốn khung đọc mở (Open reading frame – ORF)
mã hóa cho protein vỏ (PreS1, PreS2 và S); protein lõi (protein tiền lõi PreC,
HBeAg và HBcAg); polymerase (HBPol) và protein X (HBx). Đầu 5’ của mạch
(+) nằm dưới đầu 5’ của mạch (-) khoảng 200bp và chứa trình tự DR2 (direct
repeat), đầu 5’ của mạch (-) chứa trình tự DR1, những trình tự này có vai trò trong

quá trình bắt cặp mồi để tổng hợp những sợi DNA tương ứng (Hình 1). Đầu 3’ của
mạch (+) không cố đònh, gắn với DNA polymerase của virus (C. Seeger et al.,
Hepatitis B Virus Biology, Microbio. & Mol. Bio. Reviews
, 64, 51-68, 2000).

a. Các protein bề mặt
Gồm 3 nhóm protein là S (SHBs), M (MHBs) và L (LHBs) (Hình 2).
Các phần tử HBV có khả năng gây nhiễm chứa đến 70% S, phần còn lại là M và
L với thành phần tương đương nhau. Đây là các glycoprotein vỏ có thể được tiết ra
dưới dạng không chứa DNA và không có khả năng gây nhiễm. Số lượng của các
protein này phong phú và vượt trội hơn nhiều so với những hạt virion có khả năng
lây nhiễm. Những phân tử này có hai dạng: hình cầu – chứa chủ yếu là protein S
và M, hình sợi – chứa một lượng lớn protein L. Những phân tử này được cho là

9
nguyên nhân gây ra những hội chứng miễn dòch phức tạp ở bệnh nhân nhiễm cấp
tính và là mồi tạo kháng thể trung hòa anti-S.

1.1.1.1.1.

Hình 1. Cấu trúc bộ gen HBV và chiều phiên mã, dòch mã của các gen.

- Protein S (SHBs)
Còn được gọi là kháng nguyên Úc (Au antigen) gồm 226 axít amin, hình
thành cấu thể S. Đây là protein nhỏ nhất trong các protein bề mặt HBV, có khối
lượng khoảng 24 kDa, có tính kò nước cao, mang 4 vùng xuyên màng, chứa nhiều
Hình 2. Đặc điểm của các protein bề mặt và gen tương ứng của HBV

10
cystein. Ngoài ra, SHBs thường được glycosyl hoá tại vò trí Asp146. SHBs là thành
phần chủ yếu cấu thành nên các loại protein bề mặt khác, nên được sản xuất với
số lượng lớn. Ngoài ra, SHBs còn chứa một epitope mà dựa vào sự phân tích vùng
epitope này cho phép ta phân loại các dạng phụ của HBV. Những tế bào bò nhiễm
HBV trong giai đoạn đầu thường sản xuất ra những protein này với số lượng lớn,
trong đó chủ yếu là các dạng hạt không lây nhiễm. Nồng độ các hạt không lây
nhiễm có trong huyết thanh của người có thể lên đến 200µg/ml.
- Protein M (MHBs)

Bao gồm protein S (226 axít amin) và một đoạn PreS
2
(55aa) chứa 281 axít
amin. Vùng PreS
2
có tính ưa nước, nằm ở mặt ngoài tế bào và được glycosyl hoá
tại vò trí Asp4. Vò trí glycosyl hoá Asp4 của vùng PreS

2
là cố đònh chứ không thay
đổi như vò trí glycosyl hoá tại domain S. Một số nghiên cứu sâu hơn về protein M
cho thấy, chính vò trí glycosyl hoá Asp4 trên vùng PreS
2
giúp cho protein M đóng
vai trò quan trọng sự tiết ra của hạt virút. Vò trí glycosyl hoá Asp4 của vùng PreS
2

sẽ tương tác với các phân tử chaperon (calnexin) giúp M được gấp cuộn chính xác
để có cấu hình cho phép kết hợp được với nucleocapsid để nảy chồi thành virus (J.
Le Seyec et al., Role of the PreS
2
domain of the large envelope protein in hepatitis
B virus assembly and infectivity, J. Virol, 72, 5573-5578, 1998).
Vùng PreS
2
chứa 4 epitope có tính kháng nguyên cao. Trong số này có ba
epitope của PreS
2
hiện diện trong đoạn peptid từ axít amin 1- 26 (Hình 3). Các
epitope này có tính bảo tồn cao, ít có sự biến động giữa các loài HBV phụ. Do
vậy, đoạn peptid từ axít amin 1 đến 26, tạm gọi là vùng PreS
2
26, là đặc trưng và
đại diện cho toàn vùng PreS
2
.

- Protein L (L HBs)

Bao gồm protein S (226 axít amin), PreS
2
(55 axít amin) và PreS
1
(108 hay
119 axít amin tùy dòng HBV).
Đây là protein bề mặt HBV lớn nhất, khoảng 39 kDa gồm domain S, vùng
PreS
1
và vùng PreS
2
. Ngoài vò trí glycosyl hoá trên domain S, cả 2 vùng PreS
1
và
Chú thích : vùng

Hình 3: Các vùng epitope trên kháng nguyên PreS
2
.
55 26 1
PreS
2
26
Domain S
PreS2
281
1 10 20 26 30 40 50
Ac-MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTVSPISSIFSRIGDPALN
18 48 382317 13 6 1
Glycosyl hoá –
As
p
4

11
PreS
2
đều không có mang vò trí glycosyl hoá nào, nhưng trên vùng PreS
1
lại có
mang 1 vò trí tín hiệu tại đuôi N giúp giữ đuôi vào màng. Vùng PreS
1
thường thay
đổi nhiều ở virút HBV.

b. Protein lõi

ORF của vùng gen mã hóa cho các protein lõi có hai codon khởi đầu dòch mã
chia nó làm hai thành phần PreC và C. Vùng C tổng hợp nên protein capsid (lõi),
C (HBcAg). Các phân tử protein lõi dimer hóa (dạng hai phân tử gắn với nhau) và
các phân tử dimmer này gắn với nhau để hình thành nucleocapsid. Vùng PreC
tổng hợp nên một protein dung hợp chứa một peptid tín hiệu. Peptid này giúp cho
protein dung hợp đi qua khoang của mạng lưới nội chất, được chế biến thành
HBeAg. HBeAg là một dấu ấn lâm sàng quan trọng, là dấu hiệu của quá trình sao
chép của virus.

c. Polymerase
Sản phẩm dòch mã từ ORF P, gồm hai vùng chức năng: protein cuối (terminal
protein – TP) ở đầu N và RNase H ở đầu C. Vùng TP, nối cộng hóa trò với đầu 5’
của DNA mạch (-), có vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói RNA tiền bộ
gen (pgRNA) của virus và giữ vai trò làm mồi trong quá trình phiên mã ngược.

d. Protein X (HBx)
Là một protein nhỏ, 17kDa, và không có tính gây đáp ứng miễn dòch cao.
HBx hoạt hóa sự phiên mã một số gen của tế bào chủ và HBVt, là một nhân tố
điều hòa đa chức năng giúp HBV thích nghi với những điều kiện bất lợi.
3.2.2. Dấu ấn miễn dòch
- Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg): xuất hiện rất sớm, trước
khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến mất sau 4 - 8 tuần kể từ khi có
triệu chứng. Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành
người mang HBsAg mãn. Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh cho biết có
DNA HBV trong tế bào gan. Đònh lượng HBsAg có giá trò tiên lượng; nếu trong
giai đoạn bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn ¼ so với trò số ban đầu thì
có nguy cơ trở thành người mang virus mãn tính.
Có một số trường hợp viêm gan B mà HbsAg âm tính, đây có thể là do
HBsAg hiện diện trong cơ thể với nồng độ thấp, nhỏ hơn ngưỡng phát hiện của
các kỹ thuật hiện nay hoặc bò trung hòa bởi lượng kháng thể anti-HBs trội hơn.

- Kháng nguyên PreS
1
: PreS
1
là một thành phần của protein L thuộc protein
bề mặt của HBV. PreS1 là có nhiều chức năng trong đó có chứa epitope có khả
năng kích thích phản ứng miễn dòch ở tế bào B và T với phổ trình diện kháng
nguyên rộng hơn so với protein PreS
2
và S. PreS
1
nằm ở ngoài cùng của lớp vỏ
của phần tử HBV trưởng thành và có nhiều epitope trùng lắp lên nhau nên phản
ứng miễn dòch tạo ra kháng thể anti-PreS
1
xảy ra sớm trong quá trình gây bệnh và

12
có liên quan đến sự loại bỏ và trung hòa virus. Kháng thể kháng PreS
1
chủ yếu
được phát hiện sớm ở những bệnh nhân viêm gan cấp tính, do đó, kháng thể
kháng PreS
1
có khả năng là một dấu ấn huyết thanh cho sự loại bỏ HBV. Khoảng
½ trường hợp bệnh nhân viêm gan cấp tính trong giai đoạn bình phục có thử
nghiệm phát hiện kháng thể kháng PreS
1
dương tính. Trong khi đó, ở những bệnh
nhân có sự tồn tại lâu dài của kháng nguyên PreS

1
không có kháng thể tương ứng
sẽ có nhiều khả năng chuyển sang giai đoạn bệnh mãn tính (C.Y. Maeng et al.,
Fine mapping of virus-neutralizing epitopes on the Hepatitis B Virus PreS1”,
Virology, 270, 9-16, 2000).
- Kháng nguyên PreS
2
: PreS
2
là thành phần của protein L và protein M
thuộc protein bề mặt của HBV. Đây là vùng mang nhiều epitope nên có tính
kháng nguyên cao. Những kháng thể kháng PreS
2
sinh ra từ hệ thống miễn dòch sẽ
giúp cơ thể không bò nhiễm bởi HBV. Trong protein bề mặt L, cùng với vùng
PreS
1
, vùng PreS
2
cũng đóng vai trò giúp cho sự bám dính và tấn công của HBV
lên tế bào gan. Còn trong protein bề mặt M, vai trò chủ yếu của vùng PreS
2
là
giúp cho sự nảy chồi của HBV.
Những thí nghiệm gần đây cho thấy vùng PreS (PreS
1
và PreS
2
) có tính miễn
dòch cao hơn. Trong cơ thể người bệnh, những kháng thể kháng những epitope

trên vùng PreS được phát hiện thấy trước khi phát hiện được những kháng thể
kháng epitope của vùng S.
- Kháng nguyên E (HBeAg) là kháng nguyên hòa tan thường liên quan đến
HbsAg, phản ánh mức độ lây nhiễm của viêm gan B.
Kháng nguyên HBeAg xuất hiện sớm trong giai đoạn tiền vàng da. Sự biến
mất của HBeAg và xuất hiện anti-HBe là dấu hiệu của bệnh đang lùi dần. Ngược
lại trong viêm gan mãn tấn công thường thấy HBeAg(+) chứng tỏ virus luôn luôn
nhân lên.
Ở những người có HBeAg(+) và HBsAg(+) thì tỷ lệ lây nhiễm rất cao, đặc
biệt ở phụ nữ có thai, nếu HBsAg(+) thì cần theo dõi HBeAg, nếu HBeAg(+) thì
hầu hết con của họ bò lây nhiễm.
- Kháng nguyên C (HbcAg) : HbcAg là kháng nguyên lõi (core) được lớp vỏ
HbsAg bao bọc nên không có trong máu ở dạng tự do, vì vậy, các kỹ thuật miễn
dòch học thông thường không phát hiện được. HbcAg chỉ xuất hiện ở trong tế bào
gan và chỉ có thể phát hiện được khi làm sinh thiết gan. Khi trong tế bào gan có
HbcAg thì bao giờ cũng có HbsAg trên màng tế bào và nồng độ DNA polymerase
luôn luôn tăng cao…
- Kháng thể anti-HBs : là kháng thể kháng lại HbsAg, xuất hiện muộn 2 – 16
tuần sau khi lượng HbsAg bắt đầu giảm. IgM anti-HBs xuất hiện trong giai đoạn
cấp còn IgG anti-HBs xuất hiện muộn và tồn tại lâu dài hơn.
Khi xét nghiệm thấy anti-HBs(+) là dấu hiệu bệnh đã được cải thiện. Anti-
HBs có tác dụng chống tái nhiễm HBV.

13
Khi tiêm vắcxin viêm gan B thì anti-HBs là kháng thể duy nhất phát hiện
được trong máu. Nồng độ kháng thể anti-HBs cao hay thấp còn phụ thuộc vào một
số các yếu tố như : công hiệu vắcxin, liều lượng và thời gian.
- Kháng thể anti-HBe: là kháng thể kháng lại HBeAg, thường có ở huyết
thanh người mang HBsAg hiệu giá thấp, chỉ nên xét nghiệm HBeAg và anti-HBe
ở những người có HBsAg(+).

Khi xuất hiện anti-HBe là dấu hiệu bệnh đang hồi phục. IgM anti-HBe
xuấthiện sớm còn IgG anti-HBe xuất hiện muộn hơn. Sự có mặt của kháng thể
anti-HBe không có tác dụng chống tái nhiễm HBV, mà chỉ biểu hiện đã từng mắc
HBV.
Bảng 1. Các dấu ấn chỉ thò sự nhiễm HBV
Quá trình nhiễm
Dấu ấn Cấp tính Mãn tính Nhiễm trong quá khứ
HBsAg + + -
HBeAg ban đầu +, sau đó - +/- -
anti-HBs - - +
anti-HBc IgM + - -
anti-HBc IgG + + +
anti-HBe ban đầu -, sau đó - +/- +
HBV DNA ban đầu +, sau đó - +/- -
ALT Tăng (đáng kể) Tăng (nhẹ) Bình thường
3.2.3. Các ứng dụng kháng nguyên bề mặt PreS1, PreS2
Gần đây, ngoài kháng nguyên S (HbsAg), các kháng nguyên PreS1, PreS2
thuộc nhóm kháng nguyên bề mặt L và M đang được nghiên cứu ứng dụng do
những ưu điểm sau:
- Có tính ổn đònh cao, không biến động như S
- Chứa vò trí gắn với thụ thể của tế bào gan
- Chứa nhiều epitope có tính kháng nguyên cao
- Kháng thể kháng PreS1 và PreS2 có khả năng trung hòa virút
- Có nhiều ưu điểm để làm vắcxin phòng bệnh, điều trò và chẩn đoán
Có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bề mặt PreS1 và PreS2 của
HBV nhằm mục đích chữa bệnh hoặc làm vắcxin phòng bệnh viêm gan B. Chẳng
hạn, những nhà khoa học thuộc Viện gan, Shenzhen, Trung Quốc đã dung hợp
đoạn axit amin từ 3 - 55 của preS1 với đầu C của trình tự HBcAg (1-115) để tổng
hợp protein HBVCS1. Protein này kích thích phản ứng miễn dòch anti-HBc mạnh
và anti-PreS1 trung bình. Việc chủng ngừa HBVCS1 giúp giảm lượng HBsAg và

HBV DNA trong huyết thanh của những con chuột thử nghiệm. HBVCS1 có thể là
một văcxin trò liệu hữu hiệu đối với những trường hợp viêm gan B mãn tính.
Những nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu khoa học sự sống và công nghệ
sinh học Hàn Quốc đã tổng hợp thành công kháng thể đơn dòng gắn chuyên biệt

14
với vùng axit amin từ 21 - 47 của peptide PreS1 bằng cách gây miễn dòch chuột
bằng đoạn peptide PreS1.
Những nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu Kimball của Trung tâm máu
New York cho rằng vì kháng nguyên có vai trò trong sự tương tác với thụ thể của
tế bào gan nên những kháng thể gắn chuyên biệt với kháng nguyên này có thể
trung hoà tính gây bệnh của virus bằng cách ngăn không cho chúng gắn với tế
bào. Vì vậy, hiện nay người ta đang tiếp tục nghiên cứu để chế tạo ra những
kháng nguyên để dùng làm văcxin viêm gan B.

3.3. TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC CÓ LIÊN QUAN
Việt Nam nằm trong vùng dòch tễ cao của viêm gan siêu vi B, 50 – 70% dân
cư đã từng nhiễm bệnh, ước tính có khoảng 10 triệu người mang HBsAg. Tỷ lệ
mang HBsAg cao nhất là ở độ tuổi từ 41 - 50 chiếm 18,7%, thấp nhất là từ 0 -10
tuổi chiếm 10,7%, nhưng tỷ lệ HBeAg(+) /HBsAg(+) của lứa tuổi 0 - 10 lại là
91%. Theo diễn tiến tự nhiên, tỷ lệ mất HBsAg hàng năm là 1 - 2%, và chuyển
đổi huyết thanh HBeAg là 9,6%. Về lây truyền dọc, nếu thai phụ có HBsAg(+),
nguy cơ con bò nhiễm là 40 - 50%, còn thai phụ có cả HBsAg(+) và HBeAg(+),
nguy cơ con bò nhiễm là 90%. Tỷ lệ viêm gan cấp ở bệnh viện có dấu ấn của siêu
vi viêm gan B là 40 - 50%, bệnh xơ gan trên người mang HBsAg(+) là 30 - 40%.
Ung thư gan chiếm 38/100000 người dân, đứng thứ hai sau ung thư phổi,
HBsAg(+) trong ung thư gan là 80 - 90%. Virút viêm gan B là căn nguyên quan
trọng nhất gây ung thư gan tối cấp, chiếm 71,37% các trường hợp có liên quan đến
viêm gan mãn và xơ gan ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu nhận và giải trình tự

kháng nguyên bề mặt của virus HBV (Đinh Duy Kháng, Viện Công nghệ Sinh
học Hà Nội); các nhóm nghiên cứu khác phát triển kit chẩn đoán HBV bằng kỹ
thuật PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, Trường ĐH Khoa học tự nhiên; Phạm Hùng
Vân, ĐH Y Dược Tp HCM). Ngoài ra, Viện Vệ sinh Dòch tễ Trung ương đã tiếp
nhận chuyển giao công nghệ từ Hàn Quốc để sản xuất HBsAg tái tổ hợp làm
vắcxin.
Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhóm nghiên cứu và công trình nào trong
nước nghiên cứu các kháng nguyên vùng PreS (PreS1, PreS2) làm cơ sở cho các
ứng dụng trong chẩn đoán, phòng ngừa và điều trò bệnh viên gan do HBV.

3.4. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Mục tiêu của đề tài này là ứng dụng kỹ thuật gen để tạo kháng nguyên bề
mặt của vi rút HBV gây bệnh viêm gan siêu vi B, sản xuất kháng thể đa dòng đặc
hiệu ở quy mô phòng thí nghiệm.

3.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để thu nhận kháng nguyên tái tổ hợp nhằm tạo kháng thể đa dòng, chúng tôi
đã thực hiện các phương án sau nay:

15
- Tạo dòng để thu nhận kháng nguyên bề mặt PreS
1
tái tổ hợp:
Phương án này được thực hiện với 2 hệ thống vector biểu hiện khác nhau:
+ Hệ thống vector biểu hiện
pET43.1b(+); kháng nguyên bề mặt được biểu
hiện dưới dạng dung hợp NUS-6XHis-PreS
1
;
+ Hệ thống vector biểu hiện pGEX-2TK; kháng nguyên bề mặt được biểu

hiện dưới dạng dung hợp GST-PreS
1
.
- Tạo dòng để thu nhận kháng nguyên bề mặt PreS
2
26:
Trong PreS
2
chỉ đoạn gen 26 axit amin đầu tiên đã được xác đònh có chứa
epitope. Do vậy chỉ đoạn peptide chứa 26 axit amin này được quan tâm để tạo
dòng và biểu hiện trong đề tài này và được ký hiệu là PreS
2
26. Gen mã hóa
PreS
2
26 được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX-2TK và kháng
nguyên bề mặt được biểu hiện dưới dạng dung hợp GST- PreS
2
26.
- Tạo dòng để thu nhận kháng nguyên bề mặt PreS
1
-S
2
26:
Để thu nhận được kháng nguyên mang đủ các đặc tính miễn dòch của PreS
1

và PreS
2
, chúng tôi thực hiện phương án tạo dòng và biểu hiện đoạn peptide chứa

đồng thời PreS
1
và PreS
2
26. Peptide này được đặt tên là PreS
1
-S
2
26. Việc biểu
hiện kháng nguyên PreS
1
-S
2
26 tái tổ hợp được thực hiện bằng hệ thống vector
biểu hiện pET-28a; kháng nguyên bề mặt được biểu hiện dưới dạng dung hợp
6XHis- PreS
1
-S
2
26.

3.5.1. Tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt PreS
1
, PreS
2
26, PreS
1
-S
2
26

của HBV
- Các gen mã hóa kháng nguyên PreS
1
, PreS
2
26 và PreS
1
-S
2
26 được thu nhận
bằng phản ứng PCR bằng các cặp mồi tự thiết kế dựa trên khuôn là DNA bộ gen
của HBV được tách chiết từ mẫu huyết thanh bệnh phẩm dương tính với HbsAg.
- Các gen này được tạo dòng vào vector pBlueScript và được biến nạp vào tế
bào chủ E. coli DH-5α.
- Dòng E. coli, các vector tái tổ hợp được phân tích, kiểm chứng bằng PCR
khuẩn lạc, PCR plasmid, cắt giới hạn và giải trình tự.
- Các vector tái tổ hợp được dùng làm nguồn gen để tái tạo dòng nhằm tạo ra
cá dòng biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp tương ứng.

3.5.2. Tạo các dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS
1
, PreS
2
26,
PreS
1
-S
2
26 của HBV

3.5.2.1. Tạo các dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS
1

- Tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên PreS
1
ở dạng dung hợp 6XHis-
PreS
1
:
+
Gen mã hóa PreS
1
được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pET43.1b(+);
+
Vector tái tổ hợp (pET-PreS1) được biến nạp vào tế bào chủ E. coli
BL21(DE3).

16
- Tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên PreS
1
ở dạng dung hợp GST-
PreS
1
:
+
Gen mã hóa PreS
1
được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pGEX-2TK;
+
Vector tái tổ hợp (pGEX-PreS

1
) được biến nạp vào tế bào chủ E. coli
BL21(DE3).

3.5.2.2. Tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS
2
26
- Gen mã hóa PreS
2
26

được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pGEX-2TK.
-
Vector tái tổ hợp (pGEX-PreS
2
26) được biến nạp vào tế bào chủ E. coli
BL21(DE3 plysS).

3.5.2.3. Tạo dòng E. coli biểu hiện kháng nguyên bề mặt PreS
1
- S
2
26
- Gen mã hóa PreS
1
-S
2
26

được tái tạo dòng lên vector biểu hiện pET-28a.

-
Vector tái tổ hợp (pET-PreS
1
-S
2
26) được biến nạp vào tế bào chủ E. coli
BL21(DE3).

3.5.3. Biểu hiện và tinh chế các kháng nguyên tái tổ hợp

3.5.3.1. Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên 6XHis-PreS
1
tái tổ hợp
- Dòng E. coli BL21(DE3)/pET-PreS
1
được cảm ứng biểu hiện 6XHis-PreS
1
bằng IPTG;
- Sự biểu hiện kháng nguyên 6XHis-PreS
1
được kiểm chứng bằng điện di
SDS-PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng 6XHis.
- Kháng nguyên tái tổ hợp 6XHis-PreS
1
được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực
Ni-NTA agarose.

3.5.3.2. Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên GST-PreS
1
tái tổ hợp

- Dòng E. coli BL21(DE3)/pGEX-PreS
1
được cảm ứng biểu hiện GST-PreS
1
bằng IPTG;
- Sự biểu hiện kháng nguyên GST-PreS
1
được kiểm chứng bằng điện di SDS-
PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng GST và kháng thể kháng PreS
1
.


3.5.3.3. Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên GST-PreS
2
26 tái tổ hợp
- Dòng E. coli BL21(DE3pLys)/pGEX-PreS
2
26 được cảm ứng biểu hiện
GST- PreS
2
26

bằng IPTG;
- Sự biểu hiện kháng nguyên GST-PreS
2
26

được kiểm chứng bằng điện di
SDS-PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng GST.

- Kháng nguyên tái tổ hợp GST-PreS
2
26 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực
Glutathione sepharose.

3.5.3.4. Biểu hiện và tinh chế kháng nguyên 6XHis-PreS
1
-S
2
26 tái tổ hợp
- Dòng E. coli BL21(DE3)/pET-pET-PreS
1
-S
2
26 được cảm ứng biểu hiện
6XHis- PreS
1
-S
2
26

bằng IPTG;

17
- Sự biểu hiện kháng nguyên PreS
1
-S
2
26 được kiểm chứng bằng điện di SDS-

PAGE và lai Western blot với kháng thể kháng 6XHis và kháng thể kháng PreS
1
.
- Kháng nguyên tái tổ hợp PreS
1
-S
2
26 được tinh chế bằng cột sắc ký ái lực
chuyên biệt Ni-NTA sepharose.

3.5.4. Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên PreS
1
-S
2
26 tái tổ hợp
- Đã tiến hành gây miễn dòch chuột bằng kháng nguyên PreS
1
-S
2
26 tái tổ
hợp tinh chế.
- Đã thu kháng thể IgG chuột và tinh chế bằng cột sắc ký ái lực protein G.

3.5.5. Đánh
giá kháng thể: hiệu giá, độ nhạy, độ đặc hiệu
- Kháng thể thu được được sử dụng cho phản ứng Sandwich ELISA để kiểm
chứng khả năng nhận diện và gắn kháng nguyên HBs trong các mẫu huyết thanh
dương tính và âm tính với HbsAg bằng bộ Kit ELISA thương phẩm.

3.6. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG

3.6.1. Hóa chất
a. Hóa chất dùng cho quá trình tách chiết và tinh chế DNA plasmid từ vi
khuẩn và DNA từ virus
- Dung dòch I: glucose 50mM; Tris-HCl pH 8,0 25mM, EDTA pH 8,0 10mM;
hấp khử trùng ở 121
o
C, trong 15 phút trước khi sử dụng
- Dung dòch II (pha ngay trước khi sử dụng). Trong 200µl dung dòch II, có các
thành phần như sau: sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 20µl, NaOH 5N 8µl, nước
cất 172µl
- Dung dòch III (KOAc) pH 4,8: glacial acetic acid 0,2M, potassium acetate
0,2M; hấp khử trùng 121
o
C, trong 15 phút trước khi sử dụng.
- RNase 1mg/ml, giữ ở -20
o
C
- Phenol pH 8,0 bão hoà trong TE, giữ trong tủ mát 4
o
C
- Chloroform
- Isopropanol lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20
o

C)
- Dung dòch TE: Tris-HCl pH 8,0 10mM, EDTA 1mM
- PEG 6000 20% (Wako, Nhật Bản) trong NaCl 15%, hấp khử trùng 121
o
C,
trong 15 phút, giữ ở nhiệt độ phòng
- Sodium acetate 3M, pH 4,8 (giữ ở nhiệt độ phòng)
- Dung dòch ly giải virus: Tris-HCl pH8 10mM, EDTA 10mM, SDS 2%,
Proteinase K 500µg/ml

b. Hóa chất dùng cho điện di DNA trên gel agarose

18
- Agarose (SeaKem® LE Agarose, Mỹ) (các nồng độ gel thường sử dụng là
0,8%, 1%, 1,5% và 2%)
- Ethidium bromide 10mg/ml
- Dung dòch điện di TAE 50X (pH 7,9 – 8,0): Tris-base 242g, glacial acetic
acid 57,1g, EDTA 500mM 100ml, nước cất đủ 1000ml
- Dung dòch nạp mẫu (loading dye) (giữ ở 4
o
C): bromophenol blue 0,25%;
glycerol trong TAE 1X 40%

c. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
- Taq DNA polymerase (Amersham Biosciences) nồng độ 1U/µl, được bảo
quản trong dung dòch gồm 50mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,1mM, DTT 5mM và
glycerol 50%, ở -20
o
C
- Đệm PCR 10X đi kèm với Taq DNA polymerase (Perkin – Elmer), Native

Pfu DNA polymerase (Stratagene)
- dNTP (Amersham Biosciences) mỗi dNTP có nồng độ 2mM trong nước (pH
7,5)
- MgCl
2
, MgSO
4
25mM
- Mồi (primer), được ký hiệu F
1
(21) và R
1
(21), do Phòng thí nghiệm Công
nghệ Sinh học phân tử A (LabA), Trường đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp

c. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế
Các enzyme cắt hạn chế được sử dụng để thực hiện phản ứng cắt DNA
plasmid vector và gen mục tiêu là HindIII (Toyobo, Nhật Bản), và BamHI
(Fermentas). Thành phần của các phản ứng cắt được thực hiện dựa theo hướng
dẫn sử dụng.

d. Hóa chất dùng cho quá trình tinh chế sản phẩm PCR và sản phẩm cắt
Chloroform, sodium acetate 3M, pH 4,8, ethanol 70% và cồn tuyệt đối lạnh

e. Hóa chất dùng cho phản ứng nối
Enzyme được sử dụng cho phản ứng nối là T4 DNA ligase của hãng
Fermentas và các hóa chất làm đệm đi kèm.

g. Hóa chất dùng cho quá trình làm tế bào khả nạp và biến nạp
- Dung dòch CM: CaCl

2
5%, MgCl
2
15%
- CaCl
2
100mM lạnh, vô trùng (giữ ở 4
o
C)
- Glycerol 80% vô trùng (pha loãng khi sử dụng)
- Ampicillin 100mg/ml (pha trong nước cất hai lần)

h. Hóa chất dùng cho cảm ứng biểu hiện gen mục tiêu
IPTG 1M (giữ ở -20
o
C)


19
i. Hóa chất dùng cho điện di protein
- Gel polyacrylamide 100 × 100 × 0,75mm, nồng độ 12,5% có thành phần
như sau:
+ Gel phân tách (separating gel): nước cất 2880µl, Tris-HCl 1,5M, pH 8,8
1670µl, 40% acrylamide 2100µl, SDS 10% 67µl, ammonium persulphate (APS)
một ít, TEMED 2µl
+ Gel gom (stacking gel): nước cất 1255µl, Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 500µl,
40% acrylamide 225µl, SDS 10% 20µl, APS một ít, TEMED 1µl
- Dung dòch nạp mẫu 6X (pH 6,8) (giữ ở 4
o
C): glycerol 30%, bromophenol

blue 0,25%, xylene cyanol 0,25%
- Dung dòch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): Tris-HCl 15,1g, glycine 94g,
SDS 5g, nước cất đủ 1000ml
- Dung dòch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): Coomassie brilliant blue
0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml, glacial acetic acid 25,0ml, nước cất 112,5ml
- Dung dòch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): glacial acetic acid 100ml,
ethanol tuyệt đối 100ml, nước cất 800ml

k. Hóa chất dùng cho Western Blot
- Dung dòch Towbin: Tris-HCl 25mM, glycine 192mM, SDS 3,5mM, nước cất
methanol 20% (v/v, thêm vào khi sử dụng)
- Dung dòch PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,5): Na
2
HPO
4
khan
80mM, NaH
2
PO
4
.2H
2
O 20mM, NaCl 100mM
- Dung dòch PBST (Phosphate Buffered Saline Tween): 0,5% (v/v) Tween 20
trong dung dòch PBS
- Dung dòch khóa màng (membrane blocking): Blocking reagent (sữa gầy)
0,5g, dung dòch PBST 10ml
- Dung dòch kháng thể chuột anti-6XHis, anti-GST anti-PreS
1
(Abcam, Anh):

0,5µl kháng thể (10mg/ml), 15ml dung dòch PBST.
- Dung dòch kháng thể thứ cấp đánh dấu (kháng thể thỏ kháng kháng thể
chuột-HRP): 0,5µl kháng thể-HRP (10mg/ml) (Abcam, Anh), 15ml dung dòch
PBST.
- Dung dòch hiện phim Hyperfilm™ECL (Amersham Biosciences): dung dòch
developer, dung dòch Fixer.

l. Hóa chất dùng để bảo quản chủng
Glycerol 80% vô trùng (pha loãng khi sử dụng), nước cất vô trùng

m. Hóa chất dùng để tinh chế protein dung hợp với His-Tag
- Cột Nikel-nitrilotriacetic acid (cột Ni-NTA) (Qiagen, Nhật)
- Đệm rửa (Wash buffer) (Dung dòch A) có thành phần như sau: Tris HCl 25
mM, NaCl 500 mM, imidazole 10 mM, pH 8,0

20
- Đệm dung ly (Elution buffer) (Dung dòch C): Tris HCl 25 mM, NaCl 500
mM, imidazole 250 mM, pH 8,0
- Đệm phá màng tế bào (Lysis buffer) (Dung dòch B): Tris HCl 25 mM,
NaCl 500 mM, imidazole 5 mM, pH 8,0
- Đệm loại muối sau khi tinh chế protein qua cột Ni-NTA: Tris-HCl 20 mM,
NaCl 100 mM, pH 8,0.

n. Hóa chất dùng để tinh chế protein dung hợp với GST
- Cột Glutathione-Sepharose: GSTTrap
TM
FF dung tích 5ml (Amersham
Biosciences).
- Dung dòch nạp mẫu (Binding buffer) pH 7,3: 140mM NaCl, 2,7mM KCl,
10mM Na

2
HPO
4
, 1,8mM KH
2
PO
4
.

o. Hóa chất dùng cho tinh chế kháng thể
- Ammonium sulfate bão hòa: 75g/100ml
- Cột Hi Trap
TM
Protein G HP (Amersham Biosciences) 1ml
- Dung dòch gắn cột: 0,02M Sodium phosphate pH 7,0
- Dung dòch dung ly: 0,1M glycine-HCl pH 2,7
- Dung dòch trung hòa:1M Tris-HCl pH 9,0
- Dung dịch bảo quản cột: 100mM sodium phosphate, pH 7,0

p. Hóa chất dùng để gây đáp ứng miễn dòch chuột
- Complete Freund Adjuvant (Difco)
- Incomplete Freund Adjuvant (Difco)
- Nước cất tiêm

q. Hoá chất dùng cho ELISA
- Antigen coating buffer pH 7,2 – 7,4: 0,16% Na
2
CO
3
, 0,293% NaHCO

3
,
0,02% sodium azide


- PBS buffer: 1 lít phosphate buffer pH 7,6 – 8, 14,61g NaCl, 1ml Tween 20
- Blocking buffer: 5% sữa gầy trong PBS buffer
- Citrate buffer pH 5: 0,1M citric acid, 0,1M Na
2
HPO
4

- OPD buffer pH 5: 40µg OPD/1ml citrate buffer
- OPD-H
2
O
2
buffer: 0,015% H
2
O
2
trong OPD buffer
- Stop solution: H
2
SO
4
2N
- Kháng thể chuột đơn dòng kháng HBsAg (Abcam, Anh),
- Kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Abcam): 1/10.000

3.6.2. Môi trường
- Môi trường LB (Luria – Bertani): trypton 1,0%, cao nấm men 0,5%, NaCl
0,5%

21
- Môi trường LB - Ampicillin (LBA): thành phần môi trường tương tự như
môi trường LB nhưng được bổ sung vô trùng ampicillin với nồng độ cuối 50µg/ml
ở 40 - 50
o
C sau khi hấp khử trùng.
Tất cả các môi trường trên đều được hấp khử trùng ở 121
o
C trong 25 phút
sau khi pha. Nếu là môi trường rắn, bổ sung thêm 2% agar.
3.7. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.7.1. Vật liệu

a. Chủng vi sinh vật
- Chủng E. coli DH5α {F
-
endA1 hsdR17 (r
k
-
/m
k
-
) sup44 thi λ
-
recA1 gyrA96

∆lacU169 (φ80lacZ∆M15)} dùng để tạo dòng gen mã hóa PreS
1
, PreS
2
26, PreS
1
-
S
2
26.
- Chủng E. coli BL21(DE3) thuộc chủng E. coli B có kiểu gen F
-
, ompT,
hsdS
B
(r
B
-
m
B
-
), gal dcm met (DE3) dùng để biểu hiện pET43.1b(+)-PreS
1
, pGEX-
PreS
1
và pET- PreS
1
- S
2

26.
- Chủng E. coli BL21(DE3 plysS) (E. coli F
-
OmpT hsds (r
-
B
m
-
B
) dcm+ Tet
r

gal λ (DE3) endA The[plysS Cam
r
]
a
dùng để biểu hiện PreS
2
26-pGEX.
b. Plasmid
- Plasmid tạo dòng: pBluescript II SK+ (H ình 3).
- Plasmid biểu hiện pET43.1b(+) (Hình 4) là vector biểu hiện, mang gen
kháng kháng sinh ampicillin (amp
r
), trình tự khởi đầu sao chép f1 ori, T7 promoter
và lac operator (Hình 4). Đây là một promoter được cảm ứng với IPTG. Trong tế
bào chủ gen mục tiêu sẽ được biểu hiện khi có sự hiện diện của IPTG trong môi
trường nuôi cấy. Nus-Tag là một protein giúp làm tăng khả năng tan của protein
dung hợp trong tế bào chất.

- Plasmid biểu hiện pET-28a(+) (Hình 5) có kích thước 5369bp với trình tự
khởi đầu sao chép f1 ori, mang gen kháng kháng sinh Kanamycine được sử dụng
làm nhân tố chọn lọc thể biến nạp mang vector tái tổ hợp.

Hình 11: Vector pET-43.1b(+)
H
ình 3. Bản đồ
p
lasmid
p
Bluescri
p
tII SK
(
+
)
amp
r

MCS
lacZ
f
1
origin (+)
pBluescript II SK+
(291)
ori

22
Đây là một vector biểu hiện
dưới sự kiểm soát của T7
promoter được nhận diện bởi T7
RNA polymerase của tế bào chủ
E. coli và lac operator, làm tăng
khả năng kiểm soát sự hoạt động
của T7 promoter tránh tình trạng
“rò rỉ“ trong việc biểu hiện
protein khi chưa được cảm ứng.
Ngay trước và sau vùng multi
cloning site (MCS), mang các vò
trí nhận biết duy nhất của
enzyme cắt giới hạn, phục vụ
cho việc dòng hóa gen mục tiêu
là 2 trình tự mã hóa cho 6
histidine (6XHis)
giúp cho việc phát hiện và tinh chế protein mục tiêu.
- Plasmid biểu hiện: pGEX-2TK (Hình 6) là vector biểu hiện, mang gen
kháng kháng sinh ampicillin (amp
r

), trình tự khởi đầu sao chép ori pBR322, tac
promoter và lac operator. Đây là một promoter được cảm ứng với IPTG. Trong tế
bào chủ gen mục tiêu sẽ được biểu hiện khi có sự hiện diện của IPTG trong môi
trường nuôi cấy dưới dạng dung hợp với GST (Glutathione S-Transferase) giúp dễ
dàng tinh chế protein dung hợp bằng cột sắc ký ái lực gắn glutathione.















c. Các thang phân tử lượng dùng trong điện di
- Thang DNA
Stop codon
Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Arg Ala Ser Val
CTG GTT CCG CGT GGA TCT CGT CGT GCA TCT GTT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA
BamHI EcoRI
Thrombin Kinase
pBR322
ori

Amp
lacI
q

Ptac
GST


pGEX-2TK
~4900bp






Hình 6. Bản đồ plasmid pGEX-2TK

Hình 5.
B
ản đồ
p
lasmid
p
ET-28a
(
+
)

23

Thang
λ
-HindIII Thang 100bp Thang100bp
(Fermentas) (Fermentas) (NewEngland BioLab)
Hình 7. Kích thước các thang phân tử lượng

- Thang phân tử lượng protein: phosphorylase b 94kDa, albumin 67kDa,
ovalbumin 43kDa, carbonic anhydrase 30kDa, trypsin inhibitor 20kDa, α-
lactalbumin 14,4kDa.
- Thang phân tử lượng protein đã được nhuộm dùng trong Western Blot: α
2
-
macroglobulin 180kDa, β-galactosidase 116kDa, fructose-6-phosphate kinase
84kDa, pyruvate kinase 58kDa, fumarase 48,5kDa, lactate dehydrogenase
36,5kDa, triosephosphate isomerase 26,6kDa.

d. Vật liệu để thu nhận DNA của virút HBV
Nguồn DNA của HBV được thu nhận từ huyết thanh của bệnh nhân có kết
quả xét nghiệm dương tính với HBs do Viện Pasteur cung cấp.

e. Huyết thanh dương tính và âm tính HBsAg
Dùng để xác đònh tính đặc hiệu của kháng thể kháng PreS
1
- S
2
26 thu được
đối với kháng nguyên bề mặt của HBV bằng phương pháp Sandwich ELISA. Các
huyết thanh này đã được xác nhận dương tính hoặc âm tính bằng ELISA sử dụng

bộ Kit thương mại và được cung cấp bởi Bệnh viện Y dược TP.HCM.

3.7.2. Tạo dòng gen mã hóa PreS
1
, PreS
2
26, PreS
1
- S
2
26

a. Thu nhận DNA bộ gen của HBV
Tiến hành thu nhận DNA bộ gen của HBV với quy trình như sau: trộn huyết
thanh (huyết thanh của bệnh nhân có kết quả xét nghiệm HbsAg dương tính) với
dung dòch phá màng (SDS 2%, Proteinase K 2mg/ml, EDTA 10mM), ủ 37°C trong
37 giờ. Sau đó, xử lý với phenol và choloroform để loại bỏ protein. Thu nhận phần
dòch nổi có chứa DNA bộ gen của HBV, tủa DNA bằng ethanol tuyệt đối lạnh, rửa
tủa bằng ethanol 70%. Cuối cùng, hòa tan và bảo quản DNA trong TE.


24
b. Phản ứng PCR thu nhận gen mã hóa PreS
1
, PreS
2
26, PreS
1
- S
2

26
- Đoạn gen mã hóa cho PreS
1
của HBV được thu nhận bằng phương pháp
PCR với cặp mồi đặc hiệu là PreS
1
-for (CGGAATTCCATGGGAGGTT
GGTCTTCCA AACCTCGG) / PreS
1
-rev (CGGAATTCGGCCTGAGGATGACT).
Sản phẩm PCR chứa vùng PreS
1
có kích thước 357bp mã hóa cho một peptid 119
axít amin.
- Đoạn gen mã hóa cho PreS
2
được thu nhận dưới dạng gen mã hóa protein M
(tức là PreS
2
-S) bằng phương pháp PCR với cặp mồi PreS
2
-for (GCTGGA
TCCATGCAGTGGAACTCCACA) / PreS
1
-rev (CGGAATTCGGCCTGA GGATG
ACT). Sản phẩm PCR có kích thước 843bp mã hóa cho M chứa 281 axít amin,
trong đó PreS
2
là đoạn 55 amino acid đầu tiên và S chứa 226 axít amin.
- Đoạn gen mã hóa cho 26 axít amin đầu tiên của PreS

2
, được đặt tên là
PreS
2
26 được thu nhận bằng phương pháp PCR dùng cặp mồi PreS
1
-for
(CGGAATTCCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGG) / PreS
2
-rev (GCTGG
ATCCGTTCGCTGCAGGGTCCCC). Sản phẩm PCR có kích thước 78bp.
- Đoạn gen mã hóa cho PreS
1
-S
2
26 (bao gồm vùng mã hóa cho PreS
1
chứa
119 axít amin và vùng mã hóa cho 26 axít amin đầu tiên của PreS
2
) được thu nhận
bằng bằng phương pháp PCR
với cặp mồi đặc hiệu là PreS
1
-for (CGGAATT
CCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGG) / PreS
2
-rev (GCTGG ATCCGTT
CGCTGCAGGGTCCCC). Sản phẩm PCR có kích thước 435bp mã hóa cho một
peptid chứa 145 axít amin.

Tất cả các phản ứng PCR nêu trên đều được thực hiện trong phản ứng với
thành phần như saut: 0,5µl DNA HBV; 5µl dung dòch đệm 10X; 3µl MgSO
4

25mM; 5µl dNTP 8mM; 1µl mồi xuôi F; 1µl mồi ngược R; 0,5µl Pfu DNA
polymerase (2,5U/µl); 34µl nước cất hai lần. Điều kiện phản ứng PCR là: 95°C -
1phút, 55°C – 1 phút, 72°C – 1 phút (30 chu kỳ); 72°C - 15 phút; 4°C - 15 phút.
Sau khi kết thúc phản ứng, lấy 5µl sản phẩm thu được tiến hành điện di kiểm tra
trên gel agarose 1,5%. Các bước tiến hành như sau: cân 0,45g agarose cho vào
erlen 100ml. Bổ sung 30ml dung dòch TAE 1X, đun cho đến khi agarose tan hết.
Để ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dòch hơi nguội rồi đổ vào khuôn điện di.
Khi gel đông, cho dung dòch TAE 1X vào, gỡ lược. Trộn mẫu với dung dòch nạp
mẫu (loading dye), bơm vào giếng. Tiến hành điện di với cường độ 100V, khoảng
20 phút. Sau khi điện di xong, ngâm gel trong nước chứa 1 - 2 giọt ethidium
bromide khoảng 10 - 15 phút, xem kết quả bằng hộp soi đèn tử ngoại.

c. Tinh chế sản phẩm PCR
Để chuẩn bò nguyên liệu cho phản ứng cắt, phần sản phẩm PCR còn lại
được tinh chế theo quy trình như sau:
- Cho một thể tích chloroform (1V) vào eppendorf chứa sản phẩm PCR,
vortex nhẹ, ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, hút chuyển dòch nổi vào một
eppendorf mới.