sinh học phân tử

Bài giảng
học phần Sinh học phân tử
(TS. Nguyễn Văn Duy, tổng hợp và biên soạn)



Mục lục

Chương 1: Giới thiệu
Chương 2: Cấu trúc phân tử
Chương 3: Tách nucleic acid
Chương 4: Nhân gen PCR
Chương 5: Lai phân tử
Chương 6: Giải trình tự
Chương 7: Công nghệ DNA tái tổ hợp
Chương 8: Biểu hiện gen
Phụ lục: Thuật ngữ
Tài liệu tham khảo









Chương 1: Giới thiệu
Sinh học phân tử ra đời từ sự kết hợp của các nhà vật lý học, hóa học cấu trúc,
vi sinh vật học và di truyền học. Năm 1953, Watson và Crick khám phá ra cấu trúc
xoắn kép của DNA, đánh dấu sự ra đời chính thức của sinh học phân tử, mở ra cánh

cửa mới cho công nghệ sinh học hiện đại.
1. Sinh học phân tử là gì?
Sinh học phân tử là một nhánh của sinh học nghiên cứu sự sống ở mức độ phân
tử. Đối tượng nghiên cứu chủ yếu là nucleic acid và protein.
Phạm vi nghiên cứu của Sinh học phân tử có phần giao thoa với các ngành khác
trong sinh học đặc biệt là Di truyền học và Hóa sinh. Trong khi Di truyền học tập trung
vào chức nănsg của các gen, Hóa sinh quan tâm nhiều đến vai trò của protein trong tế
bào, Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu mối quan hệ gen và protein. Làm thế nào đế
gen biểu hiện thành protein? Có những mối tương tác gì giữa các hệ thống cấu trúc
khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của
DNA, RNA và protein? Cơ chế nào điều hòa các mối tương tác này?
2. Lịch sử sinh học phân tử
Nguồn gốc ra đời sinh học phân tử bắt đầu từ những năm 1930 khi đồng thời
các nhà vật lý học, hóa sinh cấu trúc và di truyền học cùng quan tâm đến một vấn đề:
chức năng của các gen. Năm 1953, Watson và Crick khám phá ra cấu trúc xoắn kép
của DNA, đưa sinh học phân tử bước vào giai đoạn cổ điển với nhiệm vụ giải thích các
nguyên lý cơ bản: đơn vị di truyền, thông tin di truyền và cơ chế phân tử của biểu hiện
gen. Cho đến những năm 1970, những vấn đề ấy đã cơ bản được giải quyết. Nhiệm vụ
của các nhà sinh học phân tử lúc ấy là ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử để
giải quyết những vấn đề còn lại trong các lĩnh vực khác nhau của sinh học. Giai đoạn
này gọi là thời kỳ "Đi vào phân tử", đánh dấu sự ra đời của hàng loạt các ngành mới
tiếp cận ở mức độ phân tử như miễn dịch phân tử, di truyền phân tử, tiến hóa phân tử,
Từ những năm 1980, sinh học phân tử đi vào "Giai đoan genomics" khi các nhà
khoa học quan tâm mạnh mẽ đến mối tương tác giữa các gen trong hệ gen. Các phương
pháp mới như giải trình tự trên quy mô lớn, proteomics, microarrays, tin sinh học được
thử nghiệm và ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu hệ gen học (genomics), hệ protein học
(proteomics) và mong muốn ứng dụng trong liệu pháp gen và chuẩn đoán các bệnh lây
nhiễm và di truyền cũng như tìm cách chữa trị những căn bệnh thế kỷ: ung thư!
3. Đề cương học phần
3.1. Thông tin về học phần

Tên học phần: Sinh học phân tử
Số tín chỉ:
Đào tạo trình độ: Đại học
Cho sinh viên năm thứ: 3
Học phần tiên quyết: Hóa sinh học, Tế bào học, Di truyền học, Vi sinh đại
cương
Phân bổ tiết giảng của học phần:
- Nghe giảng lý thuyết: 23 tiết
- Làm bài tập trên lớp: 5 tiết
- Thảo luận: 8 tiết
- Thực hành, thực tập (phòng thí nghiệm): 15 tiết
- Tự nghiên cứu: 9 tiết
Khoa/Viện, Bộ môn quản lý học phần: Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công
nghệ Sinh học và Môi trường
3.2. Tóm tắt nội dung và mục tiêu học phần
Học phần sinh học phân tử đòi hỏi sinh viên nắm vững những nguyên lý cơ bản
trong sinh học phân tử (thông tin di truyền, đơn vị di truyền, cơ chế phân tử), có kiến
thức và kỹ năng thành thạo về các phương pháp sinh học phân tử cơ bản (tách chiết
nucleic acid, PCR, thao tác gen cho nhân dòng và biểu hiện gen, phân tích trình tự
DNA), tiếp cận các phương pháp hiện đại trên thế giới (công nghệ DNA tái tổ hợp,
phân tích cấu trúc và biểu hiện của hệ gen), và có hiểu biết thực tế về ứng dụng của
sinh học phân tử trong y dược và thủy sản ở Nam Trung Bộ và Việt Nam
3.3. Danh mục vấn đề của học phần
1. Giới thiệu về học phần
2. Cấu trúc phân tử
3. Tách nucleic acid
4. Nhân gen PCR
5. Lai phân tử
6. Giải trình tự
7. Công nghệ DNA tái tổ hợp

8. Phân tích biểu hiện gen
Chương 2: Cấu trúc phân tử

Các đại phân tử sinh học bao gồm protein, nucleic acid, lipid và carbohydrate.
Cho đến những năm 1950, cấu trúc của các thành phần cơ bản trong tế bào đã được
hiểu rõ. Trong vòng nửa thế kỷ sau đó, những cấu trúc phân tử mới lần lượt được khám
phá như protein, DNA, virus, kênh ion, ribosome.

1. Cấu trúc protein
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn
phân là amino acid. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết
peptide, tạo ra chuỗi polypeptide, có thể xoắn cuộn hoặc gấp trong không gian.
Amino acid - Đơn phân của protein
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là
các amino acid. Amino acid được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amino (-
NH
2
), hai là nhóm carboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử carbon trung tâm đính
với 1 nguyên tử hydro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của amino acid. Có tất
cả 20 amino acid đã biết trong thành phần của các loại protein khác nhau trong cơ thể
sống. Các amino acid trùng hợp thành chuỗi polypeptide như sau:

Cấu trúc không gian
Có 4 bậc cấu trúc của protein:
 Cấu trúc bậc một: Các amino acid nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành
nên chuỗi polypepetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amino của amino acid thứ nhất
và cuối mạch là nhóm carboxyl của amino acid cuối cùng. Cấu trúc bậc một của
protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các amino acid trên chuỗi polypeptide sẽ thể
hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể
của protein và quyết định tính chất và chức năng của protein.

 Cấu trúc bậc hai: Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không
gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn
α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hydro giữa những amino acid ở
gần nhau. Các protein sợi thường gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều
nếp gấp β hơn.
 Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành
từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này
có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc
biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạch polypeptide. Ví dụ, nhóm -R
của cystein có khả năng tạo cầu nối disulfur (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc
hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa
nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử.
 Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau
thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ
các liên kết yếu như liên kết hydro.
Cấu trúc không gian 3D của protein triose phosphate isomerase
Chức năng của protein
Loại protein

Chức năng Ví dụ
Protein cấu
trúc
Cấu trúc, nâng
đỡ
Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền của
mô liên kết, dây chẳng, gân. Keratin có trong, lông,
móng. Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vững
của tơ nhện, vỏ kén
Enzyme
Xúc tác phản

ứng sinh học
Các enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức
ăn, enzyme Amylase trong nước bọt phân giải tinh
bột chín, enzyme Pepsin phân giải protein, enzyme
Lipase phân giải lipid
Hormone
Điều hòa hoạt
động sinh lý
Hormone Insulin và Glucagon do tế bào đảo tụy
thuộc tuyến tụy tiết ra có tác dụng điều hòa hàm
lượng glucose trong máu động vật có xương sống
Protein vận
chuyển
Vận chuyển các
chất
Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa trong hồng cầu
động vật có xương sống có vai trò vận chuyển oxy từ
phổi theo máu đi nuôi các tế bào
Protein vận
động
Vận động tế
bào và cơ thể
Actinin, Myosin có vai trò vận động cơ. Tubulin có
vai trò vận động long, roi của các sinh vật đơn bào
Protein thụ
quan
Cảm nhận, đáp
ứng kích thích
Thụ quan màng của các tế bào thần kinh
Protein dự trữ

Dự trữ chất
dinh dưỡng
Albumin lòng trắng trứng giúp cho phôi phát triển.
Casein trong sữa mẹ cung cấp amino acid cho con.
Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ cần cho
nảy mầm

2. Cấu trúc DNA
Deoxyribonucleic acid (DNA) là một phân tử nucleic acid mang thông tin di
truyền mã hóa cho các protein hoặc các chức năng khác ở tất cả các sinh vật, bao gồm
virus.
Trong những tế bào sinh vật nhân thật (eukaryote), DNA nằm trong nhân tế bào
trong khi ở các tế bào prokaryote, DNA không được màng nhân bao bọc, vẫn nằm
trong tế bào chất. Ở những bào quan sản sinh năng lượng như lục lạp và ty thể, cũng
như ở nhiều loại virus cũng mang những phân tử DNA đặc thù.
Mỗi phân tử DNA được tạo thành từ hai chuỗi polynucleotide, chúng liên kết
với nhau và uốn quanh 1 trục tương tự 1 chiếc thang dây xoắn. Cấu trúc này được gọi
là cấu trúc xoắn kép (double helix) do Watson & Crick khám phá năm 1953.
Mỗi chuỗi polynucleotide chính là do các phân tử nucleotide liên kết với nhau
thông qua liên kết phosphodieste giữa gốc đường của nucleotide này với gốc phosphate
của nucleotide tiếp theo.
Mỗi nucleotide được tạo thành từ một phân tử đường ribose, một gốc phosphate
và một base (nucleobase). Trong DNA chỉ có 4 loại nucleotide và những loại này khác
nhau ở thành phần nucleobase. Do đó tên gọi của các loại nucleotide xuất phát từ gốc
nucleobase mà nó mang: Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C), và Guanine (G).
Trong đó, A và G là các purine (có kích thước lớn) còn T và C là pyrimidine, (có kích
thước nhỏ hơn).
Trong môi trường dịch thể, 2 chuỗi polynucleotide của 1 phân tử DNA liên kết
với nhau bằng liên kết hydro. Do cấu tạo hoá học của các nucleobase mà liên kết hydro

chỉ hình thành giữa 2 loại nucleobase nhất định là A với T (qua 2 liên kết hydro) và C
với G (bằng 3 liên kết hydro). Đó thực chất là liên kết giữa một purine và một
pyrimidine nên khỏang cách tương đối giữa 2 chuỗi polynucleotide được giữ vững.
Nguyên tắc hình thành liên kết trên được gọi là nguyên tắc bổ sung và nó phổ biến trên
mọi loài sinh vật.
3. Cấu trúc RNA
Ribonucleic acid (RNA) là một loại nucleic acid nhưng khác DNA ở chỗ có
dạng mạch đơn hoặc mạch vòng, chứa đường ribose thay vì deoxyribose và Uracil thay
cho Thymine.
Ở một số loài mà không có DNA (như virus), thì RNA đóng vai trò là vật chất
di truyền. RNA chủ yếu nằm trong tế bào chất, có cấu tạo đa phân do nhiều đơn phân
là ribonucleotide kết hợp lại. Mỗi ribonucleotit bao gồm : đường pentose(C
5
H
10
O
5
),
photphoric acid H
3
PO
4
, một trong bốn loại nitơ base (hợp chất base có chứa nguyên tử
nitơ): Adenine (A), Guanine (G), Uracil (U), Cytosine (C). Các ribonuleotide được liên
kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị giữa đường của ribonucleotide này với H
3
PO
4

của ribonucleotide kế tiếp, tạo thành chuỗi polyribonucleotide

RNA có vai trò trong các quá trình phiên mã và dịch mã thông tin di truyền và
được chia làm ba loại chính:
 RNA thông tin (kí hiệu: mRNA, viết tắt từ messenger RNA): gồm một
sợi polynucleotide dạng thẳng, có chức năng sao chép thông tin di truyền từ gen cấu
trúc đem đến ribosome là nơi tổng hợp protein.
 RNA vận chuyển (kí hiệu: tRNA, viết tắt từ transport RNA): là một mạch
polynucleotide có từ 80 đến 100 ribonucleotit tự xoắn như hình chạc ba nên một số
đoạn có nguyên tắc bổ sung A-U; G-C. Có những đoạn không có nguyên tắc bổ sung,
những đoạn này tạo thành các thùy tròn. Một trong các thùy tròn mang bộ ba đối mã .
Một sợi mút của sợi RNA 3' gắn với một acid amin và đầu mút tự do 5' . Mỗi tRNA chỉ
vận chuyển một loại amino acid ứng với bộ ba đối mã mà nó mang. Các amino acid sẽ
được vận chuyển đến ribosome để tổng hợp protein .
 RNA ribosome (kí hiệu: rRNA, ribosome RNA): gồm một mạch dạng
xoắn tương tự tRNA. Nó cùng với các phân tử protein cấu trúc nên ribosome.
Bên cạnh ba loại RNA trên đã được nghiên cứu khá kỹ, vai trò của một số loại
RNA khác mới được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 20 hay đầu thế kỷ 21.
Chúng điều khiển hoạt động gen hoặc tham gia vào các quá trình phát triển, biệt hoá tế
bào như RNAi (RNA interference) hay microRNA, tham gia phản ứng đọc sửa thông
tin di truyền trên phân tử mRNA (hiện tượng RNA editing) hay quyết định tính bền
vững của mRNA (các ribonuclease).
4. Cấu trúc hệ gen
Hệ gen (hệ gen) là toàn bộ các gen trong một cá thể sinh vật. Nó chứa mọi thông
tin di truyền đặc trưng cho từng loài, thậm chí cho từng cá thể trong loài. Hệ gen có thể
bao gồm các phân tử DNA hoặc RNA.
Ở các sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% hệ gen nằm trong nhân tế bào và phần
còn lại nằm trong một số bào quan như ty thể và lạp thể. Đa số hệ gen vi khuẩn và
phần hệ gen chứa trong các bào quan thường có kích thước nhỏ và ở dạng vòng khép
kín. Ngược lại, phần hệ gen trong nhân thường rất lớn và phân bố trên các nhiễm sắc
thể dạng thẳng.

Hệ gen ty thể của người: gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein.
Hệ gen của bào quan mã hóa cho một số, không phải tất cả, các protein được tìm
thấy trong bào quan. Do có nhiều bào quan trong một tế bào, cho nên có nhiều hệ gen
của bào quan trên một tế bào. Mặc dù bản thân hệ gen của bào quan là duy nhất.
Nhưng nó cấu tạo gồm một chuỗi lặp lại1 liên quan với mỗi chuỗi không lặp lại2 của
nhân. Về nguyên tắc, các gen bào quan được phiên mã và dịch mã bởi các bào quan.
Kết quả bước đầu so sánh hệ gen giữa các loài sinh vật với nhau đã cho thấy có
ba đặc điểm nổi bật: 1) các gen phân bố trong hệ gen không theo qui luật, 2) kích thước
của hệ gen thay đổi không tỷ lệ thuận (tương quan) với tính phức tạp của loài, 3) số
lượng nhiễm sắc thể cũng rất khác nhau ngay giữa những loài rất gần nhau.
4.1.Thành phần và đặc điểm của hệ gen
Kích thước hệ gen thay đổi mạnh giữa các loài. Ví dụ, đối với sinh vật bậc cao,
kích thước hệ gen chứa từ 10
9
bp (động vật có vú) đến 10
11
bp (thực vật). Khác với tế
bào tiền nhân (prokaryote), các gen trong hệ gen của eukaryote thường tồn tại nhiều
bản sao và thường bị gián đoạn bởi các đoạn mã mù không mang thông tin di truyền
(các intron).
Tỉ lệ các gen hoạt động trong hệ gen cũng khác nhau trong sinh giới. Không
phải tất cả các đoạn DNA trong hệ gen đều tương ứng với các gen (mã hóa cho protein
hoặc một sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống của tế bào). Một gen được xem là một
đoạn DNA mã hóa cho một sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của tế bào. Rõ
ràng rằng không phải chỉ có DNA mã hóa cho protein mà cả các DNA mã hóa cho
rRNA, tRNA và các loại RNA khác tham gia vào những phương thức kiểm soát hoạt
động của hệ gen cũng được xác định là gen. Từ những năm 1970, bằng các thí nghiệm
gây bão hòa đột biến người ta đã có thể xác định được số gen nằm trên một đoạn nhiễm
sắc thể. Ngày nay, nhờ các kỹ thuật phân tích DNA và RNA hiện đại (Southern blot,
Northern blot, microarray, ) các nhà khoa học có thể xác định số gen hoạt động trong

một tế bào. Ví dụ: ở tế bào nấm men S. cerevisiae (sinh vật eukaryote bậc thấp) có
khoảng 4.000 gen hoạt động, còn tế bào động vật có vú khoảng 10.000-15.000 gen.
Như vậy, nếu độ dài trung bình của một gen khoảng 10 kb thì tổng số chiều dài các gen
hoạt động trong một tế bào cũng chỉ chiếm 1-2% hệ gen. Hay nói cách khác, chỉ một
phần rất nhỏ hệ gen mang thông tin di truyền cần thiết cho hoạt động sống của tế bào.
Vậy phần hệ gen còn lại có vai trò gì, và tính phức tạp của loài có liên quan gì với kích
thước hệ gen hay không?

Số lượng gen của sinh vật nhân chuẩn rất khác nhau, thay đổi từ 6.000-40.000 nhưng không
tương quan với kích thước hệ gen hoặc độ phức tạp của cơ thể.
4.2. Tính phức tạp của hệ gen
Kết quả nghiên cứu động học của các phản ứng lai được tiến hành giữa genomic
DNA với cDNA (complementary DNA-DNA bổ sung), giữa DNA với mRNA… cho
thấy hầu hết các gen hoạt động đều nằm trong thành phần DNA không lặp lại. Như
vậy, thành phần này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá tính phức tạp của hệ
gen. Hay nói cách khác, dựa vào thành phần DNA không lặp lại có thể biết được kích
thước hệ gen cũng như mức độ tiến hóa của loài. Nếu như kích thước hệ gen (ở trạng
thái đơn bội) được coi là một thông số động học (ký hiệu C), thì giá trị này đặc trưng
cho từng loài và không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tính phức tạp của loài. Ngược lại,
giá trị C phản ánh các đặc điểm sau: - Số lượng DNA mã hóa cho các sản phẩm cần
thiết đối với hoạt động sống của cơ thể rất nhỏ so với số lượng DNA có trong hệ gen. -
Có sự biến đổi rất lớn của giá trị C giữa một số loài mà tính phức tạp của chúng không
khác nhau nhiều.

Đường cong biểu diễn động học của phép lai nucleic acid. C0t1/2 phụ thuộc vào độ phức tạp
của hệ gen (genome) Sự hồi tính của DNA thường có dạng đường cong C0t (C: nồng độ DNA, t: thời gian),
đường cong biểu diễn đồ thị phân số của DNA được tái liên kết (1-C/C0) theo log của C0t. Hình trên trình bày
đường cong C0t của một số hệ gen đơn giản. Các đường cong có dạng tương tự nhau, nhưng giá trị C0t1/2 của
mỗi đường là khác nhau. Các hệ gen trong hình đại diện cho các nguồn DNA khác nhau (PolyU:PolyA, thực
khuẩn thể MS2, thực khuẩn thể T4 và vi khuẩn E. coli).

Hệ gen vi khuẩn được xem là chỉ chứa các đoạn DNA không lặp lại và các gen
thường tồn tại bản sao đơn. Ngược lại, hệ gen của eukaryote thường chứa các gen có
hai hoặc nhiều bản sao. Hơn nữa, trình tự nucleotide của các bản sao này có thể không
giống nhau hoàn toàn mặc dù sản phẩm protein mà chúng mã hóa có cùng một chức
năng. Các bản sao tương đồng của một gen được xếp chung vào một nhóm gọi là một
họ gen (gene family). Như vậy, ngoài các gen có một bản sao giống như ở vi khuẩn, hệ
gen của eukaryote còn chứa các họ gen. Hầu hết các gen mã hóa cho protein đã được
phân lập đều nằm trong các họ gen khác nhau. Các gen trong một họ thường hoạt động
theo thời gian và không gian. Điều đó có nghĩa, mỗi thành viên trong họ thường hoạt
động ở một thời điểm nhất định trong quá trình hình thành và phát triển cá thể hoặc
hoạt động trong các mô chuyên biệt. Khi một thành viên trong họ bị đột biến (bất hoạt)
thì thành viên khác có thể hoạt động thay thế.
4.3. Tính biến đổi trong hệ gen và sự trao đổi giữa các hệ gen
Nói chung, hệ gen có cấu trúc và tổ chức bền vững. DNA của hệ gen thường
không bị biến đổi bởi sự phát triển vô tính, nhưng thỉnh thoảng các trình tự của chúng
cũng có thể bị chuyển chỗ trong gen, bị cải biến, khuếch đại hoặc thậm chí biến mất,
như là một trường hợp tự nhiên. Trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm là một trong
những nguyên nhân gây ra biến đổi của hệ gen. Tuy nhiên, điều này xảy ra chủ yếu
trong tế bào sinh dục mà không có trong các tế bào soma.
Việc sắp xếp lại hệ gen chủ yếu là do các yếu tố di truyền di chuyển một cách tự
do trong hệ gen và được gọi tên chung là các yếu tố vận động (transposable elements,
transposons). Các yếu tố di truyền vận động được xếp vào ba nhóm chính tùy thuộc
vào tính độc lập của chúng:
 Nhóm thứ nhất gồm các yếu tố có khả năng di chuyển giữa các vị trí khác
nhau trong hệ gen.
 Nhóm thứ hai gồm các yếu tố có khả năng ghép vào và tách ra khỏi hệ
gen để tồn tại độc lập trong tế bào (các episome như plasmid F, bacteriophage).
 Nhóm thứ ba chỉ di chuyển dưới sự kiểm soát của tế bào ở những giai
đoạn sinh trưởng phát triển nhất định để sắp xếp khởi động một số gen đặc biệt (hình
thành cassette hoạt động ở nấm men S. cerevisiae, ký sinh trùng đơn bào

Trypanosome).
Sự di chuyển của các yếu tố ở nhóm thứ hai và thứ ba liên quan tới tái tổ hợp
tương đồng hoặc tái tổ hợp ở các vị trí đặc hiệu. Mặc dù không có khả năng tồn tại độc
lập bên ngoài hệ gen, nhóm thứ nhất tự kiểm soát sự di chuyển của chúng trong hệ gen
và không đòi hỏi sự tương đồng giữa chúng với vị trí ghép vào. Chính các yếu tố di
truyền có khả năng di chuyển giữa các vị trí trong một hệ gen hoặc giữa các hệ gen
khác nhau đã góp phần làm đa dạng di truyền giữa các cá thể trong loài. Việc sắp xếp
lại hệ gen sẽ dẫn đến những thay đổi sau:
 Tạo ra các gen mới cần thiết cho sự biểu hiện trong các trường hợp đặc
biệt.
 Sự tái sắp xếp có thể đáp ứng cho việc mở hoặc đóng gen. Đây cũng
chính là cơ chế của sự điều hòa biểu hiện gen.
Các hệ gen còn có thể trao đổi gen tạo ra các hệ gen tái tổ hợp tự nhiên. Ví dụ
điển hình là sự di chuyển DNA từ hệ gen vi khuẩn sang hệ gen thực vật được nghiên
cứu khá kỹ đối với tương tác giữa Argobacterium tumefaciens hoặc A. rhizogenes với
hầu hết các cây hai lá mầm. Hiện tượng di chuyển DNA này gây những biến đổi về mặt
di truyền, biểu hiện ở việc xuất hiện các khối u trên thân cây (A. tumefaciens) hoặc
mọc rất nhiều rễ tơ (A. rhizogenes) tại nơi bị nhiễm vi khuẩn.

Chương 3: Lịch sử nghiên cứu và tách nucleic acid

Các nucleic acid được tách chiết thường là DNA hệ gen, mRNA hoặc DNA
plasmid để sử dụng cho các nghiên cứu và phân tích tiếp theo.

1. Lịch sử nghiên cứu nucleic acid
Năm 1953, Watson và Crick khám phá ra cấu trúc xoắn kép của DNA, đánh dấu
sự ra đời chính thức của sinh học phân tử, mở ra cánh cửa mới cho công nghệ sinh học
hiện đại.
Nucleic acid là những hợp chất cao phân tử đóng vai trò hết sức quan trọng
trong hoạt động sống của mọi cơ thể sinh vật. Chúng tham gia vào các quá trình cơ bản
của sự sống như sinh tổng hợp protein, sinh trưởng, sinh sản và di truyền.
Trong một thời gian dài các nhà hóa học và các nhà nghiên cứu về sinh lý dinh
dưỡng đã coi protein, lipid và carbonhydrate là ba chất quan trọng nhất tạo nên cơ thể
sống. Quan điểm cho rằng nucleic acid là những cấu tử trơ của nhân và tế bào chất đã
mãi mãi lãng quên từ khi chất thứ tư này – nucleic acid được chứng minh là chất quan
trọng hơn so với các chất trước đó.
Năm 1869, lần đầu tiên nhà hóa sinh học trẻ tuổi người Thụy Sĩ Friedrich
Miescher (1844 -1895) đã phát hiện nucleic acid trong nhân tế bào. Ông đã đặt tên là
nuclein vì nhận thấy nó tồn tại ở trong nhân tế bào (nucleus).
Đối tượng nghiên cứu của Miescher là những bạch cầu (lymphocytes). Khi dùng
acid kết tủa dịch chiết xuất từ nhân của tế bào mủ lấy từ bông băng bỏ đi (bằng cách
dùng enzyme phân hủy protein của dịch dạ dày là pepsin để tiêu hóa các phần khác
giàu protein của tế bào) ông đã vô cùng ngạc nhiên nhận thấy rằng, nhân tế bào chứa
một chất không phải mỡ, không phải carbonhydrate, cũng không phải protein. Nó cũng
không giống một chất sống nào đã biết và chứa phosphor và nitơ, hòa tan thì cho tính
acid. Từ "nucleic acid" là do Altman đề nghị năm 1889 (ông đã phát hiện ra rằng đối
tượng thuận tiện tốt nhất để chiết rút chất nuclein là những đầu tinh trùng của cá hồi).
Và thực chất mỗi đầu tinh trùng của cá hồi hoàn toàn tương ứng với một nhân tế bào.
Để điều chế chế phẩm nucleic acid, Miescher đã hòa tan phần đầu của tinh trùng (tế

bào sinh dục đực) trong dung dịch muối nồng độ cao, sau đó bằng cách thêm nước vào
đã gây ra kết tủa nucleic acid ở dạng sợi. Cần phải giữ chế phẩm lạnh do đó trong các
ngày đông tháng giá của mùa đông, ông đã làm việc trong phòng không sưởi.
Thực tế, lịch sử nghiên cứu hóa học của nucleic acid gắn liền với tên tuổi của
Felix Hoppe - Seiler (1825-1895), nhà sinh lý học và hoá học rất nổi tiếng người Đức
vì chính ở phòng thí nghiệm của ông ở Tübingen, Miescher đã làm việc với danh nghĩa
là người học trò và cộng tác viên khoa học trẻ. Mặc dù Miescher là một cộng tác viên
vô cùng cẩn thận và đầy triển vọng song Hoppe - Seiler vẫn thấy cần thiết phải đích
thân lặp lại thí nghiệm xem có đúng là một chất mới hay không. Kết quả thực nghiệm
không những khẳng định thành tựu của Miescher mà còn thu được thêm nhiều dẫn liệu
mới rất đặc trưng. Hoppe - Seiler còn phát hiện trong nhân tế bào nấm men cũng có
chất nuclein giống như ở tế bào bạch cầu.
Người kế tục phát triển công trình của Miescher là nhà hóa sinh học (hóa học
hữu cơ) người Đức Albrecht Kossel (1853 - 1927). Năm 1882, ông đã phân tích
nucleic acid ra những phần nhỏ chứa acid phosphoric, đường và base chứa nitơ (Kossel
đã tách được hai pyrimidine và đặt tên là cytosine và thymine, cũng như hai purine với
tên adenine và guanine). Do công trình này ông đã đạt giải Nobel về y và sinh lý học
vào năm 1910. Một pyrimidine khác là uracil cũng đã được phát hiện sau này.
Trong những năm đầu của thế kỷ XX (1900 - 1932), nhà hóa sinh học người Mỹ
gốc Nga Phoebus Aaron Theodore Levene (1869 - 1940) đã xác định được đơn vị cấu
tạo của nucleic acid là các nucleotide (hay mononucleotide) và phân biệt được hai loại
nucleic acid: deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA).
Như vậy, cho đến năm 30 của thế kỷ XX này, người ta đã biết được thành phần
của các nucleic acid. Levene đã đoán trước 4 nucleotide khác nhau liên quan đến RNA
là adenylic acid (chứa adenine), guanilic acid (chứa guanine), cytidilic acid (chứa
cytosine) và uridic acid (chứa uracil). Ông cũng giả thiết 4 nucleotide tiếp theo liên
quan đến DNA là deoxyadenilic acid, deoxyguanilic acid, deoxythymidilic acid (chứa
thymidine) và deoxycytidilic acid (chứa cytosine).
Do các giả thiết này của Levene tỏ ra phù hợp với hiểu biết của hóa học cho nên
chúng sớm được các nhà hóa học chấp nhận. Nhưng cho đến thời kỳ đầu những năm

1950, chúng vẫn chưa được chứng minh rõ ràng khi nhà hóa sinh học người Anh
Alexander Robertus Todd (1907-1997) chưa tổng hợp được các nucleotide phù hợp
một cách chính xác với các công thức của Levene. Todd đã xác nhận được rằng các
chất này thực tế giống các hợp chất đã thu nhận được từ nucleic acid. Với công trình
này, Todd đã được trao giải thưởng Nobel về hóa học năm 1957.
Trong những năm 1949 - 1953 nhà sinh học người Mỹ gốc Áo Erwin Chargaff
(1905 - 2002) khi phân tích DNA đã phát hiện sự cân bằng của các base trong DNA: số
nhóm purine bằng số nhóm pyrimidine (purine/pyrimidine = 1), số nhóm adenine bằng
số nhóm thymine (adenine/thymine = 1), số nhóm guanine bằng số nhóm cytosine
(guanine/cytosine = 1). Về sau này người ta đã đặt quy tắc mang tên ông về tổng lượng
các loại nucleotide cấu tạo nên các DNA.
Trong những năm đầu thập niên 1950, hai nhà vật lý học người Anh, Maurice
Hugh Frederick Wilkins (1916 - 2004) cùng với Rosalind Franklin (1920 - 1958) bắt
đầu tiến hành các nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc DNA. Wilkins là con trai của một
bác sĩ người New Zealand chuyên học vật lý và vào thời kỳ đầu cuộc Chiến tranh Thế
giới thứ hai, ông làm việc cho sự phát triển bom nguyên tử. Nhưng sau cuộc Thế chiến
này, ông dùng tất cả sức lực của mình cho công việc nghiên cứu DNA và đã trở thành
một trong những nhà bác học tiên phong trong lĩnh vực này nên được coi là nhà lý sinh
học. Wilkins và Franklin đã áp dụng phương pháp nhiễu xạ Rơnghen (X-ray
diffraction) vào việc nghiên cứu cấu trúc tinh thể của DNA (lấy từ tuyến ức bê,
thymus). Với những bức ảnh chụp cấu trúc tinh thể DNA có dạng chữ thập, hai tác giả
này gợi ý rằng DNA có thể gồm hai hoặc ba mạch đơn bện xoắn với nhau.
Năm 1953, từ các nghiên cứu của mình kết hợp với các kết quả nghiên cứu
trước đó của Chargaff và Wilkins, hai nhà khoa học ở trường Đại học Tổng hợp
Cambridge là Francis Harry Compton Crick (England; 1916-2004) và James Dewey
Watson (USA; 1928-2003) đã xây dựng thành công mô hình chuỗi xoắn kép của phân
tử DNA. Với công trình này, Watson và Crick đã được trao giải thưởng Nobel về y học
và sinh lý học năm 1962. Từ đó Crick đã xây dựng một chuỗi xoắn kép DNA bằng
đồng trong vườn nhà ông ở trung tâm Cambridge, sau đó đã viết: "Người ta hỏi tôi là
khi nào thì sẽ mạ vàng".

Cùng với việc nghiên cứu cấu trúc DNA, các nhà khoa học cũng đã nỗ lực tìm
hiểu vai trò và các chức năng sinh học của nó. Vào năm 1944, nghĩa là sau 75 năm kể
từ khi phát hiện DNA trong nhân tế bào năm 1869, nhà vi khuẩn học người Mỹ
Oswwald Theodore Avery (1877 - 1955) đã chứng minh DNA là chất liệu di truyền khi
bổ sung DNA chiết xuất từ chủng độc (chủng không độc của phế cầu khuẩn
Diplococcus pneumoniae biến thành chủng độc gây viêm phổi và làm chết chuột bắt
nguồn từ thí nghiệm biến nạp của F. Grifith năm 1928) vào môi trường nuôi cấy và kết
hợp với việc xử lý bằng DNase. Điều đó chứng tỏ DNA quyết định tính chất di truyền
của phế cầu khuẩn.
Năm 1952, Alfred Day Hershey (1908 - 1997) và Martha Chase (1927 - 2003)
cho biết, bằng đồng vị phóng xạ có thể theo dõi sự di chuyển của protein và DNA của
virus (cơ sở là DNA chứa phosphor, protein chứa lưu huỳnh mà không chứa phosphor;
vì vậy DNA virus có thể được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ phosphor, còn protein
virus được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ lưu huỳnh). Khi đánh dấu một số hạt virus
ở phần protein và một số hạt virus ở phần DNA rồi đưa vào môi trường nuôi cấy vi
khuẩn chủ E. coli thì thấy DNA virus nhanh chóng thâm nhập vào tế bào chủ, còn phần
protein thì không. Thí nghiệm cũng đã chứng minh tầm quan trọng về mặt di truyền
của DNA.
Năm 1955, nhà hóa sinh học Mỹ Fraenkel-Konrad (1910 - ) đã chia virus ra làm
hai phần và sau đó nối được hai phần đó lại, phần protein không gây nhiễm (không
chui vào tế bào vật chủ) còn phần DNA thì gây nhiễm. Thí nghiệm của Krauss trên
hồng cầu người chứng minh sự liên quan giữa cấu trúc hóa học của protein với vai trò
di truyền của DNA (khi đưa DNA chiết xuất từ hồng cầu non của người lành vào tủy
xương bệnh nhân thiếu máu hình lưõi liềm (có HbS không bình thường) thì thấy
hemoglobin bình thường được tổng hợp. Điều đó chứng tỏ DNA quyết định cấu trúc
đặc hiệu của protein.
Các thí nghiệm sau đó của các nhà khoa học đã chú trọng vào việc tổng hợp
DNA. Năm 1956 Severo Ochoa (1905 - 1993) và Arthur Kornberg (1918 - ) - hai nhà
khoa học người Mỹ đã tổng hợp DNA in vitro bằng cách trộn enzyme DNA
polymerase I được chiết xuất từ E. coli với các dNTP, DNA khuôn (DNA tự nhiên) và

Mg++, DNA thu được không khác DNA tự nhiên. Hai nhà khoa học này đã được nhận
giải thưởng Nobel về y học và sinh lý học vào năm 1959.
Năm năm sau khi công bố công trình cấu trúc xoắn kép của DNA vào năm
1958, Matthew Stanley Meselson (1930 - ) và Franklin William Stahl (1928 - ) đã
chứng minh bằng thực nghiệm dự đoán trên là hoàn toàn có cơ sở. Bằng cách nuôi vi
khuẩn E. coli ở môi trường chứa nitơ nặng 15N sau đó bằng 14N bình thường rồi theo
dõi qua các thế hệ, xem sự thay đổi tỷ trọng của DNA qua máy ly tâm siêu tốc (siêu ly
tâm); hai nhà khoa học đã xác định được cơ chế tái sinh bán bảo tồn của DNA.
Về việc nghiên cứu RNA, cho đến cuối những năm 30 của thế kỷ XX, các nhà
khoa học vẫn nghĩ rằng DNA là đặc trưng của các tế bào động vật, còn RNA chỉ có thể
gặp được ở trong nấm men và các tế bào thực vật. Nguồn quan trọng nhất của DNA lúc
này là tuyến ức (thymus), còn đối với RNA là nấm men.
Các nghiên cứu chính xác hơn sau này đã cho thấy cả hai loại nucleic acid đều
có mặt trong tất cả các tế bào động vật và thực vật.
Năm 1939, các nhà nghiên cứu Torbjorn Oskar Caspersson (Thụy điển; 1910 -
1997) và Jean Brachet (Bỉ; 1909 - 1998) đã chứng minh sự tổng hợp mạnh mẽ protein
trong bào tương cùng xảy ra với sự tổng hợp manh mẽ RNA.
Năm 1956, S. Ochoa (nhà hóa sinh học người Mỹ) đã dùng enzyme RNA
polymerase được chiết xuất từ vi khuẩn Azobacter vineladni để tổng hợp RNA in vitro.

Năm 1956, George Emile Palade (1912 - ) đã chứng minh microsome có chứa
những hạt có nhiều RNA gọi là thể ribo tức là ribosome (55% RNA, còn lại là protein).
Năm 1961, Francois Jacob (1920 - ) và Jacques Lucien Monod (1910 - 1976)
nêu vấn đề có một loại RNA khác có đặc điểm chuyển hóa nhanh chóng và có cấu tạo
tương tự DNA. Đó là mRNA, là chất trung gian chuyển thông tin từ DNA đến chuỗi
polypeptide được tổng hợp.
Trước đó vào năm 1958, M. B. Hoagland (nhà hóa sinh học người Mỹ) đã
nghiên cứu vấn đề đưa amino acid vào ribosome. Ông đã xác định là trước khi tham
gia tổng hợp protein, amino acid được kết hợp với RNA vận chuyển (tRNA) để vận
chuyển amino acid từ bào tương vào ribosome.

V
ới những phương pháp thí nghiệm
khác nhau các phòng thí nghiệm của Marshall Warren Nirenberg (1927 - ), Har Gobind
Khorana (1922 - ) và Ochoa đã xác định được các bộ ba mật mã của toàn bộ 20 amino
acid vào những năm 1961 - 1965.
Do vai trò quan trọng của nucleic acid trong hoạt động sống của cơ thể sinh vật,
cho nên việc nghiên cứu nucleic acid ngày càng được chú trọng. Từ những năm 70 của
thế kỷ XX trở lại đây, nhất là trong 10 năm cuối của thế kỷ và những năm đầu của thế
kỷ XXI này, hiểu biết về nucleic acid ngày càng được mở rộng.

2. Nguyên lý chung
Tách chiết nucleic acid nhằm thu nhận DNA hệ gen, mRNA hoặc DNA
plasmid với lượng đủ lớn, đủ tinh sạch và ở trạng thái nguyên vẹn để sử dụng cho các
nghiên cứu và phân tích tiếp theo. Nó bao gồm các bước chính như: phá vỡ các thành
phần tế bào, tinh sạch, đánh giá chất lượng và đo nồng độ,

3. Tách RNA so với tách DNA
Tách RNA là bước đầu tiên để thu nhận mẫu cho các phân tích tiếp theo như
Northern blot, phép thử bảo vệ nuclease, RT-PCR, lập bản đồ RNA, dịch mã in vitro
hay xây dựng thư viện cDNA.
Khi làm việc với RNA, một phân tử sợi đơn không bền nhiệt bằng DNA, lại dễ
bị phân hủy bởi RNase luôn sẵn có trong phòng thí nghiệm và tay người, nên các thao
tác thí nghiệm đòi hỏi nhiều kỹ năng hơn.
Trước hết, là vấn đề xử lý với RNase. Để giảm thiểu tác động của RNase, chúng
ta luôn phải đeo găng tay, sử dụng pipett, ống nghiệm và dụng cụ sạch RNase. Các
enzyme này có thể được xử lý bằng dung dịch DEPC, tuy nhiên khi sử dụng dung dịch
này phải hết sức thận trọng vì nó có tiềm năng gây ung thư.
Thứ hai, là bảo quản RNA sau khi tách. Có nhiều cách bảo quản. Trong thời
gian ngắn, chúng ta có thể sử dụng dung dịch 0.1 mM EDTA hoặc đệm TE (10 mM
Tris, 1mM EDTA) trong nước sạch RNase. Trong thời gian dài, RNA thường bền ở -

80°C trong dung dịch EDTA hoặc ở -20°C trong ethanol 96%.
Thứ ba, RNA có thể được kết tủa với alcohol hoặc LiCl. Kết tủa RNA với
alcohol (ethanol hoặc isopropanol) yêu cầu một nồng độ tối thiểu của các ion hóa trị I
như Na+, K+, NH
4
+ Sau khi điều chỉnh nồng độ muối, RNA có thể được kết tủa với
2,5 lần thể tích ethanol hay 1 lần thể tích isopropanol, trộn đều, ủ lạnh ở -20° C trong
vòng 15 phút.





Chương 4: Nhân gen PCR

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổnghợp dây chuyền
nhờ polymease) là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh
vực Sinh học phân tử. Phương pháp này do Kary Mullis phát minh vào năm 1983 và
được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm
1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá học vào năm 1993.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA
riêng biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có
mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
1. Nguyên lý của PCR
Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của
DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các
suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng
ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm
biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt
động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100

o
C. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị
biến tính. Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR bao gồm:
1.1. DNA mẫu (DNA template)
Đây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối
ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA
thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng
giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng). Lượng
DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra. PCR còn cho phép khuyếch đại
cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy từng phần
như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, tóc, móng tay của người chết
1.2. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng
dây chuyền tổng hợp DNA. Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ
sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều
ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse
primer).
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản
ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:
+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) gần
như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.
+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thông thường là 18-24 base) để quá
tr.nh lai xảy ra tốt hơn.
+ Mồi phải đặc hiệu có nghĩa là nó phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được
khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
+ Không có nút cài tóc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh tr.nh tự đối
xứng bậc hai (palindromic sequences) có thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định do
đó hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu.
+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm
primer dimer.

+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt
độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, v. G và C có 3 liên kết
hydro do đó sự polymer hoá sẽ tốt hơn.
+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng
đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đoán, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi khi
đã bám vào DNA khuôn là 150-500 base.
1.3. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc
gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt sống
trong suối nước nóng 80-95 oC. Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở
nhiệt độ cao, có tên là Thermus aquaticus. Hai mươi năm sau, các nhà khoa học của tập
đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy rằng DNA
polymerase từ Thermus aquaticus (Tagpolymerase) có khả năng giải quyết vấn đề của
enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng
PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase.
Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta
đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng
PCR như Vent- polymerase (Tlipolymerase), Pfu- polymerase, rTth
1.4. Các loại nucleotid
Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạng
deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản ứng
(200µM/loại nucleotid).
1.5. Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào,
không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế Nói cách khác là không chứa bất
kỳ một thành phần nào khác.
1.6. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 200mM Tris-Cl pH 8.8,
20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100).
1.7. Ion Mg2+

Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nó
tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 µM. Người ta thấy
rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn.