thực hành vi sinh vật

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CN THỰC PHẨM



BIÊN SOẠN
TS. Nguyễn Minh Trí
ThS. Nguyễn Thị Thanh Hải







THỰC HÀNH
VI SINH VẬT






Họ và tên SV:
MSSV:
Lớp:
Nhóm:

NHA TRANG 2012
2

MỤC LỤC

Trang

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 2
Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT 4
Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 12
Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT 16
Bài 5: CÁC ĐẶC ĐIỂM VỀ SINH HÓA 20
Bài 6: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP 24
Bài 7: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU 25
Bài 8: KIỂM TRA SƠ BỘ MẪU THỰC PHẨM BẰNG KÍNH HIỂN VI 26
Bài 9: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ (APC – AEROBIC PLATE COUNT) 27
Bài 10: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI 29
Bài 11: SALMONELLA 33
Bài 12: VIBRIO 34
Bài 13: STAPHYLOCOCCUS AUREUS 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 40
3

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Thực hành Vi sinh vật đại cương nhằm trang bị cho người học một số kỹ năng cơ bản,
giúp bước đầu tìm hiểu về thế giới vi sinh vật rộng lớn. Phần trình bày ở đây liên quan đến vi
khuẩn, nấm men và nấm mốc. Chúng ta sẽ tìm hiểu về cả hai nhóm vi sinh vật có lợi và có
hại.
Nhằm tránh không gây tạp nhiễm, ảnh hưởng đến thí nghiệm hay không gây phân tán
vi sinh vật ra môi truờng xung quanh, cần thực hiện các thao tác cấy đúng kỹ thuật. Việc này
liên quan đến việc học các kỹ thuật vô trùng và thực hành phương tiện an toàn phòng thí
nghiệm. Chúng ta cần phải biết và thực hiện đúng các quy định trong phòng thí nghiệm.
Lịch thí nghiệm:
Trước khi đến phòng thí nghiệm, bạn phải biết bài thí nghiệm sắp làm, phải chuẩn bị
hiểu bài trước khi đến phòng thí nghiệm.
Mỗi buổi thí nghiệm đều bắt đầu bằng phần trình bày và thảo luận các ý chính. Do
vậy, điều quan trọng là không đến lớp trễ.
Vật dụng cá nhân:
Để đúng nơi quy định
Trang phục:
Phải mặc áo bảo hộ (blouse) khi làm việc trong phòng thí nghiệm. Áo bảo hộ giúp bạn
tránh nhiễm vi sinh vật khi xảy ra sự cố, tránh vấy bẩn hoá chất và thuốc nhuộm. Khi ra khỏi
phòng thí nghiệm phải cởi áo bảo hộ. Tóc phải được cột, bọc gọn tránh nhiễm vi sinh và sém
cháy do lửa đèn cồn.
THUẬT NGỮ
Một số thuật ngữ cần phân biệt:
Vô trùng là 1 quá trình mà tất cả các vi sinh vật sống bị phá huỷ. Các vi sinh vật này
bị giết bởi hơi nóng áp lực hay ở nhiệt độ cao trong điều kiện khô, hay đốt thành tro. Nếu
chúng ta nói một vật vô trùng, chúng ta hiểu rằng vật đó hoàn toàn không có các vi sinh vật
sống. Nói chung khi nói đến sự vô trùng, ý nói đến sự an toàn phòng thí nghiệm, chủ yếu
chúng ta nói đến vô trùng bởi hơi nóng áp lực bằng autoclave. Phương pháp khử trùng cơ bản
là đốt cháy các tác nhân khử trùng hoặc đốt thành tro. Tất cả các chất thải sinh học phải được

đốt cháy kỹ trước khi thải bỏ.
Khử trùng là quá trình trong đó các sinh vật không sinh bào tử, sinh dưỡng bị phá
huỷ. Các tác nhân gây được quá trình này gọi là chất khử trùng hay chất giết khuẩn. Các tác
nhân như vậy chỉ được sử dụng cho các vật dụng do chúng độc với mô người và động vật.
Nhiễm trùng được xác định khi có sự phát triển (nhân lên) của các vi sinh vật trong
mô của cơ thể. Thuật ngữ vô trùng dùng để chỉ bất cứ quá trình nào mà ngăn cản sự xâm
nhập của các tác nhân nhiễm trùng vào mô vô trùng, do vậy ngăn ngừa sự nhiễm trùng. Các
kỹ thuật vô trùng chỉ những thao tác mà các nhà vi sinh vật học dùng để loại tất cả các vi
sinh vật khỏi môi trường nhiễm hay mô sống tiếp xúc. Các chất kháng khuẩn là các hoá
chất (thường là các chất khử khuẩn hoà tan) có thể sử dụng an toàn cho bên ngoài cơ thể
nhằm phá huỷ hay ức chế các vi khuẩn sinh dưỡng.
CÁC KỸ THUẬT VÔ TRÙNG
Khi bắt đầu làm vệc với các canh cấy vi khuẩn trong các bài trình bày ở sau, bạn phải
học các kỹ thuật. Một số điều cơ bản chúng ta phải tuân theo:
- Rửa tay
Trước khi bắt đầu làm việc ở phòng thí nghiệm bạn phải rửa tay. Sử dụng các dung
dịch sát khuẩn. Lau khô bằng giấy lau. Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thí nghiệm,
chúng ta phải rửa tay bằng xà phòng.
4

- Khử trùng mặt bàn làm việc
Bắt đầu buổi làm việc phải lau bàn bằng chất diệt khuẩn quá trình này nhằm loại bụi
bẩn có trên mặt bàn, làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn các canh cấy mà chúng ta làm
việc. Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thí nghiệm, chúng ta phải tiến hành khử trùng
lại để bảo vệ cho người học ở buổi thực hành tiếp theo.
- Sử dụng đèn cồn (đèn gas)
Trong phòng thí nghiệm vi sinh thường sử dụng đèn cồn để khử trùng vòng cấy của
que cấy, miệng bình, miệng ống nghiệm.
Để khử trùng vòng cấy cần đốt cho đến khi nóng đỏ. Để không giết chết vi sinh vật
mà chúng ta muốn cấy chuyền, trước khi đưa que cấy vào canh cấy, cần để cho vòng cấy

nguội xuống bằng cách giữ vòng cấy ở vùng vô trùng xung quanh ngọn lửa một thời gian.
Để an toàn khi sử dụng đèn cồn, cần lưu ý không di chuyển đèn cồn khi đang cháy.
Không dùng miệng thổi tắt đèn cồn, phải dùng nắp chụp đậy lại.
- Pipette.
Để chuyển canh cấy bằng pipette phải sử dụng thiết bị hút cơ học, Không sử dụng
miệng để hút.
- Thải bỏ canh cấy
Các bình, ống nghiệm, hộp lồng nuôi cấy vi sinh vật trước khi thải bỏ, phải được hấp
khử trùng (autoclave) để giết chết vi sinh vật.
XỬ LÝ KHI LÀM ĐỔ CANH CẤY
Tất cả các trường hợp sự cố làm đổ canh cấy vi sinh vật phải báo cáo ngay với giáo
viên hướng dẫn. Mặc dù đa số các vi sinh vật sử dụng trong các bài thực hành là không gây
bệnh, nhưng có một số ít gây bệnh. Do vậy, chúng ta phải xử lý tất cả các trường hợp sự cố
làm đổ dịch cấy, phòng khi có liên quan đến vi sinh vật gây bệnh. Biện pháp xử lý:
- Tất cả áo bảo hộ, vải lau dính dịch cấy phải được đem autoclave.
- Dùng giấy, vải thấm dịch sát khuẩn đặt vào vùng canh cấy đổ.
- Đổ thuốc sát khuẩn quanh nơi có canh cấy vi sinh, để hạn chế lây lan ra xung quanh
và không khí.
- Dùng kẹp (loại có thể hấp tiệt trùng được) gắp giấy, vải lau bỏ vào dụng cụ chứa đựng
đem autoclave (autoclave cả kẹp gắp)
(Tương tự, đối với hoá chất gây nguy hiểm đến người như gây kích ứng cơ thể, gây
tổn thương da hay gây ung thư phải báo cáo ngay với giáo viên hướng dẫn để có biện pháp
xử lý thích hợp)
CÁC QUY ĐỊNH QUAN TRỌNG KHÁC
1. Không được đem canh cấy vi sinh, hoá chất, dụng cụ ra khỏi phòng thí nghiệm trừ khi
bạn được phép của giáo viên hướng dẫn.
2. Không hút thuốc, ăn uống trong phòng thí nghiệm.
3. Không đưa tay lên sờ miệng.
4. Dọn dẹp, lau chùi sau khi làm việc. Lam kính, lá kính sau nhuộm soi cần rửa, làm khô
và để đúng nơi quy định.

5. Các dụng cụ, lọ hoá chất sau khi dùng xong phải để đúng nơi quy định.
6. Khi làm việc với các dụng cụ cần cẩn thận, nhất là đối với kính hiển vi. Khi không
hiểu vận hành như thế nào, bạn phải hỏi người phụ trách.
7. Hợp tác, làm việc cùng sinh viên khác trong nhóm, nhưng phải tự mình phân tích kết
quả thí nghiệm.

5

Hướng dẫn chung thực hành vi sinh vật thực phẩm

Để có thể làm việc tại phòng thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm, chúng ta cần nắm
vững một số vấn đề về lý thuyết và thực hành, nói chung có thể chia thành 3 nhóm vấn đề
lớn :
 Làm quen với phòng thí nghiệm vi sinh.
 Phân lập và định danh vi sinh vật
 Định tính và định lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm.

I. Làm quen với phòng thí nghiệm vi sinh.
Trước khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật, chúng ta cần tìm hiểu kỹ:
- Nội quy, quy định điều này giúp chúng ta tránh được: (1) làm lây lan vi sinh vật gây
bệnh, ảnh hưởng đến sức khỏe của bản thân và mọi người làm việc trong phòng thí nghiệm;
(2) Sai lệch thí nghiệm đang tiến hành của bản thân và của người khác.
- Bố trí của phòng thí nghiệm: Nơi để của hóa chất, thiết bị dụng cụ tránh phải mất
nhiều thời gian trong khi tìm hóa chất dụng cụ, cũng như sử dụng cac thiết bị có tại phòng thí
nghiệm và các phòng thí nghiệm liên quan.
- Cách sử dụng và bảo quản thiết bị dụng cụ. Điều này giúp không làm hư hỏng thiết
bị dụng cụ, thu nhận kết quả thí nghiệm chính xác, giảm được thời gian và chi phí thí
nghiệm.

II. Phân lập và định danh vi sinh vật.

Đây là công việc quan trọng của phòng thí nghiệm vi sinh vật. Chúng ta có thể xác
định được sự có mặt của một loại vi sinh vật đích trong một mẫu nghiệm qua các bước:
- Phân lập vi sinh vật đích. Sử dụng kỹ thuật cấy phân lập trên môi trường đặc trưng
chúng ta bước đầu phân tách vi sinh vật đích ra khỏi quần thể vi sinh trong mẫu nghiệm. Tìm
chọn các khuẩn lạc có biểu hiện giống với loại vi sinh vật cần tìm. Cấy chuyển sang ống
thạch nghiêng để giữ chủng và tiến hành định danh.
- Định danh chủng vi sinh phân lập được thường dựa vào: hình thái (nhuộm gram, soi
kính hiển vi dưới vật kính dầu), khảo sát các đặc tính nhu cầu sinh lý, các đặc điểm hóa sinh
khác.

III. Định tính và định lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Đối với phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm, chúng ta cần phải đánh giá các chỉ tiêu
vi sinh theo các tiêu chuẩn quy định xác định mẫu thực phẩm. Có thể xếp thành 2 nhóm là
định tính và định lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm.
- Một số vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm cho người tiêu dùng, nên trong thực phẩm
không được có mặt, các chỉ tiêu thường quy định không phát hiện trong 25 gam thực phẩm.
Ví dụ như Salmonella.
- Một số vi sinh vật gây bệnh được quy định ở một giới hạn nào đó. Ví dụ: S. aureus,
E. coli … Chúng ta phải tiến hành định lượng, theo phương pháp MPN, hoặc Phương pháp
đếm khuẩn lạc






6

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT

1. KÍNH HIỂN VI:
Hiện nay có rất nhiều loại kính hiển vi, một số loại được dùng phổ biến trong phòng
thí nghiệm vi sinh vật : kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, phản pha, và huỳnh
quang ; trong bài này chỉ trình bày kính hiển vi trường sáng. Nếu trước đây bạn đã tìm hiểu
về kính hiển vi, thì bài này sẽ không có nhiều thông tin cung cấp cho bạn ; tuy nhiên nếu đây
là lần đầu tiên tìm hiểu về vi sinh vật, bạn cần đọc kỹ để sử dụng đúng kính hiển vi.
Kính hiển vi là dụng cụ cần được chăm sóc đặc biệt để tránh hư hỏng hệ thống quang
học và cơ học. Thực tế kính hiển vi được nhiều người sử dụng và di chuyển nhiều dẫn đến dễ
hư hỏng kính so với chỉ do 1 người sử dụng. Bạn cần thực hiện đúng các chỉ dẫn khi sử dụng
kính.
KÍNH HIỂN VI TRƯỜNG SÁNG
Trong kính hiển vi trường sáng, tia sáng đi trực tiếp từ nguồn đến mắt người mà
không bị lệch hướng do tấm mờ nằm giữa tụ quang. Đây là loại kính được học sử dụng đầu
tiên dành cho người bắt đầu học về sinh học, thường đuợc sử dụng trong phòng thí nghiệm vi
sinh vật.
Tất cả các loại kính hiển vi trường sáng có cấu trúc chung, hơi khác về hệ thống cơ.
Bài tập sẽ giúp bạn hiểu được về các điểm giống và khác nhau giữa cac loại. Trước khi thao
tác trên kính cần đọc các bài tập và trả lời các câu hỏi trong bản tường trình.
CHĂM SÓC KÍNH
Kính hiển vi dễ hư hỏng, nếu bất cẩn sẽ không
sử dụng được. Cần thực hiện đúng các chỉ dẫn sau:
Vận chuyển: Khi chuyển kính hiển vi từ vị trí này
sang vị trí khác trong phòng thí nghiệm, phải đỡ dụng
cụ bằng cả hai tay. Nếu chỉ cầm 1 tay rất dễ va chạm
vào vật dụng khác. Không được cầm 2 tay 2 kính hiển
vi cùng một lúc, bất kể trong trường hợp nào.
Ngăn nắp: Giữ nơi soi kính ngăn nắp, cất sách vở,
dụng cụ không cần thiết. Vùng soi kính gọn gàng,
ngăn nắp sẽ ít xảy ra sự cố hơn.
Dây điện: Dây dẫn điện bóng đèn kính hiển vi rất dễ

làm sinh viên vấp, kéo kính hiển vi rơi xuống đất.
Chú ý dây điện sao cho mọi người đi lại trong phòng
thí nghiệm không bị vấp.
Lau chùi thấu kính: Bắt đầu buổi thí nghiệm kiểm tra xem các thấu kính đã sạch hay chưa.
Khi sử dụng dầu để soi kính, cuối buổi thí nghiệm phải lau vật kính bằng các dụng dịch lau
kính (nước ấm xà phòng, xylene, alcohol, cũng có thể dùng acetone nhưng chú ý acetone là
dung môi mạnh có thể làm tan keo gắn các thấu kính). Giấy lau sử dụng loại chuyên dùng,
không tạo xơ bụi khi lau, giấy sạch không bám bụi có thể làm trầy sướt kính. Bạn phải tuân
theo sự chỉ dẫn của Giáo viên phụ trách.
Bảo vệ chống bụi: Hầu hết các dụng cụ trong phòng thí nghiệm đều có tấm che phủ nhằm
bảo vệ dụng cụ khỏi bụi. Cuối buổi làm việc, cần đậy lại để chống bụi.
CÁC BỘ PHẦN CHÍNH CỦA KÍNH HIỂN VI
Khung đỡ gồm chân và thân kính
Bàn soi có bộ phận kẹp lam kính, vít trượt điều chỉnh vị trí lam kính trên bàn soi.
Hệ thống thấu kính gồm thị kính, vật kính và tụ quang.
Ốc chỉnh kính: ốc chỉnh kính thô và ốc chỉnh kính tinh.
Hình 1: Hai tay đỡ dụng cụ một
cách chắc chắn trong khi di
chuyển kính hiển vi.
7


Hình 2: Các bộ phận chính của kính hiển vi.
ĐIỀU CHỈNH KÍNH
Độ phóng đại: Độ phóng đại cuối cùng của ảnh soi được bằng độ phóng đại của thị
kính nhân với độ phóng đại của vật kính.
Soi kính ở vật kính có độ phóng đại thấp:
thường dùng vật kính 10x. Gồm các bước sau:
- Kẹp tiêu bản lên bàn soi đúng vị trí, chú ý mẫu
cần soi ở mặt trên.

- Bật nguồn sáng, chỉnh ở mức ánh sáng vừa
phải (chỉnh nguồn, tụ quang),
- Chỉnh mẫu soi đến vị trí trung tâm nguồn
sáng.
- Quay vật kính có độ phóng đại cần
soi vào đúng vị trí (lưu ý chốt định
vị vào đúng vị trí)
- Hạ vật kính đến vị trí thấp nhất hoặc
nâng bàn soi đến vị trí cao nhất tuỳ
theo kính hiển vi (vị trí này đã được
định trước để tránh vật kính chạm
vào lam kính làm vỡ lam)
- Mắt nhìn vào thị kính, từ từ nâng vật
kính (hoặc hạ bàn soi) cho đến khi
ảnh xuất hiện.
- Dùng ốc tinh chỉnh để có được ảnh
rõ nhất.
Hình 3: Kẹp tiêu bản
Hình 4: Đường đi của ánh sáng
8

- Dùng ốc điều chỉnh thanh trượt bàn soi để di chuyển lam kính tìm hình cần soi.
Soi kính ở vật kính có độ phóng đại cao hơn: thường dùng vật kính 40x.
- Sau khi chỉnh ở vật kính 10x có ảnh rõ, bạn xoay vật kính 40x đến vị trí cần soi.
- Chỉ dùng ốc chỉnh tinh để chỉnh cho ảnh rõ (không được dùng ốc thỉnh thô)
Soi kính ở vật kính dầu: vật kính 100x
- Giữa vật kính và tiêu bản có dầu soi kính (chiết suất dầu soi kính bằng chiết suất
thuỷ tinh)
- Lưu ý: Khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản rất nhỏ nên rất dễ bị vỡ tiêu bản do
vật kính chạm vào tiêu bản, gây hỏng vật kính.

Hình 5: Sơ đồ giải thích lý do dùng dầu soi kính.

Khi sử dụng xong kính hiển vi :
1. Lấy lam kính ra khỏi bàn soi.
2. Nếu dùng vật kính dầu, lau dầu khỏi vật kính bằng giấy lau và dng dịch lau theo
quy định của phòng thí nghiệm.
3. Xoay vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất về vị trí soi kính.
4. Các bộ phận di chuyển được đưa về vị trí cao nhất.
5. Điều chỉnh thanh trượt trên bàn soi về vị trí ở giữa.
6. Phủ tấm chống bụi.
7. Cất vào đúng nơi quy định.

2. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN:
a/ Phương pháp làm tiêu bản soi tươi
. Cách làm tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.
- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí.
Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
Cách làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di
động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích.
- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính.
9

Hình 6: Các bước làm tiêu bản giọt treo

b/ Phương pháp làm tiêu bản cố định
Thực hành vô trùng tạo vết bôi:
- Lắc đều ống nghiệm để vi khuẩn lơ lửng trong ống. Không làm ướt nút
ống nghiệm.
- Hơ đỏ đầu que cấy và phần kim loại. Hơ nóng phần tay cầm.
- Mở nút ống nghiệm và hơ nóng miệng ống. Không đặt nút xuống bàn.
- Làm nguội đầu que cấy ít nhất 5 giây, lấy một vòng que cấy dịch chứa vi
sinh vật. Tránh chạm vào thành ống nghiệm.
- Hơ nóng miệng ống nghiệm lần nữa.
- Đậy nút ống nghiệm và đặt lên giá.
- Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn chính giữa vòng mục tiêu trên phiến kính.
- Hơ que cấy lại trước khi chuyển vòng cấy khác từ canh cấy hoặc đặt sang
chỗ khác.
Thực hành cố định tế bào:
Đối với mẫu lấy từ môi trường dịch lỏng:
- Định sẵn một vòng tròn mục tiêu trên phiến kính.
- Đặt 2 vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật vào chính giữa vòng tròn mục tiêu
- Tán đều vi sinh vật khắp vùng của vòng mục tiêu
- Vết bôi làm khô ở nhiệt độ phòng.
Đối với mẫu lấy từ môi trường rắn:
- Định sẵn một vòng tròn mục tiêu trên phiến kính.
- Đặt 2 vòng que cấy nước vào chính giữa vòng tròn mục tiêu
- Một lượng nhỏ vi sinh vật được tán đều bằng que cấy khắp vùng của vòng mục tiêu
- Vết bôi làm khô ở nhiệt độ phòng.
Đưa phiến kính qua ngọn lửa vài lần để tiêu diệt và gắn vi khuẩn vào phiến kính.
10

Hình 7: Các bước làm tiêu bản vi khuẩn

11


Hình 8: Kỹ thuật vô trùng
Nhuộm đơn
- Đặt tiêu bản nằm ngang trên khay nhuộm.
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh Methylene, để yên 1 phút.
- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ
qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa.
- Để khô tự nhiên (có thể dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn
cồn.)
- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi.

Hình 9: Các bước nhuộm đơn
12

Nhuộm Gram:
Năm 1884 nhà vi khuẩn học Đan mạch
Chrischian Gram phát triển kỹ thuật nhuộm để tách
vi khuẩn ra làm 2 nhóm: một nhóm là Gram dương
và một nhóm là Gram âm. Các bước nhuộm dựa
trên hiện tượng một số vi sinh vật giữ màu tím của
crystal violet trong quá trình tẩy màu bằng alcohol.
Vi khuẩn Gram âm bị mất màu tím của crystal
violet bởi alcohol. Vi khuẩn gram dương không bị
mất màu và giữ lại màu tím của crystal violet. Sau
khi mất màu tím, đỏ safranin được sử dụng tạo màu

hồng cho vi khuẩn gram âm đã bị mất màu.
Hình bên cho thấy sự ảnh hưởng của các yếu
tố khác nhau trên tế bào vi khuẩn tại mỗi thời điểm
của quá trình nhuộm. Chú ý rằng việc nhuộm
crystal violet đầu tiên là nguyên nhân cả 2 nhóm
gram dương và âm có màu tím sau 20 giây của quá
trình nhuộm. Khi chất nhuộm màu iodine được phết
lên vết bôi tế bào vi khuẩn trong 1 phút, màu của
gram dương và gram âm màu tím tương tự nhau. Chức năng của iodine ở đây là để kết hợp
với crystal violet tạo thành hợp chất không hòa tan trong vi khuẩn gram dương. Khi cồn 95%
là tác nhân làm mất màu được thêm vào trong 10 -20 giây, vi khuẩn gram âm bị mất màu tím
còm vi khuẩn gram dương giữ lại màu tím. Trong bước cuối cùng, chất nhuộm ngược lại
safranin thêm màu hồng để vi khuẩn gram âm bị mất màu không ảnh hưởng màu tím vi
khuẩn gram dương.
Các kỹ thuật nhuộm dùng trong việc nhân diện vi khuẩn chưa biết. Nhuộm gram là
một thí nghiệm quan trọng trong PTN vi sinh vật. Mặc dù kỹ thuật này dường như khá đơn
giản, nhưng cần tiến hành thí nghiệm này cẩn thận. Các bạn chú ý: (1) không làm vết bôi quá
dày, và (2) Chú ý bước tẩy màu.
Lưu ý: canh cấy của vi khuẩn gram dương già có khuynh hướng mất màu nhanh hơn
canh cấy non, khiến chúng xuất hiện gram âm thay vì vi khuẩn gram dương. Để có kết quả
đáng tin cậy nên sử dụng một canh cấy khoảng 16 giờ. Một điểm khác cần chú ý, vài loài
Bacillus có thử nghiệm nhuộm gram thay đối: đôi khi bắt màu gram dương, đôi khi bắt màu
gram âm.
Bạn cần làm thí nghiệm với vài loài vi khuẩn khác nhau. Cần nhớ rằng, nếu bạn
không nắm vững kỹ thuật này bây giờ, bạn sẽ khó khăn với những vi khuẩn chưa biết sau
này.
Thực hành nhuộm
Vật liệu: Lam kính với vết bôi đã cố định bằng nhiệt.
Thuốc nhuộm gram và bình tia chứa nước cất
Giấy thấm

1. Phủ crystal violet lên vết bôi và giữ trong 20 giây.
2. Dùng bình tia rửa sạch vết thuốc nhuộm trong một thời gian ngắn. Làm ráo nước
thừa.
3. Phủ vết bôi với dung dịch lugol và giữ trong 30 giây đến 1 phút.
Hình 10: Sự thay đổi màu trong

các bước nhuộm Gram
13

4. Nghiêng đổ hết dung dịch lugol trên phiến kính và phủ vết bôi với ethyl alcohol 95%
trong 10-20giây. Đây là bước quyết định. Vết bôi dày sẽ cần khoảng thời gian lâu hơn
vết bôi mỏng.
5. Dừng bước tẩy alcohol bằng cách rửa phiến kính với nước trong bình tia.
6. Phủ safranin trên vết bôi và giữ trong 20 giây hoặc lâu hơn.
7. Rửa nhẹ nhàng trong vài giây, để khô tự nhiên hoặc thấm khô bằng giấy thấm.
8. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi.

Hình 11: Các bước nhuộm Gram
Thực hành
Các vi sinh vật dùng cho bài thực hành nhuộm gram cần đại diện cho sự đa dạng hình
thái và đặc điểm nhuộm. Vài loại trực khuẩn và cầu khuẩn là gram dương và loại khác là
gram âm. Một vi sinh vật hình que là dạng bào tử và loại khác là vi khuẩn kháng cồn-acid.
Vấn đề thử thách ở đây là làm các tiêu bản với hỗn hợp các loài vi khuẩn khác nhau và phát
hiện ra chúng.
Vật liệu:
- Canh cấy Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Moraxella
catarrhalis.
- Ống thạch nghiêng cấy Bacillus megaterium và Mycobacterium smegmatis.
Chuẩn bị 3 tiêu bản với ba vết bôi trên mỗi tiêu bản. Trên phần bên trái của mỗi tiêu
bản làm một vết bôi của Staphylococcus aureus. Trên phần bên phải mỗi phiến kính làm một

vết bôi của Pseudomonas aeruginosa. Ở phần giữa tiêu bản là vết bôi của hỗn hợp cả hai vi
khuẩn này, dùng 2 que cấy vòng cho mỗi vi khuẩn. Hãy chắc chắn hơ lửa que cấy đủ để
tránh gây nhiễm.
Báo cáo kết quả của bạn trong phần báo cáo thí nghiệm bằng việc vẽ một vài tế bào
trong vòng tròn thích hợp.

14

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Từ bây giờ hầu hết các thí nghiệm trong tài liệu này sẽ sử dụng cho các môi trường
dùng để nuôi cấy vi khuẩn. Hầu hết các môi trường được chuẩn bị sẵn. Tuy nhiên, có thể phát
sinh trường hợp bạn cần một vài môi trường đặc biệt mà đã không được chuẩn bị sẵn, các
bạn trong nhóm phải cùng nhau chuẩn bị.
1. Các loại môi trường:
Một môi trường nuôi cấy vi sinh vật là thực phẩm cho canh cấy vi khuẩn, nấm mốc,
và các vi sinh vật khác. Nó có thể tồn tại 3 dạng: lỏng, đặc và bán rắn.
Môi trường lỏng: bao gồm canh thang dinh dưỡng, canh thang citrate, canh thang
glucose, sữa-quỳ … Các môi trường đó được sử dụng cho việc nhân giống một lượng lớn vi
sinh vật, nghiên cứu sự lên men, và nhiều thử nghiệm khác.
Môi trường rắn: thực hiện bằng cách đưa thêm vào một tác nhân tạo đông như agar,
gelatin, hoặc silica gel vào môi trường lỏng. Một tác nhân tạo đông tốt là một chất mà không
bị sử dụng bởi vi sinh vật, không ức chế sự phát triển của vi khuẩn và không hóa lỏng ở nhiệt
độ phòng. Agar và silica gel không hóa lỏng ở nhiệt độ phòng và không bị sử dụng bởi nhiều
sinh vật. Trái lại, gelatin bị thủy phân bởi khá nhiều vi sinh vật và hóa lỏng ở nhiệt độ phòng.
Thạch dinh dưỡng, thạch máu và Sabouraud là ví dụ môi trường rắn được dùng cho
sự phát triển các khuẩn lạc của vi khuẩn và nấm mốc trên bề mặt. Sự phát triển các khuẩn lạc
trên bề mặt môi trường là cần thiết khi cố gắng phân lập vi sinh vật từ canh cấy hỗn hợp.

Môi trường bán rắn: là dạng môi trường ở giữa môi trường lỏng và rắn. Mặc dù
chúng tương tự môi trường rắn trong việc chứa tác nhân tạo đông như agar, gelatin, chúng là
dạng thạch đông nhờ có phần trăm các chất tạo đông thấp. Các môi trường đó hữu dụng trong
việc xác định vi khuẩn có thể di động hay không.
2. Nhu cầu dinh dưỡng cần thiết của vi khuẩn
Bất cứ môi trường nào phù hợp cho một nhóm vi sinh vật cụ thể đều bao gồm 7 yếu
tố sau: nước, carbon, nguồn năng lượng, nitrogen, khoáng, yếu tố sinh trưởng, pH. Vai trò
của mỗi yếu tố như sau:
Nước: Nguyên sinh chất chứa 70-85% nước. Nước trong sinh vật đơn bào gắn liền
với nước trong môi trường, các phân tử này ra vào qua màng tế bào như một giá mang các
chất dinh dưỡng vào và bài tiết các chất ra khỏi tế bào. Tất cả các enzyme kiểm soát các phản
ứng hóa học chỉ xảy ra trong tế bào khi có lượng nước đầy đủ. Chất lượng nước dùng trong
chuẩn bị môi trường rất quan trọng. Nước cứng có hàm lượng ion canxi và magiê cao không
được sử dụng. Phosphate của canxi và magiê không hòa tan có thể kết tủa khi có mặt của
peptone và cao thịt bò. Tốt nhất luôn sử dụng nước cất.
Carbon: Vi sinh vật được chia làm 2 nhóm tuỳ theo nguồn carbon mà chúng sử dụng.
Nhóm có thể sử dụng carbon dioxide để tổng hợp tất cả chất cho tế bào gọi là vi sinh vật tự
dưỡng. Nếu chúng có một hoặc nhiều hợp chất hữu cơ sử dụng làm nguồn carbon được gọi là
vi sinh vật dị dưỡng. Ngoài nguồn carbon hữu cơ, vi sinh vật tự dưỡng cũng có thể sử dụng
carbon dioxide. Nếu khí này hoàn toàn loại trừ ra khỏi môi trường của chúng, sự phát triển
của chúng bị chậm lại, đặc biệt trong giai đoạn sớm của bắt đầu một canh cấy.
Carbon hữu cơ đặc trưng cần thay đổi theo tổ chức tế bào của vi sinh vật. Một vi sinh
vật có thể chỉ yêu cầu một hợp chất đơn đơn giản như acetic acid, nhóm khác có thể yêu cầu
12 hoặc nhiều loại dinh dưỡng hữu cơ với mức độ phức tạp.
Nguồn năng lượng: Vi sinh vật có sắc tố cho phép chúng sử dụng nguồn năng lượng
mặt trời được gọi là vi sinh vật quang năng (photoautotrophs). Môi trường nuôi cấy nhóm vi
sinh vật này không bao gồm thành phần cung cấp năng lượng. Sinh vật tự dưỡng có thể
15

không sử dụng năng lượng mặt trời nhưng có thể oxi hóa hợp chất vô cơ đơn giản tạo năng

lượng gọi là vi sinh vật hóa năng (chemoautotroph). Chất sinh năng lượng cần thiết cho các
vi sinh vật này có thể là các chất như nitrite, nitrate hoặc sulfide.
Hầu hết các vi khuẩn thuộc vào nhóm dị dưỡng hóa năng cần nguồn năng lượng hữu
cơ như glucose hoặc amino acids. Lượng chất sinh năng lượng trong môi trường nuôi cấy
mang lại cho cả hai dạng hóa tổng hợp là 0,5%.
Một lượng nhỏ vi khuẩn được phân loại là dị dưỡng quang năng. Các vi sinh vật đó
có sắc tố quang hợp cho phép chúng sử dụng ánh sáng mặt trời cho năng lượng. Nguồn năng
lượng carbon cần là hợp chất hữu cơ như alcohol.
Nitrogen: Mặc dù vi sinh vật tự dưỡng có thể sử dụng nguồn nitrogen vô cơ, vi sinh
vật dị dưỡng lấy nguồn nitrogen từ amino acid và hợp chất trung gian như peptid proteoses
và peptone. Dịch chiết thịt bò và peptone sử dụng trong canh dinh dưỡng cung cấp nitrogen
cần thiết cho vi sinh vật tự dưỡng phát triển trong môi trường.
Khoáng: Tất cả các vi sinh vật yêu cầu một vài nguyên tố kim loại như sodium,
potassium, calcium, magnesium, sắt, kẽm, đồng phosphor và coban cho sự sinh trưởng bình
thường. Vi khuẩn không ngoại lệ. hàm lượng yêu cầu khá nhỏ.
Các yếu tố phát triển: bất cứ hợp chất cần thiết nào của vật chất tế bào mà một vi
sinh vật không thể tổng hợp từ nguồn carbon và nitrogen được phân loại là một yếu tố phát
triển. Yếu tố phát triển có thể bao gồm amino acid hoặc vitamin. Nhiều vi sinh vật dị dưỡng
thỏa mãn với yếu tố sinh trưởng hiện diện trong dịch chiết thịt bò của canh thang dinh dưỡng.
Hầu hết các vi khuẩn gây bệnh khó tính yêu cầu môi trường giàu dinh dưỡng như thạch máu
giàu yếu tố phát triển.
pH: Sự phát triển của vi sinh vật trong một môi trường cụ thể có thể hoàn toàn bị ức
chế nếu pH môi trường không nằm trong vùng giới hạn. Các enzyme vi sinh vật bị ảnh hưởng
lớn bởi yếu tố này. Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt nhất xung quanh pH 7, pH của canh
thang dinh dưỡng nên điều chỉnh đến pH 6,8. Mặt khác, vi khuẩn gây bệnh thường thích ứng
pH kiềm hơn. Trypticase soy broth là một môi trường phù hợp cho nhiều vi khuẩn gây bệnh
khó tính nên điều chỉnh đến pH 7,3.
3. Môi trường có thành phần chính xác:
Các môi trường có thể được chuẩn bị chính xác đến chi tiết vì thế các thành phần
chính xác phải được biết. Các môi trường thông thường làm từ các chất hóa học có độ tinh

sạch cao và thành phần chính xác. Chúng được biết như môi trường tổng hợp. Các môi
trường như canh thang dinh dưỡng chứa các thành phần không chính xác được gọi là môi
trường tự nhiên. Cả hai loại dịch chiết thịt bò và peptone đều không chính xác trong thành
phần trong canh dinh dưỡng.
4. Môi trường đặc biệt:
Hai loại môi trường đặc biệt sẽ được mở rộng sử dụng trong chỉ dẫn thực hành là môi
trường chọn lọc và phân biệt.
Môi trường chọn lọc là môi trường mà theo đó chỉ các loại chính xác của vi sinh vật
phát triển trên hoặc trong môi trường đó bởi vì (1) sự vắng mặt của một số chất dinh dưỡng
quan trọng làm cho nó không thích hợp cho hầu hết các vi sinh vật nhưng không phải tất cả
hoặc (2) sự hiện diện của chất ức chế ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật nhất định nào
đó. Chất ức chế có thể là NaCl, acid, hóa chất gây độc (như Crystal violet), chất kháng khuẩn
(như Streptomycin), hoặc vài hợp chất khác.
Môi trường phân biệt là môi trường chứa các chất tạo ra một số vi khuẩn để có một
dáng khác nhau từ các loài khác, cho phép phân biệt một trong những loài khác.
Trong một số trường hợp môi trường đưa vào công thức cả hai chọn lọc và phân biệt.
Ví dụ môi trường EMB agar, sử dụng để xác định coliforms trong phân tích nước.
16

5. Chuẩn bị môi trường:
Bạn cần báo cáo số lượng của các môi trường cụ thể để có thể phân công nhiệm vụ
cho bạn và người cùng làm việc.
Vài cỡ ống nghiệm kiểm tra được sử dụng cho môi trường nhưng 2 cỡ thường được
dùng là 16mm, 20mm dài 15cm.
Ống lớn (20mm): dùng để rót các môi trường như: NA, SDA, EMB… Các ống rót
được dùng cho việc đổ vào đĩa Petri.
Ống nhỏ (16cm): dùng cho tất cả canh trường, môi trường đứng và môi trường thạch
nghiêng
Nếu các ống nghiệm đã được làm sạch và bảo vệ tránh vết bẩn hoặc các chất gây
nhiễm khác, chúng có thể sử dụng không cần làm sạch. Nếu chúng cần làm sạch, dùng cây cọ

ống nghiệm chùi rửa với nước nóng và chất tấy rửa. Súc rửa hai lần, đầu tiên với nước vòi,
cuối cùng với nước cất để giũ sạch các dấu vết của chất tẩy rửa. Đặt dốc ngược chúng lên giá
để khô. Không dùng khăn lau khô dụng cụ.
Đo lường và hòa trộn:
Lượng môi trường bạn làm cho một lần nên xác định rõ, tránh dư thừa hoặc thời gian
bảo quản dài.
Vật liệu:
Cốc đong, bình định mức, que khuấy thủy tinh, chai môi trường khử nước, đèn cồn,
giá đỡ.
1/ Đo lường một lượng nước đủ để làm môi trường. Các thể tích môi trường yêu cầu
trong một ống nghiệm như sau:
Ống môi trường để rót vào đĩa Petri: 12 ml
Ông thạch đứng 6 ml
Ống thạch nghiêng 4 ml
Ống canh trường 5 ml
Ống canh trường lên men 5-7 ml
2/ Xem trên nhãn hộp môi trường để xác định lượng môi trường cần pha trong
1000ml, sau đó xác định lượng nước sử dụng cho phương pháp tương ứng sử dụng. Cân môi
trường và cho vào cốc đong nước. Nếu môi trường không chứa agar, quá trình hòa trộn
thường dùng nhiệt bên ngoài hòa tan.
3/ Nếu môi trường chứa agar, nấu sôi trên bếp điện, để tránh mất nước, trước khi nấu
tan đánh dấu mức trên của môi trường trên thành cốc đong bằng bút viết kính. Chú ý, môi
trường có thể sôi trào ra khỏi dụng cụ chứa đựng. Cẩn thận dùng đũa thủy tinh khuấy tránh
môi trường bị cháy dưới đáy cốc đong.
4/ Kiểm tra mức nước với vạch đánh dấu để chú ý lượng nước bị mất đi. Thêm nước
cất đủ lượng yêu cầu. Giữ nhiệt độ môi trường khoảng 60
0
C để tránh bị đông đặc. Môi
trường sẽ đông đặc khoảng 40
0

C.
Điều chỉnh pH:
Mặc dù môi trường khô chứa tác nhân đệm giữ pH của môi trường ở khoảng mong
muốn, pH môi trường có thể thay đổi so với trạng thái trên nhãn chai. Trước khi được rót
ống, nên kiểm tra pH môi trường và điều chỉnh pH nếu có.
Nếu có sẵn dụng cụ đo pH và đã chuẩn, dùng nó để đo pH của môi trường. Nếu cần
điều chỉnh pH dùng HCl hoặc NaOH. Nếu không có dụng cụ đo pH, có thể dùng giấy đo pH.
Cách điều chỉnh pH:
Vật liệu: cốc đong chứa môi trường, chai 1N và 0,1N của HCl và NaOH, que khuấy
thủy tinh, giấy đo pH, dụng cụ đo pH (không bắt buộc).
1/ Xác định pH môi trường bằng giấy đo pH
17

2/ Nếu pH quá cao, thêm HCL để giảm pH. Nếu lượng môi trường quá nhiều dùng 1N
HCl. Nếu pH sai khác ít, dùng 0,1HCl. Khuấy trộn giọt thêm vào để hòa tan vào
môi trường bằng que khuấy thủy tinh.
3/ Nếu pH quá thấp, thêm NaOH từng giọt để tăng pH. Nếu pH sai khác ít dùng
0,1NNaOH, sai khác nhiều dùng 1NNaOH. Khuấy trộn đều giọt thêm vào bằng đũa
thủy tinh.
6. Rót ống nghiệm:
1/ Rót vào một ống nghiệm lượng môi trường được đo chính xác. Ống này làm mốc
để rót các ống nghiệm khác.
2/ Rót phễu và quá trình rót ống kiểm tra mức độ phù hợp, giữ ống hướng dẫn bên
cạnh các ống sẽ rót tiếp theo để giúp bạn xác định lượng môi trường vào trong mỗi
ống nghiệm.
3/ Giữ cốc chứa môi trường nóng nếu chứa agar.
4/ Nếu ống nghiệm được sử dụng trong lên men, thêm một vào mỗi ống ở thời điểm
này, miệng ống quay xuống dưới.
Đậy nắp ống nghiệm:
Bước cuối cùng trước khi thanh trùng là đậy nắp các ống nghiệm. Nắp plastic thích

hợp cho mọi trường hợp. Tất cả các nắp đậy đầu ống nghiệm có rãnh nhỏ bên trong tạo
khoảng trống cho phép hơi nước thoát ra trong quá trình thanh trùng. Nếu dùng nắp vặn
plastic, nắp không được vặn chặt, trước khi thanh trùng nới nắp vặn một phần vòng xoay.
7. Thanh trùng:
Các ống nghiệm chuẩn bị xong cần thanh trùng ngay lập tức. Vi sinh vật trên thành
ống, trong nước cất, trong môi trường làm khô sẽ bắt đầu phát triển trong khoảng thời gian
ngắn ở nhiệt độ phòng, phá hủy môi trường.
Trước khi thanh trùng, các ống nghiệm cần đặt trong dụng cụ chứa dạng lưới có ghi
nhãn bên ngoài. Nhãn cần thể hiện loại môi trường, ngày thanh trùng, người làm.
Thanh trùng thực hiện trong nồi thanh trùng. Hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng:
- Kiểm tra thực hành với dạng nồi thanh trùng cụ thể. Hoàn thành quá trình thanh
trùng ở 121
0
C. Để đạt được nhiệt độ đúng cần chuẩn bị không gian cho sự thoát khí.
Một số thiết bị cũ cần cho hơi nước thoát ra cửa sổ.
- Không để quá tải lỗ thoát khí. Không nên thử nhìn môi trường nhồi nhét trong đó.
Cần giữ khoảng cách giữa các dụng cụ chứa đựng cho sự lưu thông hơi nóng.
- Điều chỉnh thời gian thanh trùng với kích cỡ bình chứa. Các bình chứa nhỏ có thể
thanh trùng 10-15 phút. Một nồi thanh trùng đầy có thể mất 30 phút hoàn tất.
8. Sau khi thanh trùng:
Thạch nghiêng: Cần đặt gần như nằm ngang ngay khi lấy trong nồi thanh trùng ra.
Quá trình đông đặc xảy ra trong vòng 30 -60 phút.
Môi trường khác: Các dạng ống nghiệm lỏng, thạch đứng cần để nguội ở nhiệt độ
phòng sau khi lấy ra khỏi nồi thanh trùng. Sau khi đông đặc, giữ trong tủ lạnh hoặc chỗ mát.
Bảo quản: Nếu ống môi trường không dùng ngay, chúng cần được bảo quản chỗ mát.
Khi bảo quản thời gian dài ở nhiệt độ phòng môi trường sẽ bị mất nước. Môi trường có thể
giữ ở nhiệt độ tủ lạnh hàng tháng.

18

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT

1. KỸ THUẬT VÔ TRÙNG:
Các thủ tục hướng dẫn chi tiết đảm bảo yêu cầu của việc duy trì một môi trường vô
trùng khi thao tác cấy vi sinh vật. Cấy chuyển vô trùng từ canh cấy này sang canh cấy khác
thành công khi không lây nhiễm vi sinh vật trong quá trình. Quá trình cấy chuyển có thể từ
khuẩn lạc trên hộp lồng sang ống nghiệm chứa canh trường hoặc cấy chuyển từ canh trường
nuôi cấy sang nhiều loại môi trường (rắn hoặc lỏng) cho nhiều loại xét nghiệm.
Thao tác chung:
Khử trùng khu làm việc: Đầu tiên xử lý khu vực làm việc với một chất tẩy trùng để
diệt vi sinh vật hiện có. Bước này phá hủy được tế bào sinh dưỡng và virus; tuy nhiên không
phá hủy được bào tử.
Que cấy vòng và que cấy thẳng: Việc cấy chuyển các vi sinh vật được thực hiện
bằng que cấy vòng hoặc thẳng. Phải khử trùng chúng trước khi lấy vi sinh vật bằng cách
nung nóng bằng đèn cồn đến nóng đỏ.
Hơ nóng miệng ống nghiệm: Trước khi đưa que cấy đã làm nguội vào ống nghiệm
chứa môi trường, mở nắp ống nghiệm và hơ nóng miệng ống nghiệm. Sau khi lấy vi sinh vật
ra khỏi ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống lần nữa.
Cấy trên môi trường lỏng: Nếu cấy vi sinh vật vào ống môi trường lỏng, miệng ống
cần hơ nóng trước khi đưa que cấy vào trong ống. Để cấy vi sinh vật vào môi trường, cần
xoay que cấy vài vòng trong môi trường.
Sau khi cấy xong, que cấy được rút ra khỏi ống nghiệm, khử trùng như lúc đầu. Các
dụng cụ này không được đặt trên mép bàn. Khử trùng miệng ống nghiệm trước khi đậy nắp.
Cấy đĩa Petri: Để cấy trên đĩa, không dùng nhiệt tác dụng lên đĩa và dùng que cấy
vòng trong quá trình cấy chuyển. Khi vạch trên bề mặt môi trường cần giữ nắp đậy che phía
trên, tránh lây nhiễm vi sinh vật từ không khí.
Khử trùng cuối cùng: Khi công việc kết thúc, vùng làm việc cần được xử lý với chất
khử trùng để chắc chắn vi sinh vật tích tụ trong quá trình làm việc đều bị loại bỏ.

Để thực hành cấy chuyển canh cấy vi khuẩn, ba cách cấy chuyển đơn giản được đưa
ra: (1) chuyển từ canh cấy sang canh cấy, (2) chuyển từ thạch nghiêng sang thạch nghiêng,
(3) chuyển từ đĩa thạch sang đĩa thạch.
Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác:
- Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật; ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông
một chút.
- Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ vòng cấy
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống
giống ra.
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống
giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi
trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.

19


Hình 13: Các bước thực hiện lấy vi sinh vật từ ống canh thang



Hình 14: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ đĩa thạch.

20

Hình 15: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ ống thạch nghiêng.

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY:
Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:
Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo:
+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các cách khác nhau.
Phương pháp cấy trên thạch đứng: Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí.
- Sử dụng que cấy kim
- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ.
- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành
ống tuỳ yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường.
Phương pháp cấy trên đĩa pêtri:
21

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:
* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:
- Để đĩa pêtri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương
pháp chung.
- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các
kiểu sau (xem hình 16)
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
+ Theo những đường song song.
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc.

Hình 16: Các cách cấy phân lập khác nhau trên đĩa thạch
* Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy một lượng khá nhiều
giống. Có 2 cách:
Cách 1:
+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có
môi trường thạch ở nhiệt độ 45-50
0
C.
+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng.
+ Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.
+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
Cách 2: Phương pháp cấy trang
- Tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp đã nêu trên.
- Ghi vào đáy đĩa Petri có môi trường thạch các thông tin :
. Nồng độ pha loãng.
. Ngày cấy.
- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương
đương với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượt
quá 300.
Lưu ý: có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5 ml. Tuy nhiên, thể tích mẫu cấy
càng nhỏ thì sai số có thể xảy ra càng lớn.
Khi tất cả các thể tích 0,1 ml tế bào ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển
lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên
bề mặt thạch. Lưu ý rằng que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩn trước khi được đưa vào
đĩa Petri tiếp theo, bằng cách nhúng vào trong cồn, vẩy nhẹ để loại đi lượng cồn dư bám bằng
que cấy, đốt cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy
bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó. Nếu thể
tích chất lỏng đem cấy quá nhiều, các tế bào sẽ trôi dạt trong chất lỏng, và sau khi tế bào
phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ một tế bào có thể hình thành. Các đĩa thạch được chuẩn

bị một ngày trước khi cấy thường hấp thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy. Lớp chất lỏng trên
thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh.
22

Bài 5: CÁC ĐẶC ĐIỂM VỀ SINH HOÁ
Các thử nghiệm thăm dò

Có một vài thí nghiệm sinh lý học được sử dụng trong định danh được xếp vào nhóm
‘các thử nghiệm thăm dò’. Các thử nghiệm này gồm sinh H
2
S, sử dụng citrate, khử amine của
phenylalanine, và phản ứng sữa quỳ. Trong phần này cũng giới thiệu thêm về giá trị của các
thử nghệm IMViC.

GIAI ĐOẠN ĐẦU (Nuôi cấy)
Hai sinh viên thí nghiệm chung.
- Thử nghiệm đối chứng :
o 1 ống môi trường thạch KIA hay SIM
o 1 ống thạch nghiêng Simmans citrate
o 1 ống thạch nghiêng phenylalanine agar
o Canh cấy từ canh thang dinh dưỡng vi khuẩn Proteus vulgaris,
Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes.
- Đối với chủng cần định danh
o 1 ống môi trường thạch KIA hay SIM
o 1 ống thạch nghiêng Simmans citrate
o 1 ống thạch nghiêng phenylalanine agar
o 1 ống sữa-quỳ
1. Ghi nhãn vào 1 ống môi trường KIA hay SIM chủng P. VULGARIS và 1 ống với ký hiệu
của chủng chưa biết. Cấy chủng vi khuẩn vào mặt nghiêng và đâm vào thạch mỗi ống
bằng que cấy thẳng.

2. Ghi nhãn vào 1 ống môi trường thạch Simmons citrate chủng E. AEROGENES và 1 ống
với ký hiệu của chủng chưa biết. Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn vào mặt nghiêng mỗi
ống.
3. Ghi nhãn 1 ống thạch nghiêng phenylalanine P. VULGARIS và ống kia với ký hiệu chủng
chưa biết. Cấy vi khuẩn vào mặt nghiêng.
4. Cấy vi khuẩn vào ống môi trường sữa-quỳ.
5. Nuôi cấy ở 37°C trong 24-48 giờ.

GIAI ĐOẠN 2
(Đánh giá các thử nghiệm)
Sau 24-48 giờ nuôi cấy, kiểm tra các ống nghiệm để đánh giá theo phần thảo luận sau.
Ghi nhận kết quả theo bảng ghi.
Sinh H
2
S
Một vài vi khuẩn, như Proteus vulgaris, sinh H
2
S từ acid amine cysteine. Những sinh
vật này sinh enzyme cysteine desulfurase, tiến hành phản ứng khi liên kết với coenzyme
pyridoxyl phosphate. Việc sinh H
2
S là bước đầu tiên trong việc khử amine của cystein:

23

Môi trường KIA hay SIM được sử dụng ở đây để phát hiện việc sinh H
2
S. Cả hai môi
trường này đều chứa muối sắt, phản ứng với H
2

S tạo kết tủa đen của FeS. Môi trường KIA
cũng chứa đường glucose, lactose, và đỏ phenol. Khi môi trường
này được sử dụng trên phần nghiêng là môi trường tuyệt vời để phát
hiện lên men glucose, lactose. Mặt khác, môi trường SIM cũng
dùng để xác định tính di động và thử nghiệm sinh indol.
Kiểm tra ống nghiệm của 1 trong các môi trường này cấy
với P. vulgaris, xuất hiện màu đen như trong hình bên.
So sánh với chủng cần định danh của bạn, ghi nhận kết quả.

Sử dụng Citrate
Khả năng của một số vi khuẩn, như E. aerogenes và
Salmonella typhimurium, sử dụng citrate như là nguồn carbon duy
nhất là một đặc tính phân biệt thường dùng để phân biệt các vi
khuẩn đường ruột. Trong môi trường này, citrate được sử dụng như
là nguồn carbon duy nhất, nitơ cung cấp dưới dạng muối amôn,
thay vi acid amin. Kiểm tra chuẩn môi trường bằng chủng E.
aerogenes. Xem hình bên ống giữa dương tính.
Ghi nhận kết quả của chủng cần định danh.

Khử amine của phenylalanine
Một số vi khuẩn, như Proteus, Morganella, và Providencia, sinh enzyme deaminase
phenylalanase, khử amine của acid amine phenylalanine tạo acid phenylpyruvic (PPA). Phản
ứng này được sử dụng để phân biệt 3 giống này với các giống khác trong họ vi khuẩn đường
ruột. Phản ứng như sau:

Thử nghiệm sau nhằm phát hiện acid phenylpyruvic, là bằng
chứng cho thấy sự có mặt của enzyme phenylalanase.
Vật liệu: Bình nhỏ giọt chlorua sắt 10%.
Nhỏ 5-10 giọt chlorua sắt 10% lên mặt nghiêng của ống thạch
nghiêng chứng (P. vulgaris) và ống cấy chủng cần định danh. Để

phản ứng xảy ra nhanh, dùng que cấy trộn đều vi khuẩn vào dung
dịch. Màu xanh lá cây đậm sẽ xuất hiện trong 1-5 phút. So sánh ống
nghiệm cấy chủng cần định danh. Ghi nhận kết quả.

Thử nghiệm IMViC
Để phân biệt E. aerogenes với E. coli, cũng như các loài có liên quan khác, 4 đặc tính
được chọn trong nhóm này gọi là thử nghiệm IMViC (Indol- Methyl red- Voges-Proskauer
và Citrate)
Hình 17
:
Thử nghiệm sinh H
2
S
Hình 18
:
Thử nghiệm sử dụng Citrate
Hình 19
:
Thử nghiệm PPA
24



I M V C
E. coli + + - -
E. aerogenes - - + +
Thử nghiệm này dùng trong đánh giá chất lượng vi sinh vật nước uống, để phát hiện
vi sinh vật chỉ thị E. coli, tránh nhầm lẫn với E. aerogenes, chúng giống nhau về hình thái và
đặc điểm sinh lý. Do E. aerogenes không luôn có mặt trong chất thải, nên sự có mặt của vi
khuẩn này không nói lên được nước uống đã nhiễm chất thải.

Các phản ứng Sữa-Quỳ tím
Môi trường sữa-quỳ tím chứa 10% sữa bột tách kem, và một lượng nhỏ quỳ tím làm
chất chỉ thị pH. Khi pha môi trường điều chỉnh pH 6,8. Đây là môi truờng tốt cho nhiều vi
sinh vật phát triển và dùng để xác định đặc tính chủng chưa biết. Do một số phản ứng cần 4-5
ngày, nên kiểm tra canh cấy hàng ngày trong 4-5 ngày.
Một số kết quả phản ứng
Phản ứng kiềm: môi trường có màu xanh biển hay màu tím đỏ trong 24 giờ.
Khử quỳ: canh cấy chuyển thành trắng, vi khuẩn nhân lên mạnh giảm thế oxy hoá
khử của môi trường.
Hình thành cục sữa đông: Làm đông tụ do tủa protein. Nghiêng ống nghiệm 45°
kiểm tra phản ứng này có xảy ra hay không.
Pepton hoá: Môi trường trong suốt. Thường chuyển màu nau trong giai đoạn này do
vi khuẩn ly giải protein.
Tạo nhày đặc quánh lại thành dây ở đáy ống nghiệm. Có thể kiểm tra đặc điểm
này bằng que cấy.



(A) Kiềm. (B) Acid. (C) Phần trên trong suốt do pepton hoá; phần trắng, đặc ở đáy
ống nghiệm do đông tụ và khử quỳ; cả ống nghiệm màu đỏ do acid. (D) Đông tụ và khử quỳ
ở nữa dưới; pepton hoá một ít và acid ở phía trên. (E) Chỉ thị quỳ bị che lấp bởi sắc tố hoà tan
(Pseudomonas).
Hình 20
: Các phản ứng khác nhau trên môi trường Sữa-quỳ tím
25

Sơ bộ phân biệt trực khuẩn và cầu khuẩn gram dương.

Sơ bộ phân biệt trực khuẩn và cầu khuẩn gram âm.