Nghiên cứu chế tạo hệ thống đo đạc và phân tách các phân tử sinh học đặc hiệu - protein-ADN - Phụ lục

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ
CƠ KHÍ VÀ TỰ ĐỘNG HÓA”, MÃ SỐ KC.03.TN/11-15”






PHỤ LỤC



ĐỀ TÀI KHCN TIỀM NĂNG
“Nghiên cứu chế tạo hệ thống đo đạc và phân tách
các phân tử sinh học đặc hiệu – protein/ADN”

MÃ SỐ: KC.03.TN10/11-15




Chủ nhiệm đề tài : TS. Cao Xuân Hữu
Cơ quan chủ trì : Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng

9805-1

Hà Nội, năm 2012


PHỤ LỤC 1: SẢN PHẨM ĐỀ TÀI

SẢN PHẨM DẠNG I
HỆ THỐNG ĐO ĐẠC VÀ PHÂN TÁCH CÁC PHÂN TỬ SINH HỌC
PROTEIN/ADN
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM


I. Hình ảnh hệ thống:

Hình ảnh tổng quát hệ thống đo đạc và phân tách các phân tử sinh học đặc hiệu



Hình ảnh bộ phận phân tách bằng từ trường (a); mẫu sinh học trước phân tách (b); và mẫu
sinh học sau phân tách (c).

(a) (b) (c)
II. Một số bo mạch điện tử đã nghiên cứu chế tạo:



Hình ảnh hai bo mạch xử lý tín hiệu (trước và sau khi tối ưu) đã thiết kế chế tạo.

Hình ảnh một bo mạch nguồn sử dụng cho hệ thống đo đạc.





Hình ảnh sensor GMR chế tạo bằng công nghệ MEMS đã hoàn thành.

SẢN PHẨM DẠNG II

QUY TRÌNH GẮN KẾT CÁC PHÂN TỬ SINH HỌC
LÊN HẠT NANO SẮT TỪ
(THỰC HIỆN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM)
1. Hóa chất
- Các muối FeCl
2
và FeCl
3
được mua từ công ty Merck. 3-
Aminopropyltriethoxysilane, Glutardialdehyde được mua từ công ty Sigma. Các
hóa chất thông thường khác dùng để pha đệm nhưNaOH,sodium phosphate
dibasic, NaCl … được cung cấp bởi công ty Merck.
- Protein được sử dụng thí nghiệm này gồm có enzyme Alcalase của hãng
Sigma, và kháng thể kháng IgM của hãng Teco Diagnostics.
- ADN trong trường hợp này là các oligopeptide có gắn nhóm amino tại đầu 5’
được cung cấp bởi Shanghai Sangon Biological Engineering Technology and
Services.
2. Các thiết bị chính

STT Tên thiết bị Hình ảnh
01
Máy khuấy từ gia nhiệt
(HEIDOLPH, Đức)
02
Máy đồng hóa mẫu bằng sóng siêu âm
(MISONIC, Mỹ)

03
Bể điều nhiệt có lắc nóng lạnh
(GRANT, Anh)

04
Vortex
(IKA, Trung Quốc)



3. Quy trình gắn kết các phân tử sinh học lên hạt nano sắt từ
3.1. Tạo hạt nano sắt từ :
3.1.1. Quy trình thực hiện:

Hình 1: Quy trình tạo hạt nano sắt từ trong phòng thí nghiệm.

3.1.2. Các bước thực hiện như sau :
• Chuẩn bị 200 ml dung dịch (S1) gồm 100 ml FeCl
2
.4H
2
O 0.25 M và 100ml

FeCl
3
.6H
2
O 0.5 M và lọc bỏ phần rắn bằng màng lọc cellulose nitrate 0.45 µm.
• Chuẩn bị 200 ml NaOH 5 M (S2).
• Cho 100 ml nước cất và cốc thủy tinh 1 L và khuấy ở tốc độ 1000 rpm
• Cho S1 và S2 vào cốc thủy tinh và tiếp tục khuấy trong 5 phút
• Rửa dung dịch 3 lần với khoảng 600 ml NaCl, rửa tiếp 3 lần với khoảng 600 ml
nước cất. Dùng HCl 1M điều chỉnh pH dung dịch đến 7-8. Trong quá trình rửa, hạt ôxit
sắt từ được hình thành, hút bỏ phần dịch.
• Ph
ần dịch lỏng còn lại khoảng 200 ml.
• Thêm 800 ml methanol vào hỗn hợp trên. Sau khi khuấy trộn, hạt sắt từ được
tạo thành, loại phần dịch.
• Rửa lại 2 lần bằng methanol, mỗi lần khoàng 400 ml methanol để loại hêt nước
~ 1 % v/v, thể tích dung dịch cuối cùng thu được khoảng 250 ml.
3.2. Hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ :
Để thuận lợi cho quá trình gắn kết cả protein và ADN lên hạt nano sắt từ, chúng
tôi sử dụ
ng phương pháp gắn dẫn xuất của aminosilane được theo sau bằng việc phủ
glutardialdehyde như đã được mô tả bởi Hubbuch và cs. (2001) để họat hóa bề mặt của
chúng. Dẫn xuất aminosilane sẽ tạo lên trên bề mặt hạt sắt từ một lớp các nhóm amino
(-NH
2
), các nhóm chức này sau đó sẽ liên kết với nhóm aldehyde (-CHO) trên phân tử
glutardialdehyde. Nhóm –CHO còn lại của phân tử glutardialdehyde sẽ là cầu nối gắn
với phân tử protein thông qua các nhóm amino, sulfhydryl, phenolic hoặc vòng
imidazole …, hoặc với các nhóm amino đã được gắn lên trên các phân tử
oligonuleotide.

3.2.1. Quy trình gắn 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) lên hạt sắt từ:
a) Nguyên tắc phản ứng:

b) Quy trình thực hiện:

Hình 2: Quy trình gắn dẫn xuất aminosilane lên bề mặt hạt nano sắt từ
c) Thuyết minh quy trình:
• Hỗn hợp hạt sắt từ trong methanol (khoảng 250 ml) đã được chuẩn
bị ở trên được đồng nhất bằng cách khuấy 5 phút ở tốc độ 2000 rpm bằng
thiết bị đồng hóa mẫu.
• Bổ sung 10 ml 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) vào và bổ
sung thêm 5 ml axit gracial acetic ngay lập tức. Hỗn hợp tiếp tục được
đồng nhất bằng cách khuấy 10 phút ở tốc độ 13000 rpm và sau đó khuấy
120 phút ở tố
c độ 6000 rpm.
• Hỗn hợp phản ứng trên được cho vào cốc 500 ml đã có chứa 200
ml glycerol. Tiếp theo, thổi khí nitơ vào cốc và đun nóng ở 110
o
C trong
vòng 15,5 giờ - 16 giờ. Sau đó tiếp tục năng nhiệt lên 160
o
C trong 30 phút.
Trong suốt quá trình này hỗn hợp được khuấy ở tốc độ 600 rpm.
• Cuối cùng, hỗn hợp phản ứng được làm lạnh xuống nhiệt độ
phòng.
• Tiến hành rửa 3 lần với 200 ml NaCl 0,2M. Sau đó, rửa tiếp 3 lần
nữa với nước cất.
• Sau khi rửa thì hỗn hợp hạt đã được gắn với APTES sẽ được bảo
quản ở 4
o

C trong nước cất.
3.2.2. Phủ hạt nano sắt từ bằng Glutardialdehyde :
a) Nguyên tắc phản ứng:


b) Quy trình thực hiện:

Hình 3 : Quy trình phủ Glutardialdehyde lên hạt nano sắt từ có gắn aminosilane
c) Thuyết minh quy trình :
• 10 g hạt nano sắt từ có gắn aminosilane đã chuẩn bị ở trên được khuyếch tán trở
lại trong cốc thủy tinh có chứa sẵn 1200 ml nước cất, có khuấy nhẹ để phân tán
đều hạt vào dung dịch.
• Bổ sung 70 ml dung dịch Glutardialdehyde 50%. Điểu chỉnh để đạt giá trị pH =
11 bằng NaOH 1M.
• Giữ yên hỗn hợp trong khoảng 1 h để
phản ứng diễn ra (hình bên dưới). Lưu ý
theo dõi giá trị pH, điều chỉnh nếu cần thiết để giữ pH = 11.
• Sau khi hoàn tất phản ứng, hạt nano sắt được giữ lại bằng từ trường và loại bỏ
dung dịch phản ứng. Hạt sau đó được rửa 3 lần bằng 500 ml NaCl 0.2M. Giữ hạt
trong 500 ml nước cất.
• Hạt nano sắt từ đã đựợc họat hóa bề mặt sẵn sàng cho các quá trình gắn protein
hoặc ADN tiếp theo. Hat có thể được bảo quản trong nước cất tại 4
o
C.
3.3. Gắn các phân tử sinh học lên trên hạt nano sắt từ đã được họat hóa bề mặt
3.3.1. Gắn kết các phân tử protein
Quy trình gắn kết các phân tử protein với hạt nano sắt từ như sau :
• Pha loãng dung dịch protein để có nồng độ 1 mg/ml bằng dung dịch đệm
phosphate 0.01M pH 8.5 (hòa tan 0.71 g sodium phosphate dibasic trong 500 ml
nước cất).

• Rửa 8 mg hạt nano sắt từ đã họat hóa bề mặt bằng 500 ml đệm phosphate
0.01M, 3 lần.
• B
ổ sung 300 µl dung dịch protein đã được pha loãng vào 8 mg hạt nano sắt từ đã
được họat hóa bề mặt.
• Ủ dung dịch phản ứng qua đệm (> 20 h) ở 4
o
C.
• Sau khi kết thúc phản ứng, hạt nano sắt từ được giữ lại bằng từ trường, loại bỏ
dung dịch phản ứng. Hạt sau đó được rửa để loại bỏ các phân tử protein không
tạo liên kết.
• Quá trình rửa: rửa 3 lần bằng 500 ml NaCl 0.2M, rửa lại 3 lần bằng 500 ml nước
cất
• Hạt có gắn protein được giữ trong dung dịch muối NaCl 0.09% ở 4
o
C.
3.3.2. Gắn kết các oligonucleotide :
Các phân tử oligonucleotide, thực chất là một đoạn của phân tử ADN, được gắn
thêm nhóm amino (-NH
2
) ở đầu 5’. Quy trình gắn kết như sau :
• Rửa 8 mg hạt nano sắt từ đã họat hóa bề mặt bằng 500 ml đệm phosphate
0.01M, 3 lần.
• 8 mg hạt nano sắt từ này được khuếch tán vào trong 300 µl dung dịch đệm
phosphate 0.01M.
• Bổ sung thêm 10 µM oligonucleotide
• Ủ dung dịch phản ứng qua đêm (> 13 h) tại 37
o
C.
• Sau khi kết thúc phản ứng, hạt nano sắt từ được giữ lại bằng từ trường, loại bỏ

dung dịch phản ứng. Hạt sau đó được rửa để loại bỏ các oligonucleotide không
tạo liên kết.
• Quá trình rửa : rửa 3 lần bằng 500 ml NaCl 0.2M, rửa lại 3 lần bằng 500 ml
nước cất
• Hạt có gắn oligonucleotide được giữ trong dung dịch muối NaCl 0.09% ở 4
o
C.
Lưu ý
: Các thao tác cần tiến hành chính xác và nhanh chóng, tránh để hạt bị khô.






SẢN PHẨM DẠNG III
BÀI BÁO KHOA HỌC ĐĂNG TRÊN TẠP CHÍ TRONG NƯỚC
(Bài báo tiếng Anh)

Cao Xuan Huu, Pham Van Tuan, Dang Duc Long, Nguyen Thi Minh Xuan,
Measurement of Biological Concentration Using Magnetic Agents,
Journal of Science and Technology, University of Danang, Vol.12 (61) 2012, p. 40-46.

PHỤ LỤC 2: MẠCH XỬ LÝ TÍN HIỆU VÀ KẾT QUẢ MÔ PHỎNG
MẠCH THEO TÍN HIỆU THỰC
PL2.1. Mạch xử lý tín hiệu tổng quát

C9A
104
R29 0R

R1A
100K
C3A
104
+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U1
LTC2050
VCC_3.3V
C19A
0.1uF
+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U2

LTC2050
+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U3
LTC2050
R2A
10K
VCC_3.3V
Vout1
R3A 100K
AGND
R19A
10K
Vout5
12
J3A
JUMPER
AGND
AN_3
AGND
R5A
47K

Vref
R6A
47K
C5A
68nF
VCC_3.3V
C6A
68nF
Vref
R7A
47K
R8A
47K
VCC_3.3V
Vout4
C7A
68nF
R20A
10K, 0.1%
C8A
68nF
AGND
AGND
VCC_3.3V
VCC_3.3V
VCC_3.3V
R9A
10K
VCC_3.3V
NOTCH

R28A
10K
NOTCH
C1A
10uF
+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U4
LTC2050
AGND
AGND
AGND
SENSOR_OUTPUT
AGND
AN_1
+
3
-
4
V+
5
V-

2
OUT
1
U7
LTC2050
C11A
10uF
R22A
47K
R23A
47K
C20A
68nF
C21A
68nF
R24A
47K
R25A
47K
C22A
68nF
C23A
68nF
NOTCH_1
Vout2
R10A
100K
R12A
100K
+

5
-
6
V+
8
V-
4
OUT
7
U16B
OPA2364
AGND
AGND
VCC_3.3V
AGND
C2A
0.47uF
VCC_3.3V
VREF
AGND
R11A
10K
12
J4A
JUMPER
Vnext
C14A
0.2uF
C15A
0.2uF

AGND
R13A 1M
AN_2
+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U5
LTC2050
R21A
1M
R14A
909K
C13A
0.47uF
Dien tro chinh
xac cao. On
dinh 1.65V
R26
10K
R15A
10K
R16A
10K

+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U8
LTC2050
AGND
Vref
AGND
C24A
104
R17A1
100K
12
J2A
JUMPER
Vref
NOTCH_1
R4A
100K
AGND
VCC_3.3V
C4A
10uF

VCC_3.3VAGND
Vout3
12
J1A
JUMPER
R17A
330K
AGND
C25A
104
R18A
330K
AGND
C18A
104
R27A
10K
+
3
-
4
V+
5
V-
2
OUT
1
U6
LTC2050
C16A

104
C12A
104
AGND
C17A
0.1u
Vref
C10A
104


Mạch xử lý tín hiệu tổng quát. Các điểm lấy tín hiệu sau các tầng tại điểm khoanh tròn.
PL2.2. Các kết quả mô phỏng theo tín hiệu thực
TÍN HIỆU GỐC – SENSOR Output


TÍN HIỆU SAU TẦNG LỌC THÔNG THẤP 1 (Tại Vout1)


TÍN HIỆU SAU TẦNG LỌC THÔNG THẤP 2 (Tại Vnext)



TÍN HIỆU SAU TẦNG KHUẾCH ĐẠI (Tại Vout3)


TÍN HIỆU TẠI TẦNG CUỐI (Tại Vout4)

PHỤ LỤC 3: BẢN VẼ THIẾT KẾ CỦA MỘT SỐ THÀNH PHẦN CỦA
HỆ THỐNG ĐO ĐẠC
PL3.1. Giá sensor


PL3.2. Giá cuộn dây nam châm điện (Coil former)
PL3.3. Thanh trượt

PL3.4. Actuator

PL3.5. Giá lưu chuyển
Khối lưu chuyển 1

PL3.5. Giá lưu chuyển
Khối lưu chuyển 2
PL3.5. Giá lưu chuyển
Ốc trượt và đệm long đen