Nghiên cứu khả năng sử dụng cây Kiến Cò (Rhina canthus nasutus) để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÂY KIẾN CÒ (RHINA
CANTHUS NASUTUS) ĐỂ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC


CNĐT: HOÀNG PHƯƠNG LAN













9622

HÀ NỘI – 2012





1
MỤC LỤC

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ CHUYÊN DỤNG 3
DANH MỤC CÁC BẢNG 4
DANH MỤC CÁC HÌNH 5
MỞ ĐẦU 6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………………….8
1.1. ĐẶC ĐIỂM, PHÂN BỐ CỦA CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS) 8

1.2.VÀI NÉT VỀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 10

1.3. MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 11

1.4. RHINACANTHIN 163

1.5.PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT CHẤT CHIẾT TỪ CÂY KIẾN CÒ
(RHINACANTHUS NASUTUS)………………………………………………………….
.16
1.6. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG LIÊN QUAN TỚI CHẤT CHIẾT
CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)………………………………………18
1.7. VÀI NÉT ĐẠI CƯƠNG VỀ NAPHTOQUINON……………………………23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 235

2.1. VẬT LIỆU 255

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 255

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 255

2.3.1. Định lượng rhinacanthin trên HPLC 265

2.3.2 Qui trình chiết nhanh mẫu để phân tích rhinacanthin trên HPLC 255

2.3.3. Phương pháp thu nhận dịch chiết chứa rhinacanthin nồng độ cao 256

2.3.4. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu cây Kiến cò 266

2.3.5. Phương pháp đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu sinh hóa của cây Kiến cò 266

2.3.6. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết đối với sâu hại 277

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 288

3.1. NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT RHINACANTHIN TỪ CÂY KIẾN CÒ 288

3.1. 1. Xác định hàm lượng rhinacanthin trong lá, thân và rễ của cây Kiến cò 288

3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết xuất hoạt chất rhinacanthin 299

2
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 30

3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 322

3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và bột Kiến cò tới quá trình chiết rhinacanthin 332

3.1.6. Quá trình thu nhận dịch chiết chứa rhinacanthin nồng độ cao 34
3.2. NGHIÊN CỨU XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN NGUYÊN LIỆU CÂY KIẾN CÒ
(RHINACANTHUS NASUTUS) 376

3.2.1. Sự biến đổi hàm lượng tổng các rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây
Kiến cò sau thời gian bảo quản…………………………………………………….36
3.2.2. Đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu sinh hóa của nguyên liệu cây Kiến cò 37
3.3. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT CÂY KIẾN CÒ
(RHINACANTHUS NASUTUS) LÊN SÂU XANH VÀ SÂU KHOANG Ở
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM ……………………………………………… 40
3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS
NASUTUS) LÀM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC…………………………… 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 444

TÀI LIỆU THAM KHẢO 485

PHỤ LỤC
……………………………………………………………………………………….48
HỒ SƠ LIÊN QUAN 
3
DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
VÀ THUẬT NGỮ CHUYÊN DỤNG
TIẾNG VIỆT
BVTV Bảo vệ thực vật
TIẾNG ANH
WTO World Trade Organization (Tổ chức thương mại thế giới)

TNF-alpha Tumor Necrosis Factor-alpha
IL-4 Interleukin-4
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
CMV Cytomegalovirus
5-FU 5-Fluorouracil
PGE2
Prostaglandin E2
UV Ultraviolet (cực tím)
HPLC High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry
(Sắc ký khí khối phổ)
IR Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
LC
50
Lethal concentration ( Nồng độ gây chết)


4
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Hàm lượng rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây Kiến cò 288

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hàm lượng cao chiết Kiến cò và
hàm lượng tổng các rhinacanthin trong cao chiết Kiến cò 30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của độ etanol tới quá trình chiết xuất rhinacanthin……… 31

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết xuất rhinacanthin 322
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết xuất rhinacanthin từ cây Kiến cò………… 33
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và bột Kiến cò tới quá trình chiết rhinacanthin 346

Bảng 3.7. Sự biến đổi hàm lượng tổng các rhinacanthin trong lá, thân và rễ cây Kiến
cò sau thời gian bảo quản 388

Bảng 3.8. Một số chỉ tiêu sinh hóa của cây Kiến cò 388

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết Kiến cò (chưa pha phụ gia) lên sâu khoang và
sâu xanh bướm trắng……………………………………………………………….40
5
DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 1.1. Lá và hoa cây Kiến cò…………………………………………….………8
Hình 1.2. Cấu trúc của rhinacanthin-C 144

Hình 1.3. Cấu trúc của rhinacanthin-D 144

Hình 1.4. Chiết xuất phân đoạn cây Kiến cò………………………………………16
Hình 1.5. Xà phòng thảo mộc rhinacanthin làm trắng da 222

Hình 1. 5. Kem bôi mặt chứa các thành phần thảo mộc Pueraria Mirifica, Aloe
Barbadensis, Emblic Myrabolan Extrac, Rhinacanthus Nasutus 222

Hình 1.6. Chè hòa tan từ cây Kiến cò 222




6
MỞ ĐẦU

Hiện nay, dư lượng thuốc trừ sâu hóa học trong các sản phẩm nông
nghiệp tăng cao, gây mất an toàn cho người sử dụng, ảnh hưởng xấu tới môi
trường và sức khỏe cộng đồng. Ngoài ra, các sản phẩm làm ra không thể xuất
khẩu được nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập của nông dân. Đây cũng là một
thách thức lớn cho nông dân Việt Nam khi gia nhập WTO.
Để giảm thiểu tác động xấu c
ủa thuốc trừ sâu đến môi trường và cộng
đồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học đang thay thế
dần thuốc hóa học. Các thuốc trừ sâu sinh học là một trong những lĩnh vực mà
Hóa học xanh quan tâm và hướng tới. Do đó việc nghiên cứu, tìm kiếm nguồn
nguyên liệu mới để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học luôn luôn được thúc đẩy.
Nguồn nguyên liệu là cây Kiến cò (
Rhinacanthus nasutus) hy vọng sẽ mở ra
hướng nghiên cứu ứng dụng khả quan cho thuốc trừ sâu sinh học. Chất chiết
rhinacanthin từ cây Kiến cò đáp ứng đầy đủ của một thuốc trừ sâu tự nhiên,
nó có khả năng phân hủy trong môi trường ánh sáng sau 8 tuần, không độc hại
cho con người [14].
Trong Rhinacanthus nasutus chứa các hoạt chất rhinacanthin như là
rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, rhinacanthin-N,…có hoạt tính diệt sâu bọ,
kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, chống viêm, ho
ạt tính chống dị ứng,
ngăn ngừa khối u phát triển [5]. Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng dung môi
etyl axetat, etanol, methanol,…đều có thể chiết tách được rhinacanthin từ
Rhinacanthus nasutus [4,6].
Từ những năm 90 của thế kỷ trước, các nhà nghiên cứu Việt Nam tại
Viện Công nghệ sinh học đã đề cập đến việc sử dụng chất chiết cây Kiến cò
làm thuốc trừ sâu, nhưng chưa đi sâu nghiên cứu v
ề chất chiết rhinacanthin.
Gần đây nhất 9/2012 các nhà nghiên cứu Thái Lan đã nghiên cứu sử dụng

chất chiết rhinacanthin từ Rhinacanthus nasutus phục vụ trong nông nghiệp
[14].
7
Đề tài này là hướng nghiên cứu thăm dò nhằm khai thác và ứng dụng
hiệu quả hoạt tính diệt sâu hại của hoạt chất rhinacnathin từ cây Kiến cò tại
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất rhinacanthin từ cây Kiến cò
- Nghiên cứu xử lý và bảo quản nguyên liệu cây Kiến cò
- Khảo sát hoạt tính sinh học của dịch chiết cây Kiến cò lên sâu xanh và
sâu khoang ở trong phòng thí nghiệm
- Đánh giá khả năng ứng dụng cây Kiến cò làm thuốc trừ sâu sinh học

8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẶC ĐIỂM, PHÂN BỐ CỦA CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)
Mô tả : Là cây nhỏ mọc thành bụi, cao 1-2m, có rễ chùm. Thân non có
lông mịn. Lá mọc đối, có cuống, phiến hình trứng thuôn dài, mặt trên nhẵn,
mặt dưới hơi có lông mịn. Hoa nhỏ, mọc nhiều hoa ở nách lá hoặc đầu cành
hay ngọn thân. Hoa màu trắng nom như con hạc đang bay nên có tên gọi là
Bạch hạc. Quả nang dài, có lông.
Cây rất dễ trồng, mùa xuân hoặc mùa thu, trồng bằng cành, ra hoa tháng 8.

Hình 1.1. Lá và hoa cây Kiến cò
Thông thường sử dụng phần lá, cành và rễ cây[19].
Đặc điểm phân loại [5,7,11]
Giới
Plantae
Họ
Acanthaceae (Ô rô)
Phân giới
Viridaeplantae
Phân họ
Acanthoideae
Ngành

Tracheophyta
Giống Rhinacanthus
Phân ngành
Euphyllophytina
Tên Latin nasutus - (L.)
Lớp
Magnoliopsida
Tên thực vật Rhinacanthus nasutus (L.)
Phân lớp
Lamiidae
Liên bộ Lamianae
Bộ
Scrophulariales
9
Tại các quốc gia trên thế giới cây Kiến cò còn được gọi bằng những tên địa
phương khác nhau [5,11]:
Malaysia
Chabai Emas
English (Anh)
Snake Jasmine, Dainty spurs
Indonesia
Akar Teriba, Daun Burung
Philippines
Ibon-ibonan, Tagak-tagak (Tagalog)
China (Trung quốc)
Bai He Ling Zhi, Pai Ho Ling Chih, Hsuan-tsao
India (Ấn Độ)
Palakjuhi, Jahipani (Hindi); Gajkarni (Marathi);
Uragamali, Nagamalle (Tamil); Nagamulla,
Puzhukkoli (Malayam); Nagamalle (Telagu);

Nagamallige, Doddapatika (Kannada); Juipana
(Bengali) Damari (KonKani); Palakjuhi (Urdu);
Yudhikaparni, Yoodhikaparni (Sanskrit)
Spanish (Tây Ban
Nha)
Pajarito
Việt Nam
Nam uy linh tiên, Bạch hạc [17].
Phân bố: Cây Kiến cò phân bố nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Myanmar, Nhật
Bản và các nước Đông Nam Á khác [1,11]. Hiện nay, tại Ấn Độ và Thái Lan
đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân rộng vùng trồng nguyên liệu
cây Kiến cò[7].
Tại Việt Nam, cây Kiến cò được trồng ở nhiều nơi từ Bắc đến Nam: Hòa
Bình, Phú Thọ, Thường Tín (Hà Nội), Thái Bình,Bình Dương, Kiên Giang…,
tuy nhiên cây chưa được trồng thành vùng nguyên liệu, nên khi cần sử dụng
phải thu gom từ nhiều vùng khác nhau.
Thành phần hóa học
Trong cây Kiến cò (Rhinacanthus nasutus) có chứa các thành phần hóa học
chính là : rhinacanthin-C, rhinacanthin-D, rhinacanthin-N…, ngoài ra còn có
10
rhinacanthin-A, rhinacanthin-B, rhinacanthin-E, rhinacanthin-F, rhinacanthin-
Q, lupeol, b-sitosterol, stigmasterol [2,5,11].
Hàm lượng rhinacanthin trong lá Kiến cò : rhinacanthin-C (1,9%),
rhinacanthin-D (0,16%), rhinacathin-N (0,07%) [4,13].
Một số tài liệu lại chứng minh từ lá và cành cây Kiến cò tách chiết được các
thành phần flavonoid,benzenoid, coumarin, anthraquinon, quinon, glycoside,
cacbohydrate, triterpens, sterol, và chlorophyll. Rhincanthone (3,4 dihydro-
3,3-dimethyl-2H naptho[1,2-b]pyran-5,6dione) có tác dụng chính chống ung
thư. Ngoài ra, trong thành phần còn chứa dehydro alapachone, p-
hydroxybenzaldehyl, methyl vanillate syringaldehyde, lupeol, wogonin,

oroxylin A, praeruptorin và allantoin [4,11,13].
1.2. VÀI NÉT VỀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC
Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học thường được khuyến cáo sử dụng trong
các lĩnh vực sản xuất nông nghiệp sạch nói riêng và nền nông nghiệp bền
vững nói chung. Theo C
ơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc trừ
sâu có nguồn gốc sinh học (Biopesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch hại
có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên như thực vật, động vật, vi khuẩn và
khoáng chất. Khái niệm này bao hàm cả các chất tạo gen được cấy vào đối
tượng cây cần bảo vệ nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại.
- Thuốc trừ sâu vi sinh (Microbial Pesticides): Bao gồm các lo
ại vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm, virus, sinh vật đơn bào hoặc tảo) có khả năng phòng trừ
dịch hại, ví dụ thuốc trừ sâu vi sinh BT (Bacillus thuringiensis).
- Thuốc trừ sâu có nguồn gốc hóa sinh (Biochemical Pesticides) bao gồm
các chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng kiểm soát dịch hại theo cơ chế
không độc. Đó là các chất dẫn dụ (sinh dục hoặc thức ăn), các chất xua đuổi,
các chất điề
u khiển sinh trưởng côn trùng …
11
- Thuốc trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc (Botanical hoặc Plant Pesticides):
Hoạt chất là các chất thu được từ cây, cỏ, kể cả tinh dầu, ví dụ: Nicotin trong
cây thuốc lào hoặc thuốc lá, D-limonen từ tinh dầu cam, chanh
Gần đây, các nhà nghiên cứu hóa nông đưa ra định nghĩa về thuốc trừ
sâu có nguồn gốc sinh học đơn giản là các thuốc có nguồn gốc tự nhiên có thể
kiểm soát dịch hại theo cơ chế không độc, thân thiệ
n với môi trường sinh thái
và dễ sử dụng.
Đặc điểm ưu việt của thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học so với các thuốc
trừ sâu thông thường là:

- Ít độc hơn đối với người, gia súc và không ảnh hưởng tới các loài có ích
như chim, cá và các thiên địch.
- Phân hủy sinh học nhanh, ít để lại dư lượng trong môi trường và nông
phẩm nên thuốc rất thân thiện với môi trường và thường được thay thế các
thu
ốc trừ sâu thông thường trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp
(IPM) [17].
1.3. MỘT SỐ SẢN PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC
- Nguồn gốc thảo mộc: VINEEM 1500 EC – chiết xuất từ nhân hạt
Neem (Azadirachta indica A. Juss ) có chứa họat chất Azadirachtin, có hiệu
lực phòng trừ nhiều lọai sâu hại trên cây trồng như lúa, rau màu, cây công
nghiệp, cây ăn trái, hoa kiểng.
Hoạt chất Rotenone được chiết xuất từ hai giống cây họ
đậu là Derris
elliptica Benth và Derris trifoliata có tác dụng diệt trừ sâu rầy trên lúa, ốc
bươu vàng cũng như các lọai cá dữ, cá tạp trong ruộng nuôi tôm.
Karanjin – chiết xuất từ cây hoa đào Ấn Độ, Matrine – chiết xuất từ cây
khổ sâm, Saponin – bã trà
Chế phẩm Đầu trâu Bihopper ( hoạt chất Rotenone ) diệt tuyến trùng và
chế phẩm Olicide (Oligo – Sacarit) tăng sức đề kháng bệnh của cây trồng.
12
- Nguồn gốc vi sinh: Thuốc trừ sâu vi sinh BT (Bacciluss Thuringiensis
var.) có nguồn gốc vi khuẩn, phổ diệt sâu rộng và hữu hiệu đối với các loại
sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sản phẩm
thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT
Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc …
- Nguồn gốc nấm: sản phẩm VIBAMEC với hoạt chất Abamectin được
phân lập từ quá trình lên men n
ấm Steptomyces avermitilis. Diệt trừ sâu vẽ
bùa, nhện, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, bọ phấn; Ngoài ra cũng trong nhóm này

Vivadamy, Vanicide, Vali… có hoạt chất là Validamycin A, được chiết xuất
từ nấm men Streptomyces hygroscopius var. jingangiesis. Đây là nhóm thuốc
trừ bệnh có nguồn gốc kháng sinh đặc trị các bệnh đốm vằn trên lúa, bệnh
nấm hồng trên cao su, bệnh chết rạp cây con trên cà chua, khoai tây, thuốc lá,
bông vải…
Sản phẩm LUT 5.5 WDG (Mỹ) với hoạt chấ
t là Methylamine
avermectin, phổ tác động rất rộng (có thể trừ được nhiều loại sâu, bọ gây hại:
sâu tơ, sâu xanh, sâu vẽ bà, sâu đục quả, sâu đục than, nhện đỏ, nhện gié, bọ
trĩ, bọ xít xanh…).
Các chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma vừa có tác dụng đề kháng một số
nấm bệnh gây hại trên bộ rễ cây trồng như: bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi
là bệnh thối rễ do nấm Phytophthora
palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ
hay còn gọi là bệnh héo chậm do một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari,
Pythium sp, Sclerotium rolfosii.
Hai chế phẩm nấm trừ côn trùng Metarhizium anisopliae (nấm xanh) và
Beauveria bassiana (nấm trắng) là sản phẩm của Viện Lúa đồng bằng sông
Cửu Long với các tên thương mai: Ometar và Biovip
- Nguồn gốc virus: sản phẩm chiết xuất từ virus
Nucleopolyhedrosisvirus (NPV), loại virus có tính rất chuyên biệt, chỉ lây
nhiễm và tiêu diệt sâu xanh da láng ( Spodoptera exigua ) rất hiệ
u quả trên
một số cây trồng như bông, đậu đỗ, ngô, hành, nho …
13
Hai chế phẩm NPV (Nuclear polyhedrosis Virus) trừ sâu hại rau màu
và cây công nghiệp là sản phẩm của Viện BVTV với các tên thương mại: ViS
và ViHa.
- Pheromone: Là một nhóm chế phẩm sinh học có tác dụng dẫn dụ giới
tính, được sử dụng rộng rãi trong hệ thống bảo vệ thực vật cây trồng. Sản

phẩm tiêu biểu là Vizubon – D với hoạt chất Methyl Eugenol dẫn dụ đối với
ruồi đực rất mạnh. Trong sản ph
ẩm có pha trộn thêm chất diệt ruồi Naled. Đối
với sâu đục vỏ trái cam quýt (Prays citri Milliire) cũng đã được sử dụng
pheromone có hoạt chất Z(7)- Tetradecenal.
- Nguồn gốc tuyến trùng: tuyến trùng EPN (Entomopathogenic
nematodes) ký sinh và gây bệnh cho côn trùng, là tác nhân có nhiều triển
vọng bởi có khả năng diệt sâu nhanh, phổ diệt sâu rộng rộng, an toàn cho
người, động vật và không gây khả năng “kháng thuốc” ở sâu hại. Nhóm các
nhà khoa học ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vậ
t, Viện Khoa học và
Công nghệ VN đã sản xuất thử nghiệm 6 chế phẩm EPN có tên từ Biostar-1
đến Biostar-6, trong đó Biostar-3 và Biostar-5 được sản xuất hàng trăm lít để
thử nghiệm rộng rãi trên đồng ruộng[ 17].
1.4. RHINACANTHIN
Rhinacanthin là các dẫn xuất của naphtoquinon được tìm thấy trong cây
Kiến cò (Rhinacanthus nasutus), bao gồm các rhinacanthin-C, rhinacanthin-
D, rhinacanthin-N…, ngoài ra còn có rhinacanthin-A, rhinacanthin-B,
rhinacanthin-E, rhinacanthin-F, rhinacanthin-Q.
Các rhinacanthin tan trong nước, và các dung môi hữu cơ như etanol,
etyl axetate, metanol…
Chất chiết rhinacanthin được bảo quản ở nhiệt độ 4
0
C-30
0
C±2 trong điều
kiện kín, tránh ánh sáng trực tiếp. Theo dõi thấy, sau khi cho tiếp xúc với ánh
sáng, chất chiết rhinacanthin sẽ mất tính ổn định sau một tuần. Ở nhiệt độ
45
0

C, độ ẩm 75%, sau 8 tuần thì chất chiết rhinacanthin sẽ mất tính ổn định.
14
Dịch chiết rhinacanthin từ cây Kiến cò bằng methanol ở pH=5,5 ổn định
hơn so với pH=7 và pH=8.
Rhinacanthin có hoạt tính diệt sâu hại, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng
virut, chống viêm, có hoạt động chống dị ứng và gây độc tế bào [3,8,14].
Rhinacanthin- C dạng dầu, màu vàng, có công thức phân tử là C
25
H
30
O
5
,
trọng lượng phân tử 410,51.
Tên hóa học: 3-(1-Hydroxy-3,4-dioxo-3,4-dihydro-2-naphthalenyl)-2,2-
dimethylpropyl (2E,6E)-2,6-dimethyl-2,6-octadienoate

Hình 1.2. Cấu trúc của rhinacanthin-C
Rhinacanthin –D dạng tinh thể đỏ, có công thức phân tử là C
23
H
20
O
7
,
với trọng lượng phân tử 408,4.
Tên hóa học : [3-(3-hydroxy-1,4-dioxo-2-naphthyl)-2,2-dimethyl-propyl]
1,3-benzodioxole-5-carboxylate

Hình1.3. Cấu trúc của rhinacanthin-D

Rhinacanthin-N tinh thể vàng.
Rhinacanthin-C và –D đều đóng vai trò là chất chuyển hóa thứ sinh, không
tham gia trực tiếp vào quá trình sinh trưởng, và phát triển của cây [3,14].
Cả hai rhinacanthin-C và rhinacanthin-D đều có khả năng ức chế loại vi
rút CMV(cytomegalovirus) với liều lượng tương ứng là 0,02-0,22µg/mL, đó
là loại vi rút làm cho tế bào biểu mô to ra, gây nhiễm trùng cơ hội ở bệnh
15
nhân HIV đẩy nhanh tiến triển thành AIDS và tử vong, loại vi rút này cũng
gây bệnh ở trẻ sơ sinh. Đặc biệt rhinacanthin-C còn có khả năng chống lại
một loạt các vi khuẩn S.mutans, P.acnes, H.pylori, S.aureus, S.epidermidis và
C.albicans [5].
Rhinacanthin-C có khả năng chống sự tăng sinh tế bào tương đương với
5-FU (5-Fluorouracil) là thuốc chống ung thư kháng pyrimidin.
Rhinacanthin-Q một dẫn chất của 1,4 napthoquinon tách chiết từ rễ có
hoạt tính ngăn cản sự phân bào và kháng tiểu cầu [3,6,9,10,11,13,14].

Cấu trúc hóa học của rhinacanthin-A,-B và –O

Các rhinacanthin C, D, N, Q
Ngoài các rhinacanthin trên, tác giả Ấn Độ Suman Bukke (2011) còn cho rằng
trong cây Kiến cò chứa nhiều loại rhinacanthin khác mang những hoạt tính
sinh học [11]:

16

1.5. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT CHẤT CHIẾT TỪ CÂY KIẾN CÒ
(RHINACANTHUS NASUTUS)
Theo các patent số JP6234694 (A),JP4193874 (A), và JP2002087939(A);
đã đưa ra phương pháp chiết xuất các dẫn xuất của naphtoquinon từ lá, cành,
rễ khô của Rhinacanthus nasustus bằng methanol trong 5 giờ, nhiệt độ chiết
38-40
0
C, sau đó ly tâm loại bỏ cặn, được dịch chiết, cô hút chân không ở
nhiệt độ thấp loại dung môi, thu cao chiết, hòa cao chiết đó vào một lượng
nhỏ methanol và nước, rồi cho qua cột sắc ký hấp phụ, dung giải chất hấp phụ
17
bằng 80% methanol. Dịch thu được qua cột sắc ký, đem cô đặc và phân tích
hàm lượng các chất trong đó bằng HPLC.
Theo tác giả Haruka Horri và cộng sự (2011) đưa ra phương pháp chiết
tách các phân đoạn chiết từ cây Kiến cò như sau: Phần lá và cành, rễ đều được
chiết bằng methanol ba lần trong ba giờ. Các phần dịch chiết trong ba lần
được phối trộn với nhau và đem cô bay hơi chân không đến khô thu được cao
chiết lá và cành, cao chiết rễ. Cao chiết rễ
đem hòa vào 0,75l methanol và
75ml nước, sau đó phân chia bằng n-hexan, etyl axetat, n-butanol [4]:
Rễ cây R.nasutus (1,18kg)
Chiết bằng methanol 3 giờ, 3 lần
Cao chiết methanol (83,1g)

Phân đoạn n-hexan (6,55g) Lớp dung dịch chứa methanol
Phân chia giữa etyl axetat/ H
2
O

Phân đoạn etyl axetat (17,0g) Lớp H
2
O

Phân chia giữa n-Butanol/ H
2
O


Phân đoạn n-Butanol(11,7g) Phân đoạn H
2
O
Hình 1.4. Chiết xuất phân đoạn chất chiết cây Kiến cò
Tác giả R.Nirmaladevi và cộng sự (2010) cũng sử dụng methanol để chiết
các thành phần có hoạt tính sinh học từ lá Kiến cò và sấy cao chiết ở 60
0
C,
tránh ánh sáng. Tác giả đã dùng phép phân tích HPLC, GC-MS và phổ hồng
ngoại IR nhằm nhận dạng các thành phần tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa
trong cao chiết Kiến cò [4,13].
Theo tác giả M.Upendra Rao và cộng sự (2010) các hoạt chất rhinacanthin
của Rhinacanthus nasutus được chiết bằng etanol và etyl axetat. Rễ cây được
rửa sạch, để khô ở 30-40
0
C, nghiền thành bột thô. Chiết bột thô bằng
18
methanol trong thiết bị soxhlet. Phần chiết methanol được cô ở dưới 45
0
C,
điều kiện áp suất giảm, thu dịch khan, dùng cho dược. Hoặc dùng etyl axetat

chiết 200 gam bột lá trong 1 giờ, dịch chiết được cô lại tới khan thu được 9,6g
chất chiết thô. Lấy 5g chất chiết này đem sắc ký bằng silicagel dùng clorofom
dung giải để thu các phân đoạn khác nhau. Sau đó một phân đoạn được sắc ký
tiếp bằng cột sephadex LH-20, dùng methanol dung giải thu được ba phân
đoạn. Phân đoạn 1 và 2 được sắc ký tiếp trên cộ
t sephadex LH-20, cuối cùng
thu được rhinacanthin-C (1,450 mg) và rhinacanthin-N (3,14 mg). Phân đoạn
khác được tinh chế trên cùng cột sephadex để thu rhinacanthin-D (2,25mg).
Cấu trúc của rhinacanthin-C, rhinacanthin-N, rhinacanthin-D phân tích, so
sánh với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (
1
H-NMR và
13
C-NMR)[5].
1.6. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG LIÊN QUAN TỚI CHẤT
CHIẾT CÂY KIẾN CÒ (RHINACANTHUS NASUTUS)

Đã có khá nhiều công trình nghiên cứu hiện đại về cây Kiến cò
(Rhinacanthus nasutus) của các nhà khoa học Thái Lan, Nhật Bản, Ấn Độ,
Trung Quốc, và một số nước khác. Họ đã chứng minh trong cây Kiến cò chứa
những dẫn chất mang nhiều hoạt tính sinh học giá trị, mở ra hướng ứng dụng
triển vọng.
Hoạt tính diệt sâu
Từ những năm 90 của thế kỷ trước các nhà khoa học Việt Nam tạ
i Viện
Công nghệ sinh học, Nguyễn Hoàng Tỉnh và cộng sự (1998), đã nghiên cứu
thấy trong cây Kiến cò chứa hàm lượng glucozit cao tới 2,3%, và đã chứng
minh dịch chiết thô Kiến cò có hiệu lực trừ sâu xanh và sâu tơ. Cụ thể là dịch
chiết thô đó được pha loãng 10,20,50,100,200 lần rồi phun lên sâu tơ và sâu
xanh, kết quả cho thấy ở nồng độ pha loãng 20 lần, sau 4 giờ, cả sâu xanh và

sâu tơ đều chết 100%, càng pha loãng thì hiệu lực diệt sâu càng gi
ảm. Pha
loãng đến 200 lần thì hiệu lực diệt sâu rất thấp.
Gần đây nhất, tháng 9/2012, các nhà khoa học tại đại học Madihol (Thái
Lan), Pethuan S và cộng sự công bố rằng trong cây Kiến cò (Rhinacanthus
19
nasutus) chứa ba thành phần rhinacanthin-A, -B, và –C đều có hoạt tính diệt
sâu khoang (Spodoptera frugiperda) và ức chế muỗi gây bệnh sốt rét
Anopheles minumus[14].
Hoạt tính kháng vi rút
Từ lâu, tác giả người Thái Lan Anna SendlA và cộng sự (1996) đã chứng
minh hai napthoquinone, rhinacanthin-C và rhinacanthin-D tách chiết từ cây Kiến
cò (Rhinacanthus nasutus) có khả năng ức chế vi rút CMV (cytomegalovirus).
Rhinacanthin E và F có hoạt tính kháng vi rút cúm tuýp A [5,11].
Hoạt tính kháng vi khuẩn
Năm 2010, tại khoa Hóa dược, Đại học Dược Annamacharya (Ấn Độ),
tác giả M.Upendra Rao cùng cộng sự khẳng đị
nh thêm hoạt tính kháng khuẩn
của cao chiết Rhinacanthus nasutus, chất chiết thô thể hiện khả năng kháng vi
khuẩn kỵ khí gram dương Streptococcus mutans, Propionibacterium acnes
với nồng độ là 4-32mcg/ml, kháng vi khuẩn hiếu khí gram dương
Streptococcus aureus, Streptococcus epidermidis với nồng độ tương ứng 256
và 512mcg/ml. Chỉ có chất chiết thô mới có khả năng kháng vi khuẩn gram
âm hiếu khí Helicobacter pylori với nồng độ 512mg/ml. Cao chiết Kiến cò
chứa hàm lượng rhinacanthin cao tới 70% có hoạt tính diệt khuẩn t
ốt. Sở dĩ
như vậy có thể là do tác dụng cộng hưởng của các rhinacanthin[5,11].
Hoạt tính kháng nấm
Kodam et.al.(2007) đã tách được một dẫn xuất của napthopyran (3,4-
dihydro-3,3-dimethyl-2H-naphtho[2,3-b]pyran-5,10dione) từ cây Kiến cò có

hoạt tính kháng nấm. Cao chiết Kiến cò dạng cô đặc chứa hàm lượng tổng
rhinacanthin cao khoảng 75% ức chế các loại nấm Trichophyton rubrum,
Trichophyton mentagrophytes và Microsporum gypserum. Khả năng kháng
nấm, nhất là nấm ngoài da của chất chiết thô và rhinacanthin-C là tương
đươ
ng [5,2,11]
Hoạt tính chống ung thư
20
Tác giả Pongpun Siripong và cộng sự (2006,2009) chứng minh rằng các
rhinacanthin từ rễ và lá Kiến cò đều có khả năng chống ung thư và chống tăng
sinh tế bào. Rhinacanthin-D, -C và –Q chiết tách từ rễ đều có khả năng ức chế
sự tăng sinh của tế bào HeLa (tế bào bất tử - có thể phân chia hoàn chỉnh bên
ngoài cơ thể), tạo nên hướng điều trị bệnh ung thư cổ tử cung ở người có sử
dụ
ng các rhincanthin sẽ rất triển vọng và hứa hẹn thành công [8,9,15,16]. Tác
giả Nhật Bản Haruka Horii và cộng sự (2011) phát hiện cao chiết từ rễ Kiến
cò có hoạt tính ngăn phân bào tốt hơn cao chiết từ ngọn. Phân đoạn chiết bằng
etyl axetate ức chế chất hoạt hóa cơ quan thụ quan có hiệu quả nhất, tiếp theo
là phân đoạn chiết bằng n-hexan, n-butanol và phân đoạn chiết bằng nước.
Cao chiết rễ
Kiến cò bằng etanol và methanol đều chứa chất điều khiển tế bào
hủy xương [4].
Hoạt tính kháng viêm
Supinya Tewtrakul và cộng sự (2009) nhận thấy ba dẫn xuất
naphthoquinone (rhinacanthin A, D, N) tách chiết từ lá có hoạt tính chống
viêm rất mạnh. Hoạt tính chống viêm biểu hiện thông qua quá trình ức chế
NO (nitơ oxit) và sự giải phóng prostaglandin E2 [15]. Một nghiên khác của
tác giả Punturee K (2004) cho thấy chất chiết từ lá Rhinacanthus nasutus có
thể làm cho các đại thực bào tăng hoặc gi
ảm sinh ra NO thông qua biểu hiện

của TNF-alpha (Tumor Necrosis Factor-alpha) – một protein tế bào có thể
kích thích trực tiếp quá trình viêm. Tuy nhiên tác giả Kupradinun P và cộng
sự (2009) lại cho rằng dịch chiết Rhinacanthus nasutus từ rễ không có hiệu
quả đối với viêm đại tràng [15,11].
Hoạt tính chống dị ứng
Supinya Tewtrakul và cộng sự (2009) chứng minh ba dẫn chất
naphtoquinon: rhinacanthin-C,-D,-N chiết từ lá Rhinacanthus nasutus có khả
năng chống dị ứng rất tốt, chúng kháng lại kháng nguyên sinh enzym β-
hexosaminidaza đánh d
ấu quá trình mất hạt nhỏ trong các tế bào bạch cầu ưa
kiềm RBL-2H3. Ba chất này cũng kháng lại kháng nguyên sinh các protein
TNF-alpha và IL-4 (Interleukin-4) [5,16,11].
21
Tác nhân diệt ấu trùng muỗi
Yupha Rongsriyam và cộng sự (2006) đã công bố chất chiết
Rhinacanthus Nasutus có thể ức chế ấu trùng muỗi Aedes aegypti và Culex
quinquefasciatus. Chế phẩm dạng viên chứa 5-10% chất chiết thô và lactose
thể hiện khả năng diệt muỗi Aedes aegypti khác nhau nhiều, nồng độ gây chết
LC
50
trong 48 giờ tương ứng là 13,6 và 14,2 mg/l. Khả năng diệt muỗi Culex
quinquefasciatus cũng tương tự, liều gây chết LC
50
là 18,7 và 17,3 mg/l
(p>0,05). Trong khi đó cả hai nhóm ấu trùng đều không bị chết vì dung dịch
đường lactose và nước dechlorinate [5,11].
Ngoài ra, hai tác giả Ấn Độ, Pasupuleti Visweswara Rao và Malepati
Dhananjaya Naidu (2010) nghiên cứu trên hai nhóm chuột mắc bệnh tiểu
đường và chuột bình thường sau khi được tiêm cao chiết lá Rhinacanthus
Nasutus với liều lượng 200mg/kg, theo dõi sau 8 giờ lượng đường trong máu

ở cả hai nhóm giảm đáng kể, đây là tín hiệu tốt cho việc sản xuất thuốc trị
bệnh tiểu đường [12].
Trên thế
giới, từ lâu cây Kiến cò đã được nghiên cứu và ứng dụng vào
ngành y học cổ truyền. Rhinacanthus Nasutus được biết đến là cây thuốc dân
gian đã được sử dụng hàng nghìn năm nay ở Ấn Độ. Lá và rễ cây Kiến cò
được sử dụng nhiều ở các nước Đông Nam Á điều trị các bệnh ngoài da, lao
phổi, mụn rộp [1,2,5,11]. Đây là cây thuốc dân gian Việt Nam, dùng để chữa
eczema, hắc lào, lang ben, đau thần kinh t
ọa do lạnh, trị đau nhức khớp do
phong hàn thấp [19]. Cách thức dùng khá đa dạng. Ở Ấn Độ, rễ và lá tươi giã
nát trộn với nước cốt chanh bôi lên vùng da bị nhiễm trùng. Người Philipin sử
dụng nhựa từ rễ và lá hoặc sắc lấy nước để trị bệnh tiểu đường, bệnh viêm
gan, bệnh huyết áp, trong khi người Thái lấy rễ và lá ngâm với cồn hoặc dấm.
Người Malayxia phối tr
ộn nước ép của rễ và lá Kiến cò với benzoin và
sulphua để trị bệnh ecpet mảng tròn. Ở Ấn Độ theo phương pháp cổ truyền,
rễ của cây Kiến cò còn dùng để giải độc vết rắn cắn. Dịch chiết lá bằng ete
dầu có tác dụng diệt muỗi [1,2,5,11].
22
Cao chiết từ cây Kiến cò sử dụng làm mỹ phẩm rất tốt. Xà phòng tắm có
chứa hoạt chất rhinacanthin được dùng ở châu Á nhiều thế kỷ nay. Hiện tại,
hãng mỹ phẩm BeautiqueThai của Thái Lan sử dụng cao chiết rhinacanthin từ
cây Kiến cò vào một số sản phẩm như xà phòng tắm trắng cho cả nam và nữ,
có tác dụng kháng khuẩn, làm sạch da tốt, sản phẩm có tính bazơ nhẹ làm ổn
định cân bằng pH t
ự nhiên của da, được người tiêu dùng rất ưa chuộng [22].

Hình 1.5. Xà phòng thảo mộc rhinacanthin làm trắng da
Tác giả Nakaguchi Osamu và cộng sự (2002) cho rằng cao chiết

rhinacanthin từ cây Kiến cò có tác dụng kích thích mọc tóc vô cùng hiệu quả,
độ an toàn cao, ứng dụng để sản xuất thuốc kích thích mọc tóc và mỹ phẩm
ngăn ngừa rụng tóc [6].
Công ty Lanna Health Hub (Thái Lan) đã tung ra thị trường loại kem
dưỡng da Teen Face, thành phần chứa cao chiết Rhinacanthus Nasutus, làm
đẹp da, sạch khuẩn, không bị mụn trứng cá, được giới trẻ rất ưa chuộng.

Hình 1.6. Kem bôi mặt chứa các thành phần thảo mộc Pueraria Mirifica, Aloe
Barbadensis, Emblic Myrabolan Extrac, Rhinacanthus Nasutus
Công ty Rasksa Thai Herbs của Thái Lan có sản phẩm chè thảo mộc
Rhinacanthus Nasutus dùng cho người bị dị ứng với thuốc men và thịt muối
[23].

Hình 1.7. Chè hòa tan từ cây Kiến cò
23
Chất chiết cây Kiến cò được ứng dụng nhiều vào các sản phẩm phục vụ con
người như vậy, nên khi sử dụng chất chiết này để sản xuất thuốc trừ sâu sinh
học sẽ có độ an toàn cao, và thân thiện với con người.
1.7. VÀI NÉT ĐẠI CƯƠNG VỀ NAPHTOQUINON
Hoạt chất rhinacanthin từ cây Kiến cò là dẫn xuất của naphtoquinon, nên
cần có hiểu biết sơ lược về naphtoquinon.
Naphtoquinon là dẫn xuất c
ủa naphthalen, có màu vàng, vàng cam hoặc đỏ.
Ba đồng phân của napthtoquinon là: 1,2- napthtoquinon, 1,4- napthtoquinon
(có dẫn xuất là vitamin K), và 2,6- napthtoquinon. Ngoài ra trong tự nhiên
còn nhiều dẫn xuất của naphtoquinon như: juglone, plumbagin, droserone.
Các dẫn xuất của naphtoquinon mang nhiều hoạt tính sinh học quan trọng:
diệt sâu hại, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi rút, chống viêm, hạ sốt. Các
thực vật chứa naphtoquinon phổ biến ở Trung Quốc, các nước Đông Nam á,
và Nam Mỹ. Thường dùng trị bệnh ác tính và ký sinh trùng.

Naphtoquinon được ứng dụng rộng rãi: nguyên liệu sả
n xuất các loại
thuốc bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, thuốc diệt ve, chất sát trùng), dùng làm
chất ức chế trùng hợp, làm nguyên liệu sản xuất thuốc sốt rét, sản xuất
vitamin K, vật liệu sản xuất nhựa, chất xúc tác khử lưu huỳnh, xúc tác làm
chất nhuộm [24].
1,2- napthtoquinon còn gọi là ortho-naphthoquinone, là hợp chất hữu cơ
chứa nhiều vòng thơm
1,4-naphtoquinon là tinh thể hình kim, vàng dễ bay hơi, mùi hă
ng, cay
tương tự benzoquinon. Hầu như không tan trong nước lạnh, tan nhẹ trong
ether dầu, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ phân cực: tan tốt trong rượu
nóng, benzen, ether, chloroform, cacbon dioxit. Tan trong axit sulfuric. Trong
dung dịch kiềm nó tạo ra màu nâu đỏ.
24

1,2- napthtoquinon

1,4-naphtoquinon
Naphtoquinon là cấu trúc cơ bản của nhiều hợp chất tự nhiên. Hai loại
vitamin K1(phylloquinone) và vitamin K2( menaquinone) đều là dẫn xuất của
naphtoquinon.
phylloquinone

menaquinone
Vitamin K3 là dẫn xuất của naphtoquinon đơn giản hơn hai loại trên, gọi
là 2-methyl-1,4-naphtoquinon, có hoạt tính tương đương vitamin K1 và K2.