Nghiên cứu sự khác biệt di truyền của các nhóm bò vàng địa phương bằng chỉ thị phân tử

i


BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN




CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN




BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC NHÓM
BÒ VÀNG ĐỊA PHƯƠNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ





Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Chăn Nuôi
Chủ nhiệm đề tài : TS. Phạm Doãn Lân

Hà Nội - 2012
ii

MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
MỞ ĐẦU 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÒ NUÔI 5
1.1.1. Sự phân loại bò nuôi 5
1.1.2. Nguồn gốc thuần hoá bò nuôi 7
1.1.3. Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay 9
1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SAI KHÁC DI TRUYỀN 10
1.3. CHỈ THỊ MICROSATELLITE 11
1.3.1. Giới thiệu 11
1.3.2. Vai trò của microsatellite 13
1.3.3. Phương pháp xác định microsatellite 14
1.4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA) 17
1.5. NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở BÒ 19
1.5.1. Sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình protein 19
1.5.2. Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN hệ gen ty thể 19
1.5.3. Sử dụng kỹ thuật microsatellite 21
1.6. NGHIÊN CỨU VỀ CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG THỊT 22
1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 23
CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NGOẠI HÌNH CỦA MỘT SỐ NHÓM
BÒ VÀNG VIỆT NAM 25
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG 25
2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 27
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 27
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu 27
2.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
2.3.1. Đặc điểm chung của bò Vàng Việt Nam 28
2.3.2 Khối lượng và kích thước của bò Vàng Việt Nam 29
2.3.3. Một số nhóm bò vàng Việt Nam khác 37
2.3.3. Giống bò Brahman đỏ 48
CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU SAI KHÁC DI TRUYỀN VÀ MỐI QUAN HỆ DI
TRUYỀN GIỮA CÁC NHÓM BÒ BẰNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE 52
3.1. GIỚI THIỆU CHUNG 52
3.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 53
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu: 53
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu 54
3.2.3 Phân tích thống kê 57
3.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60
3.3.1. Kết quả phân tích kích thước alen của các locút microsatellites 60
3.3.2. Số lượng và tần số alen của các locút microsatellite 64
3.3.3. Đa dạng di truyền và cân bằng Hardy-Weinberg 71
3.3.4. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm bò 75
iii

3.3.5. Kết quả xác định khả năng phân thành các nhóm di truyền (giống) khác biệt 79
3.4. KẾT LUẬN 82
CHƯƠNG 4: NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG ADN TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ
NGUỒN GỐC Ở CÁC NHÓM BÒ VÀNG 83
4.1. GIỚI THIỆU CHUNG 83
4.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 84
4.2.1. Đối tượng nghiên cứu 84
4.2.2. Nhân ADN đặc hiệu (PCR) 84

4.2.3. Phương pháp giải trình tự 84
4.2.4. Phân tích trình tự 87
4.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 87
4.3.1. Kết quả nhân đặc hiệu (PCR) vùng D-loop ty thể 87
4.3.2. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng Hà Giang 88
4.3.3. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng Lạng Sơn 90
4.3.4. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng Thanh Hóa 92
4.3.5. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng Nghệ An 94
4.3.6. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng Phú Yên 96
4.3.7. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng U đầu rìu 98
4.3.8. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở nhóm bò vàng Bà Rịa 100
4.3.9. Đa đạng di truyền ADN ty thể ở giống bò Brahman 102
4.3.10. Đa dạng di truyền ở bò vàng Việt Nam và mối quan hệ di truyền với một số quần thể
bò khác 104
4.4. KẾT LUẬN 109
CHƯƠNG 5: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ ỨNG CỬ
GEN LIÊN KẾT VỚI CHẤT LƯỢNG THỊT Ở BÒ VÀNG VIỆT NAM 110
5.1. CƠ SỞ KHOA HỌC 110
5.1.1. Tính trạng mỡ giắt (marbling) 110
5.1.2. Tính trạng mềm của thịt 111
5.1.3. Một số ứng cử gen liên quan đến tính trạng mỡ giắt 112
5.1.4. Ứng cử gen liên quan đến tính trạng mềm thịt 115
5.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 116
5.2.1. Đối tượng nghiên cứu 116
5.2.2. Phương pháp nghiên cứu 117
5.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 121
5.3.1. Kết quả phân tích đa hình đoạn gen TG5 121
5.3.2. Kết quả phân tích đa hình đoạn gen DGAT1 125
5.3.3. Kết quả phân tích đa hình chỉ thị CAPN1-316 và CAPN1-4751 gen CAPN1 130
5.4. KẾT LUẬN 138

CHƯƠNG 6: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 140
6.2. KẾT QUẢ DẠNG II, III 141
6.3. KẾT QUẢ DẠNG 4 142
CHƯƠNG 7: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 144
7.1. KẾT LUẬN 144
7.2. ĐỀ XUẤT 145
TÀI LIỆU THAM KHẢO 147
iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADN: Deoxyribonucleic acid (một dạng vật chất di truyền)
AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn
nhân chọn lọc)
BN: Bò ngoại (Brahman)
Bp: Base pair (cặp bazơ)
BR: Bà rịa Vũng Tàu
D-loop: Displacement loop (vùng điều khiển trên phân tử ADN ty thể)
EDTA: Ethylen-Diamin-Tetra-Acetic acid
FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lương thế giới)
HG: Hà Giang
ISAG: International Society of Animal Genetis (Hội di truyền động vật quốc tế)
KL: Khối lượng
KT: Kích thước
LS: Lạng Sơn
LSM: Trung bình bình phương nhỏ nhất
MPX: Multiplex PCR (phản ứng PCR đa mồi)
NA: Nghệ An
NJ: Neighbor – Joining Method (phương pháp liên kết nhóm liền kề)
PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
PY: Phú Yên

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (đa hình độ dài các đoạn ADN
nhân ngẫu nhiên)
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn cắt
enzyme giới hạn)
SE: Sai số chuẩn
v

SNP: Single Nucleotide Polymorphisms (đa hình các đơn nucleotid)
SSCPs: Single Strand Conformation Polymorphisms (đa hình cấu trúc sợi đơn)
TB: Trung bình
TH: Thanh Hóa
UPGMA: Unweighted Paired Group Method of Arithmetic Average
UR: U đầu rìu
UV (Ultra Violet) Đèn cực tím
VNTR: Variable Number of Tandem Repeats (chỉ các vùng của hệ gen đặc trưng
bởi sự lặp lại của cùng một trình tự ADN)
2

MỞ ĐẦU
Việc bảo tồn và sử dụng có hiệu quả nguồn đa dạng sinh học nói chung và
nguồn gen động vật nuôi nói riêng hiện nay đang là vấn đề cấp thiết. Do áp lực của
nền kinh tế thị trường đòi hỏi các giống có năng xuất cao nên rất nhiều giống vật
nuôi bản địa đang có nguy cơ bị mất đi vì vậy mà mất đi nguồn gen đặc trưng quý
báu của nó.
Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng trên 3500 giống
vật nuôi, trong đó có khoảng 815 giống bò khác nhau. Tuy nhiên đây là con số
thống kê chưa đầy đủ vì nhiều giống bò bản địa khác vẫn chưa được phát hiện đồng
thời nhiều giống cũng đang có nguy cơ bị mất đi do không được bảo tồn tốt. Những
nghiên cứu về tiến hóa đã cho thấy rằng các giống bò nuôi hiện nay thuộc hai nhóm
bò có u (Bos indicus) và bò không có u (Bos taurus), chúng có cùng nguồn gốc từ

loài bò rừng cổ (Bos primigenius primigenius) tuy nhiên chúng được thuần hóa từ
những địa điểm khác nhau sau đó di cư cùng con người và được chọn lọc theo
nhiều hướng, cho đến nay tạo ra nhiều giống khác nhau phân bố ở khắp thế giới
(Lotus và cộng sự, 1994, MacHugh và cộng sự, 1997 ). Mối quan hệ di truyền
của 10 nhóm giống bò chính của Châu âu, Tây á và Bắc phi dựa trên sự đa hình
protein được Manwell và các cộng sự công bố đầu tiên năm 1980, các tác giả đã chỉ
ra rằng kết quả hoàn toàn phù hợp giữa đặc điểm kiểu hình với sự phân bố địa lý
của từng nhóm giống.
Trong những năm gần đây, Công nghệ gen phát triển mạnh đã cung cấp nhiều
chỉ thị (marker) và kỹ thuật di truyền phân tử như: microsatellile, PCR-RFLP, phân
tích trình tự ADN ty thể (mtADN). Các chỉ thị và kỹ thuật này đã và đang được sử
dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu nhằm hỗ trợ chọn tạo giống vật nuôi có năng
suất cao (marker assisted seletion), các nghiên cứu về đa dạng di truyền, các dự án
bảo tồn và sử dụng nguồn gen ở nhiều các đối tượng khác nhau.
3

Ở Việt Nam hiện có khoảng 7 nhóm bò vàng địa phương, mỗi nhóm chúng
mang những nét đặc trưng được chọn lọc theo sở thích của người dân và đáp ứng
với điều kiện khí hậu ở từng vùng. Các nhóm bò này thường có kích thước nhỏ
năng suất thịt, sữa thấp nhưng chúng lại có khả năng chịu được điều kiện khó khăn,
khả năng kháng bệnh và sinh sản tốt. Mặc dù đã có nhiều chương trình nhằm cải
tạo giống bò thịt được thực hiện ở nước ta trong nhiều năm qua như nhập các giống
bò thịt ngoại nhưng những nhóm bò địa phương vẫn chiếm đến 74% trong tổng số
đàn bò thịt của nước ta hiện nay do chúng đáp ứng tốt hơn với điều kiện khí hậu,
dinh dưỡng và phương thức chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ so với các giống bò nhập
ngoại. Đã có những quan điểm khác nhau về nguồn gốc và phân loại của những
nhóm bò này, một số cho rằng những nhóm bò này đều thuộc một giống bò vàng
Việt Nam trong khi đó một số khác lại cho rằng chúng là những giống địa phương
khác nhau và được đặt theo tên giống theo từng địa danh như: giống bò Mèo
(Hmông), Lạng Sơn, Thanh Hóa, Urìu Nghệ An, Phú yên, Bà Rịa. Tuy nhiên chưa

có một nghiên cứu nào làm sáng tỏ về mối quan hệ di truyền của các nhóm bò này
ở mức độ phân tử liệu chúng là những giống khác nhau hay thuộc cùng một giống,
chúng thuộc bò có u (Bos indicus) hay không có u (Bos taurus) đồng thời khai thác
những tiềm năng di truyền của các nhóm bò vàng địa phương này về tính trạng chất
lượng thịt phục vụ công tác chọn tạo giống bò thịt được thực hiện.
Để góp phần hiểu biết sâu hơn về bản chất di truyền của bò vàng Việt Nam nói
chung và các nhóm bò vàng địa phương nói riêng nhằm phục vụ cho việc bảo tồn
và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen bản địa của Việt Nam. Chúng tôi đã xây
dựng và thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự khác biệt di truyền của các nhóm bò
vàng địa phương bằng chỉ thị phân tử’’


4

Mục tiêu chung:
Phân biệt sự sai khác di truyền và mối quan hệ di truyền giữa các nhóm bò vàng địa
phương ở mức độ phân tử phục vụ công tác chọn tạo giống
Mục tiêu cụ thể:
- Xác định một số đặc điểm ngoại hình cơ bản của các nhóm bò vàng địa phương
- Xác định sự khác biệt di truyền và mối quan hệ di truyền của các nhóm bò vàng
địa phương ở mức độ phân tử
- Xác định ưu thế di truyền của một số gen liên quan đến chất lượng thịt (độ mềm
thịt) ở các nhóm bò vàng địa phương.
- Chọn và đề xuất được ít nhất 2 nhóm bò vàng địa phương có ưu thế về đặc điểm
ngoại hình và di truyền về chất lượng thịt phục vụ công tác chọn tạo giống
5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÒ NUÔI
1.1.1. Sự phân loại bò nuôi

Bò nuôi là thành viên của tông trâu bò hoang (Bovini) thuộc họ trâu bò
(Bovidae). Các thành viên khác của tông Bovini bao gồm bò rừng Bison - Mỹ
(Bison bison), bò rừng Châu Âu, bò rừng Banteng (Bos banteng), bò tót (Bos
gaurus) bò Tây Tạng-Yak (Poephagus mutus) và bò xám (Bos sauveli). Có hai loại
hình thái bò nuôi đã được xác định đó là bò Bos taurus (không có u) của Châu Âu,
Tây Phi, Bắc Á và bò Bos indicus hay còn gọi là bò zebu (bò có u) của Nam Châu
Á, Châu Phi. Hệ thống phân loại của các thành viên khác nhau thuộc tông Bovini
dựa trên cơ sở hình thái học cổ điển và các nghiên cứu phân tử gần đây được trình
bày ở hình 1.1.

Hình 1.1: Hệ thống phân loại của bò nuôi, bò hoang dã và một số loài liên quan
trong tông Bovini (nguồn: MacHugh 1996)
6

Sự khác nhau về hình thái và sinh lý giữa 2 loài phụ bò nuôi Bos indicus và
Bos taurus phản ánh sự đáp ứng rõ rệt với các điều kiện môi trường khác nhau. Bò
Bos indicus chủ yếu sống ở vùng khí hậu khô nóng hoặc bán khô nóng của Châu Á
và Châu Phi. Trong khi đó bò Bos taurus thường sống ở những vùng ôn đới có
lượng mưa cao. Bò Bos indicus có tỷ lệ trao đổi chất cơ bản và nhu cầu về nước
thấp hơn, tuyến mồ hôi to và hoạt động mạnh hơn, chúng có khả năng kháng với
bệnh ve và bệnh ký sinh trùng tốt hơn bò Bos taurus (Payne, 1995). Hơn nữa, Bos
indicus còn thể hiện các tập tính nhạy cảm và bản năng tập trung bầy đàn mạnh hơn
so với bò Bos taurus.
Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng tổ tiên hoang dã của tất cả bò nuôi hiện
nay là bò rừng cổ đã tuyệt chủng - Bos primigenious (Epstein và Mason, 1984). Bò
rừng cổ được cho rằng đã tiến hoá ở châu Á từ tổ tiên Bos acutfrons thuộc kỷ
Plioxen. Bò rừng cổ có phạm vi phân bố địa lý rất rộng, bằng chứng là những dấu
tích hoá thạch còn lại đã được tìm thấy tại những vị trí rất xa nhau như ở Anh và
Trung Quốc. Do sự phân bố trong phạm vi rộng như vậy nên dẫn đến hình thành
các loài phụ khác biệt về địa lý.

Có ít nhất 3 loài phụ bò rừng cổ đã được xác định: 1) Bos primigenius
primingenius ở phía Bắc vùng giáp châu Âu và châu Á, 2) Bos primigenius
opisthonomous ở Bắc Phi, 3) Bos primigenius mamadicus ở phía Nam Châu Á
(Epstein và Mason, 1984). Cả hai loài phụ ở Châu Phi và nam Châu Á được cho
rằng đã tuyệt chủng vào khoảng 2.000 năm trước trong khi đó bò rừng cổ Châu Âu
được cho rằng đã tồn tại đến tận thế kỷ 17. Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng cổ
trong thời kỳ đồ đá khoảng 12.000 trước Công Nguyên được thể hiện ở hình 1.2.
7


Hình 1.2: Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng cổ vào khoảng 12000 năm trước Công
Nguyên (nguồn MacHugh 1996)
1.1.2. Nguồn gốc thuần hoá bò nuôi
Trong hơn một thế kỷ qua, các nhà khảo cổ học đã rất khó khăn trong việc xác
định nguồn gốc thuần hoá bò nuôi. Đã có rất nhiều giả thiết khác nhau được đưa ra
chủ yếu căn cứ vào mô hình không gian và thứ tự niên đại để giải thích về nguồn
gốc và sự phổ biến của bò nuôi ngày nay. Một trong những điểm được thảo luận
nhiều nhất đó là liệu bò nuôi có nguồn gốc thuần hoá từ một điểm hay nhiều điểm
khác nhau. Một số giả thiết trước đây cho rằng bò nuôi ngày nay được thuần hóa tại
một địa điểm duy nhất ở phía Tây nam Châu Á và là bò Bos taurus vào khoảng
8

8000 – 10.000 năm trước công nguyên, sau đó chúng được phổ biến vào Châu Âu
cùng với sự di cư của những người chăn thả gia súc. Bò Bos indicus xuất hiện sau
đó là một dạng biến thái của bò Bos taurus để đáp ứng với sự thay đổi khí hậu và
nhu cầu thẩm mỹ, kinh tế của con người (Epstein và Mason, 1984). Tuy nhiên, các
nghiên cứu về khảo cổ và di truyền sau này đã chỉ ra rằng bò Bos indicus được
thuần hóa riêng biệt tại địa điểm khác với bò Bos taurus. Các bằng chứng về khảo
cổ và kết quả phân tích ADN ty thể cho thấy bò Bos indicus được thuần hoá ở phía
nam Pakistan và Ấn Độ, bò Bos taurus được thuần hoá tại khu vực Tây nam châu

Á (vùng Cận Đông) và có thể ở châu Phi. Nguồn gốc tổ tiên của bò Bos taurus
thuần hoá tại châu Phi và bò Bos indicus vẫn chưa được xác định, trong khi đó
nguồn gốc tổ tiên của bò Bos taurus thuần hoá tại vùng Cận Đông được xác định từ
loại phụ bò rừng cổ Bos primigenius primingenius (Meadow, 1984; 1993; Lotus và
cộng sự, 1994a)
Trong vòng một thiên niên kỷ sau đó, bò thuần hóa được phổ biến rất nhanh
cùng với những người nông dân thời kỳ đồ đá. Sự di cư rộng rãi của con người đã
làm cho phân tán bò khắp nơi trên thế giới, một số nhóm người di cư đến vùng bán
đảo Ả Rập, một số di cư đến phía bắc, tây và đông của Châu Phi, một số nhóm di
cư đến châu Âu và Ấn Độ. Sự mở rộng giao lưu và liên kết thương mại giữa các
nền văn minh mới hình thành sau đó đã làm cho phát tán và pha trộn của nhiều kiểu
bò khác nhau (Hình 1.3)
9


Hình 1.3: Sự phổ biến của bò thuần hoá ở khắp nới trên thế giới cổ sinh theo
Epstein và Mason (nguồn MacHugh, 1996).
1.1.3. Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay
Trải qua một thời gian dài chọn lọc và phát triển, hiện nay trên thế giới có
khoảng hơn 800 giống bò khác nhau. Chúng là các dạng biến thể của hai loài phụ
Bos taurus và Bos indicus. Sự phân bố các các loại bò nuôi khác nhau hiện nay ở
Châu Á, Châu Âu và Châu Phi được minh hoạ ở bản đồ hình 1.4. Trong đó, các
giống bò của Châu Âu đều thuộc loài phụ Bos taurus và có nguồn gốc thuần hoá từ
vùng Cận Đông. Ở phía đông bắc Châu Á chủ yếu phân bố của bò thuộc loài phụ
Bos taurus, ở khu vực Trung Á và Tây Á là sự phân bố của các giống thuộc bò Bos
indicus, ở phía Đông Nam châu Á bao gồm Việt Nam là bò lai giữa Bos taurus và
Bos indicus. Ở Châu Phi do sự du nhập của các nhóm bò Bos taurus từ phía Tây
Nam Á và bò Bos indicus từ Ấn Độ kết hợp với nhóm bò Bos taurus được thuần
10

hoá ở đây đã tạo nên sự đa dạng về kiều hình và sự phân bố, bao gồm các giống bò
thuộc loài phụ Bos indicus, Bos taurus và bò lai giữa hai loài phụ này.

Hình 1.4: Sự phân bố các loại bò ngày nay ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu
(nguồn: Daniel, 1998)
1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SAI KHÁC DI TRUYỀN
Sai khác di truyền có thể được đánh giá dựa trên nhiều đặc điểm khác nhau
bao gồm: các đặc điểm ngoại hình, protein, ADN hệ gen nhân và ADN hệ gen ty
thể. Trước đây phương pháp đánh giá đa dạng di truyền chủ yếu sử dụng các kỹ
thuật phân tích sự đa hình protein nhưng về sau này được thay thế bởi các phương
pháp phân tích ở mức độ phân tử ADN (Bảng 1.1). Trong số đó thì kỹ thuật
microsatellite và phân tích trình tự ADN ty thể là những kỹ thuật được sử dụng phổ
biến hiện nay để nghiên cứu sai khác và đa dạng di truyền của các quần thể vật nuôi
và động vật hoang dã.
11

Bảng 1.1: Đặc điểm của một số kỹ thuật phân tử được sử dụng đánh giá sai khác di
truyền
Phương pháp
Nguồn phân
tích
Áp dụng cho
các quần thể
hoang dã
Chi phí
Kiểu di
truyền
Electrophoresis
(điện di)
Máu, thận,

gan, lá cây
Không Thấp Đồng trội
Microsatellite ADN Có Trung bình Đồng trội
ADN
fingerprints
ADN Không Trung bình Trội
RAPD ADN Có Trung bình
thấp
Trội
AFLP ADN Có Trung bình cao

Trội
RFLP ADN Không Trung bình Đồng trội
SSCP ADN Có Trung bình Đồng trội
Giải trình tự
ADN
ADN Có Trung bình Đồng trội
SNP ADN Có Trung bình cao

Đồng trội

1.3. CHỈ THỊ MICROSATELLITE
1.3.1. Giới thiệu
12

Thuật ngữ microsatellite được Litt và Luty giới thiệu vào năm 1989 nhằm chỉ
các trình tự ADN lặp lại một cách liên tiếp (Tandemly repeated DNA sequence), có
độ dài chỉ vài cặp bazơ (2-6 bp), có tính đa hình cao và có thể được nhân lên bằng
phản ứng PCR.
Các microsatellite phân bố trên toàn bộ hệ gen, tập trung thành những đám

nhỏ (clusters) khoảng < 200bp và được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống đặc biệt là
ở những cơ thể sống có bộ gen lớn.
Bản chất đa hình của microsatellite có thể được sinh ra do sự nhân bội từ
ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai
đầu của vùng lặp lại.
Microsatellite được gọi bằng một số thuật ngữ như: các trình tự đơn giản lặp
lại (SSRs), các chuỗi lặp lại có trình tự ngắn (STRs), các dạng chuỗi đơn giản
(SSMs), hoặc các chuỗi lặp lại 2 nucleotide (di-nucleotide repeat), 3 nucleotide (tri-
nucleotide repeat), 4 nucleotide (tetre-nucleotide repeat) phụ thuộc vào độ dài các
đơn vị lặp lại của chúng. Tuy nhiên, người ta thường sử dụng thuật ngữ
microsatellite để thay thế cho tất cả những thuật ngữ trên và đã được hầu hết mọi
người chấp nhận. Microsatellite có tính đa hình rất cao (cao nhất trong tất cả những
dạng trình tự ADN lặp lại có trật tự đã nêu ở trên) và dạng microsatellite có tính đa
hình cao nhất (dạng không bị ngắt quãng) được sử dụng trong nhiều mục đích
nghiên cứu khác nhau. Nhưng trong thực tế thì các microsatellite thường bị ngắt
quãng, hoặc kết hợp giữa các loại trình tự lặp lại. Những chức năng rõ rệt của các
trình tự như vậy vẫn còn chưa rõ ràng mặc dù người ta có tìm thấy chúng tồn tại
giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Nhìn chung, ADN
microsatellite là một dạng phụ của gen, nhưng đôi khi, nó xuất hiện trong vùng
mang mã của một gen và làm tăng tính đa hình protein, trong một số trường hợp,
nó có thể là biểu hiện bệnh. Ngoài ra, một số dạng cấu trúc bền hơn của trình tự
13

ADN lặp lại cũng được phát hiện trên gen. Các kiểu microsatellite xuất hiện nhiều
hay ít dọc theo chiều dài hệ gen của động vật nhân chuẩn nhưng có thể được biểu
hiện khi nó nằm trong những vùng mang mã. Trong hệ gen microsatellite được
phân bố rất đều và ngẫu nhiên trên toàn hệ gen, người ta thấy rằng trung bình cứ
10000 nucleotide thì gặp một trình tự microsatellite.
Những đoạn lặp lại của polyA/polyT là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ
gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau ngoài ra còn có một số kiểu

lặp lại phổ biến khác như kiểu lặp lại 2 nucleotit như (CA)/(GT). Các nghiên cứu
về di truyền học và hóa sinh cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite
là do sự trượt lỗi của enzym polymerase trong quá trình sao chép ADN.
1.3.2. Vai trò của microsatellite
Các microsatellite được dùng như một chỉ thị (marker) di truyền để nghiên
cứu di truyền quần thể, quan hệ tiến hoá, lập bản đồ gen Tuy nhiên có rất nhiều
chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc
nhân tố điều hòa. Nhân tố điều hoà microsatellite được tìm thấy ở khắp nơi trong
phần trước của vùng bắt đầu phiên mã của trình tự mã hoá. Vùng điều khiển có
chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và
những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen.
Microsatellite cũng được thể hiện ra các protein bám mà các protein này có chức
năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng
thì gen có thể được khởi động và sao mã. Rất nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng
thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các
đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang
mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau ở
số lần lặp lại của một đoạn amino-acide giống nhau liên quan đến chức năng tác
động. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, ảnh hưởng chiều dài khác nhau
14

microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại
như một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite
như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thuyết cho rằng microsatellite có thể là
một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hoá
thích nghi (Kashi và cộng sự, 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại
nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc hoặc trôi dạt, nó hoạt
động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh
nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hoá
(King và cộng sự, 1997, 1999).

1.3.3. Phương pháp xác định microsatellite
Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ
Một phương pháp hiệu quả và ban đầu được sử dụng đó là dùng đồng vị
phóng xạ để xác định microsatellite. Người ta có thể đánh dấu phóng xạ vào một
đầu của primer (end-labelling) hoặc trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide
A,T,G,C được đánh dấu (incorporation-labelling), nhưng phương pháp end-
labelling thường được dùng thường xuyên hơn do có nhiều ưu điểm. Ngày nay,
phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm tới sức khỏe
con người và việc xử lý chất thải.
Phương pháp phát hiện không dùng đồng vị phóng xạ
Phương pháp nhuộm bạc: phương pháp này rẻ, không hại nhưng độ nhạy
không cao, đòi hỏi một số thủ tục phức tạp khi nhuộm.
Phương pháp lai ghép phân tử: cho phép xác định chính xác kiểu
microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai cùng một lúc, có thể xác định được
nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau thậm chí cả hai đoạn PCR có
kích thước bằng nhau. Tuy nhiên, việc xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế.
15

Phương pháp nhuộm huỳnh quang và sử dụng máy giải trình tự tự động:
phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự
nucleotide để phát hiện được sản phẩm PCR cần được đánh dấu bởi một chất
nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incoprration), khi kích thích bởi tia
lazer, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy có thể phát hiện
được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với ADN chuẩn, chúng ta
có thể có kích thước chính xác của đoạn ADN chúng ta quan tâm.
Trong các phương pháp kể trên thì phương pháp nhuộm huỳnh quang cho hiệu
quả cao nhất và hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm trên thế
giới. Người ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau,
trong cùng một phản ứng PCR và cùng một giếng điện di có thể chạy cùng nhau kể
cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ

màu huỳnh quang khác nhau.
Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại
này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Kết quả được thể hiện trên máy tính, qua
đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của alen, loại trừ những
băng lặp lại (stuter band) hoặc thêm một nucleotide A. Trong quá trình nhỏ mẫu
người ta nhỏ cách nhau từng giếng sau đó nhỏ lại để có thể xác định được mức độ
sang lấn giếng bên cạnh. Người ta thường thiết kế trong cùng một loại chất huỳnh
quang, kích thước trung bình của các alen cách nhau 50bp và chiều dài tốt nhất của
các đoạn ADN là từ 100-300 bp, do vậy mỗi chất nhuộm huỳnh quang tốt nhất là
dùng xác định từ 3-5 locút.
Trong những năm gần đây, kỹ thụât microsatellite đã được ứng dụng để
nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền của nhiều quần thể vật nuôi và hoang dã
với số lượng các locút được sử dụng rất khác nhau (Bảng 1.2).
16

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở vật nuôi sử dụng kỹ thuật
microsatellite
Loài vật
nuôi
Tác giả Đối tượng nghiên cứu
Số locút
microsatellite
Lợn
Kim và cộng
sự (2005).

Li và cộng sự
(2004)
Nghiên cứu cấu trúc di truyền
của một số giống lợn của Hàn

Quốc và Trung Quốc.
Nghiên cứu đa dạng di truyền
của 10 quần thể lợn bản địa
Trung Quốc.
16


20
Dê
Oliveira và
cộng sự (2007)

Nghiên cứu cấu trúc và đa
dạng di truyền của một số
giống dê Brazin.
13
Cừu
Diez-Tascon
và cộng sự
(2000)
Nghiên cứu đa dạng di truyền
của 6 giống cừu Merino.
20
Ngựa
Canon và cộng
sự (2000)
Nghiên cứu đa dạng di truyền
của 7 giống ngựa Tây Ban Nha
13
Trâu

Zhang và cộng
sự (2007)
Nghiên cứu sự đa dạng di
truyền và sự phân ly của quần
thể Trâu Trung Quốc.
30
Hươu nuôi
nhốt
Thevenon và
cộng sự (2004)

Nghiên c
ứu đa dạng di truyền
hươu sao Việt Nam
9
17

1.4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA)
ADN ty thể là một trong những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền quần thể (Nabholz và cộng sự, 2008). Cấu
trúc ADN ty thể ở động vật có dạng mạch vòng kín với độ dài vào khoảng 15-20 kb
và chứa đựng khoảng 37 gen (Hình 1.5).

Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ADN ty thể của bò nuôi
Vùng điều khiển D-loop (displacement loop) có kích thước khoảng 1 kb có vai
trò khởi đầu quá trình sao chép và phiên mã. Ở ADN ty thể, đặc biệt là ở một số
đoạn của vùng điều khiển (D-loop), cytochrome b và locút 12S rARN chúng có
mức độ tiến hóa rất nhanh và đã được chứng minh là rất hiệu quả trong việc nghiên
cứu về cấu trúc và đa dạng di truyền. Phân tử ADN ty thể không trải qua bất kỳ một
trạng thái tái tổ hợp nào. Hơn nữa, hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ

ở hầu hết các loài và vì vậy mỗi một dòng gen ty thể có sự di truyền độc lập. Do
18

đó, hệ gen ty thể rất phù hợp trong việc nghiên cứu về quan hệ nguồn gốc tiến hoá
(Giles và cộng sự, 1980).
Sự đa dạng di truyền ADN ty thể có thể được xác định bằng các phương pháp
như: cắt bởi các enzym giới hạn (RFLP), SSCP (single strand conformation
polymorphisms) và giải trình tự, trong đó phương pháp giải trình tự được sử dụng
phổ biến nhất hiện nay. Các cặp mồi được thiết kế để nhân PCR vùng điều khiển
(D-loop), locút cytochrome b và locút 12S rARN có thể áp dụng cho nhiều loài
khác nhau.
Trước tiên đoạn ADN cần xác định trình tự được nhân lên bằng phương pháp
PCR. Sau đó sản phẩm PCR được tinh sạch để loại bỏ các dNTP và mồi thừa, tiếp
theo hai mạch phân tử ADN được tách rời nhau. Mỗi mạch được bắt cặp với một
mồi và phản ứng PCR được thực hiện nhờ các enzym và dideoxynucleotide đã
được đánh dấu bằng một fluochrom (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1997). Sau đó trình
tự các đoạn ADN này được xác định trên các máy giải trình tự tự động. Hiện nay,
các hãng sản xuất máy giải trình tự đã phát triển những bộ kít giải trình tự riêng cho
từng loại máy khác nhau do đó thủ tục thực hiện phản ứng giải trình tự rất đơn giản
và thuận tiện. Có hai loại máy giải trình tự hiện nay được phổ biến rộng rãi là của
hãng ABI Prism và Backman Coulter-Mỹ đều dựa trên nguyên lý điện di mao quản.
Sử dụng ADN hệ gen ty thể để nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phát sinh
và đa dạng di truyền quần thể đã được thực hiện trên nhiều loài vật nuôi khác nhau
như ngựa, trâu, bò, lợn, dê (Cozzi và cộng sự, 2004; Van Hoof và cộng sự, 2003;
Bradley và cộng sự, 1996; Liu và cộng sự, 2006).



19

1.5. NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở BÒ
1.5.1. Sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình protein
Trong những năm trước kia, nghiên cứu về đa dạng di truyền ở các quần thể
bò nuôi được thực hiện chủ yếu ở mức độ sinh hoá. Những nghiên cứu này được
thực hiện bởi sự hợp tác của các nhà khoa học từ nhiều chuyên ngành khác nhau
như động vật học, di truyền học, thú y và các nhà tạo giống. Các nghiên cứu về đa
dạng di truyền ở quần thể bò nuôi được thực hiện ở phạm vi rộng từ các quần thể ở
nhiều vùng địa lý khác nhau trên trái đất (Manwell và Baker,1980; Graml và cộng
sự, 1986) cho đến các quần thể có quan hệ gần nhau và cùng phân bố ở một khu
vực địa lý (Kidd và Pirchner, 1971; Kidd và cộng sự, 1980).
Ở bò có mười nhóm máu đã được nhận dạng (A, B, C, FV, J, M, S, Z, R và T)
và chúng đã được sử dụng như các chỉ thị di truyền để xác định sự giống và khác
nhau giữa các quần thể trong nhiều năm (Bell, 1983). Trong những năm 1970, rất
nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền sử dụng hệ thống các nhóm máu và allozyme
được thực hiện ở bò. Hầu hết các kết quả của những nghiên cứu này đều giải thích
rằng bò Bos taurus và Bos indicus có mối quan hệ với nhau về sự phân ly ở mức độ
protein. Manwell và Baker là những người đầu tiên đưa ra kết quả về sự phân ly
nguồn gốc của hai loại bò Bos taurus và Bos indicus.
1.5.2. Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN hệ gen ty thể
Nhiều báo cáo về nghiên cứu đa dạng di truyền ở bò dựa trên phân tử ADN
được đăng tải vào những năm 1990 (Bhat và cộng sự, 1990; Bradley và cộng sự,
1994; 1996; Loftus và cộng sự; 1994a; 1994b; Machugh và cộng sự, 1994; Suzuki
và cộng sự, 1993). Trong số đó, Loftus và cộng sự (1994b) đã chỉ ra rằng phân tích
trình tự ADN ty thể có thể đưa ra một sự ước lượng chính xác thời gian phân ly
giữa hai nhóm bò Bos taurus và Bos indicus và các tác giả đã chỉ ra rằng hai nhóm
bò nói trên được thuần hoá một cách độc lập. Những nghiên cứu gần đây với một
20

số lượng lớn các dữ liệu về trình tự ADN ty thể đưa ra giả thiết rằng bò Bos taurus
của Châu Âu và Bos taurus Châu Phi có thể được thuần hoá độc lập tại các địa

điểm riêng biệt (Bradley và cộng sự, 1996). Trong một kết quả nghiên cứu khác
của Bradley và cộng sự (1994) đã chứng minh rằng sự phân ly về kiểu hình giữa bò
Bos taurus và bò mang nhiễm sắc thể Y của Bos indicus được phản ánh tại mức độ
phân tử. Chính vì vậy, những nghiên cứu dựa trên phân tử ADN là những công cụ
chính xác trong việc xác định mức độ lai tạp di truyền giữa hai loài phụ này. Nhiều
nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức độ phân tử ở bò của Châu Âu, Châu Á và
Châu Phi cũng đã cho thấy một quá trình lai tạp di truyền đáng chú ý giữa bò Bos
taurus và Bos indicus diễn ra ở Châu Phi. Các bằng chứng phân tử đã đưa ra nhận
định rằng, lịch sử lai tạp giữa bò Bos taurus và Bos indicus được bắt đầu giữa bò
đực Bos indicus và bò cái Bos taurus. Không có một dấu tích nào về haplotype kiểu
di truyền ty thể của bò cái Bos indicus được tìm thấy trong quần thể bò ở Châu Phi.
Ngoài ra, một vài nghiên cứu khác được thực hiện trong những năm gần đây như:
Mannen và cộng sự (1998) khi phân tích đa hình vùng D-loop ADN ty thể của
giống bò đen Nhật Bản và so sánh với một số giống bò từ Châu Âu, Châu Phi và
Ấn Độ đã chỉ ra mối quan hệ nguồn gốc gần giữa giống bò đen Nhật Bản và giống
bò từ Châu Âu.
Yu và cộng sự (1999), Troy và cộng sự (2001) khi tiến hành nghiên cứu sự sai
khác di truyền trình tự D-loop ADN ty thể của các giống bò từ Châu Âu, Châu Phi
và Cận Đông đã nhận thấy rằng tồn tại 4 dòng di truyền khác nhau (T1-T4), trong
đó dòng T4 được tìm thấy ở các giống bò vùng Đông Bắc Á.
Cai Xin và cộng sự (2006) đã phân tích sự lai tạp giữa bò Bos indicus và Bos
taurus ở 18 giống bò bản địa ở Trung Quốc cũng dựa trên phân tích trình tự ADN
ty thể, kết quả cho thấy các giống bò phía Bắc Trung Quốc chủ yếu là bò Bos
taurus trong khi các giống ở phía Nam thì bò Bos indicus là chủ yếu. Kết quả của
21

Lei và cộng sự (2006) khi tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và sự đa dạng di truyền
của các giống bò Trung Quốc qua việc phân tích trình tự ADN vùng D-loop ty thể
của 231 mẫu bò từ 18 tỉnh khác nhau cũng cho thấy các giống bò của Trung Quốc
bao gồm cả Bos indicus và Bos tarus.

1.5.3. Sử dụng kỹ thuật microsatellite
Kỹ thuật microsatellite đã được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di
truyền trên nhiều quần thể bò từ khắp các châu lục và với số lượng locút
microsatellite sử dụng cũng rất khác nhau. Moazami-Goudazi và cộng sự (1997)
sử dụng 17 locút microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền và mối quan hệ di
truyền của 10 giống bò ở Pháp. Schmid và cộng sự (1999) sử dụng 30 locút
microsatellite để nghiên cưu đa dạng di truyền của một số giống bò của ở Thụy Sĩ.
MacHugh và cộng sự (1998) đã sử dụng 20 locút microsatellite để xác đinh cấu
trúc di truyền của 7 giống bò của châu Âu. Martin-Buriel và cộng sự (1999) sử
dụng 30 locút microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền của 6 giống bò bản
địa Tây Ban Nha. Loftus và cộng sự (1999) sử dụng 20 locút microsatellite để
nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tính đa dạng di truyền của một số giống bò
gồm cả Bos taurus và Bos indicus ở vùng Cận Đông, Châu Âu và Tây Phi. Canon
và cộng sự (2001) đã sử dụng 16 chỉ thị microsatellite để xác định cấu trúc di
truyền, mối quan hệ di truyền và tính đa dạng di truyền của 18 giống bò thịt bản địa
của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và Pháp nhằm cung cấp những thông tin về tính đa
dạng di truyền và đặc điểm di truyền phân tử phục vụ cho mục đích bảo tồn. Kim
và cộng sự (2002) sử dụng 13 locút microsatellite để nghiên cứu sự sai khác di
truyền và mối quan hệ di truyền của các giống bò ở Đông Bắc Á bao gồm Bắc
Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản, kết quả cho thấy tính đa dạng thể hiện cao
nhất là giống bò của Trung Quốc sau đó là Hàn Quốc và Nhật Bản. Mukesh và
cộng sự (2004) đã sử dụng 20 locút microsatellite để nghiên cứu tính đa dạng di