“Nghiên cứu, xác định nấm gây bệnh loét trên cây Thanh long”.

Lời cảm ơn
Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn bệnh cây khoa nông học và Trung
tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, dưới sự
giúp đỡ, chỉ bảo và dìu dắt tận tình của thầy và các cán bộ tại Trung tâm, cùng với
sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của
mình.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đức Huy
đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quan trọng,
quý báu trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu. Em xin chân thành cảm
ơn thầy giáo cô giáo trong bộ môn Bệnh cây khoa Nông học Học Viện Nông
Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Lê Quang Khải, cán bộ nghiên cứu của Viện
Bảo vệ thực vật đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu bệnh Thanh
long. Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộ
môn Bệnh cây cũng như các thầy cô trong khoa Nông học đã tận tình giảng dạy,
dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới
Bố, Mẹ, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, hết lòng giúp
đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, Ngày 25 tháng 07 năm 2014
Sinh viên
Lý Phương Ngà
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw.) thuộc họ Xương rồng có
nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia. Đây là cây ăn quả nhiệt
1
đới, thích hợp khí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt nhưng không chịu được úng, sau khi
trồng một năm cây bắt đầu cho quả. Cây Thanh long thích hợp với nhiều chân đất
như đất xám, đất phù sa, đất đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên có
hiệu quả kinh tế cao do giá bán cao và có giá trị xuất khẩu. Trên thế giới, Thanh

long đã và đang là cây ăn quả quan trọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiều
nước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc,
Tại Việt Nam, Thanh long được trồng nhiều ở các tỉnh như Bình Thuận,
Tiền Giang, Long An với diện tích khoảng 10.000 ha và đem lại hiệu quả kinh tế
rất cao. Việt Nam là nước duy nhất ở Đông Nam Á có trồng Thanh long tương đối
tập trung trên quy mô thương mại với diện tích ước lượng 4.000 hecta (1998), tập
trung tại Bình Thuận 2.716 hecta, phần còn lại là Long An, Tiền Giang, TP. HCM,
Khánh Hòa và rải rác ở một số tỉnh khác. Ở miền Bắc, cây Thanh long mới được
trồng ở một số vùng như Hòa Bình, Hà Tây, Phú Thọ và rải rác trong các hộ gia
đình với diện tích còn thấp (khoảng 20-30 ha). Hiện nay, nước ta đã xuất khẩu
Thanh long sang nhiều nước dưới dạng quả tươi và dạng đông lạnh.
Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 năm
nay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980. Thanh long gồm
có 3 loại: Ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ở
Việt Nam là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ.
Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanh
long sinh trưởng phát triển tốt. Tuy nhiên nhiệt độ cao, lượng mưa lớn cũng là điều
kiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển và gây hại. Trong quá trình sinh
trưởng, cây Thanh long bị gây hại bởi một số loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi
vàng và bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.) bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium
agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.) và gần đây là
bệnh loét do nấm gây ra.
Bệnh loét mới được phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013 (báo điện tử
Cà Mau), gây hại trên thân, quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch. Bệnh gây ảnh
2
hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả
ở các vùng sản xuất Thanh long tập trung như Bình Thuận, An Giang. Đặc biệt,
các vết loét tồn tại trên quả đã làm giảm giá trị thương phẩm. Bệnh loét gây hại rất
ít tại các vùng trồng Thanh long ở miền Bắc.
Các nghiên cứu về bệnh loét trên cây Thanh long ở Việt Nam hầu như rất ít.

Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu nào được đăng trên các tạp chí chuyên
ngành trong nước hoặc trên thế giới. Xuất phát từ thực trạng trên, việc tìm hiểu
nghiên cứu tình trạng dịch bệnh đặc biệt là bệnh loét trên cây Thanh long là vấn đề
rất quan trọng được các nhà chuyên môn, tổ chức trong nước và quốc tế quan tâm.
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu và công bố về nấm Neoscytalidium
dimidiatum (N. dimidiatum) gây bệnh loét trên Thanh long, nhưng tại Việt Nam có
rất ít công bố cũng như nghiên cứu chuyên sâu về bệnh dẫn đến chưa có giải pháp
quản lý bệnh hiệu quả, làm cho tình trạng bệnh ngày càng nặng, lây lan ngày càng
rộng gây thiệt hại lớn về năng suất, chất lượng, ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng
tới xuất khẩu. Vì vậy, xuất phát từ thực trạng trên và sự phân công của khoa Nông
học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn
Đức Huy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu, xác định nấm gây
bệnh loét trên cây Thanh long”.
3
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Xác định, nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân tử của nấm gây bệnh loét trên
cây Thanh long và thử hiệu lực ức chế nấm bằng một số loại thuốc hóa học và thảo
mộc trên môi trường nhân tạo PDA.
1.2.2. Yêu cầu
Thu thập mẫu loét trên thân, quả Thanh long (tại các chợ Hà Nội và vùng
phụ cận), Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc (Bình Thuận), Long An.
Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh.
Xác định nấm gây bệnh loét dựa trên kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng
ITS của nấm.
Xác định đặc điểm sinh học và phân tử của nấm gây bệnh loét trên cây
Thanh long.
Thử nghiệm hiệu lực ức chế nấm bằng nấm đối kháng, thuốc thảo mộc (có
nguồn gốc từ cây nghệ) và một số thuốc hóa học.
4

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vai trò của Thanh long
Thanh long là cây ăn quả nhiệt đới cho năng suất cao, có giá trị xuất khẩu
mang lại hiệu quả kinh tế cao. Tại Việt Nam, Thanh long đã góp phần thay đổi
cuộc sống của nhiều nông dân ở các tỉnh như Bình Thuận, Long An, Tiền
Giang,
Thanh long là cây ăn quả ngon, là thực phẩm quan trọng đối với con người.
Thanh long có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, trung bình một quả Thanh long
chứa khoảng 60 đơn vị calo, 60mg natri, 8g đường và 1g chất xơ. Không giống
như các loại trái cây khác, ngoài các chất dinh dưỡng kể trên, Thanh long còn chứa
2g chất béo không bão hòa và 2g protein. Hầu hết hàm lượng chất béo và protein
được tìm thấy trong các hạt màu đen, nhỏ li ti của quả Thanh long. Thanh long
chứa một hàm lượng đáng kể vitamin C, carotin, canxi, một số loại vitamin B, một
số chất dinh dưỡng và chất chống oxy hóa khác. Những dưỡng chất này giúp hệ
thống tiêu hóa trong cơ thể hoạt động tốt hơn, tăng cường hệ miễn dịch, năng
lượng dồi dào. Ngoài ra, ăn Thanh long còn rất tốt cho da và thị lực thậm chí có thể
giúp nhanh khỏi và giảm mức độ nghiêm trọng của cảm lạnh thông thường. Đối
với những người đang cố gắng để tăng lượng chất xơ trong khẩu phần ăn hàng
ngày, Thanh long có thể là một lựa chọn thay thế tuyệt vời. Các chất xơ hòa tan có
trong Thanh long có thể giúp mọi người giảm cân, giảm lượng đường trong máu,
nuôi dưỡng ruột và ngăn ngừa ung thư ruột kết. Thanh long cung cấp đầy đủ chất
xơ, giúp giảm cholesterol, kiểm soát trọng lượng và loại bỏ các độc tố một cách
hiệu quả cho con người. Thanh long được chứa đầy đủ các chất chống oxy hóa,
giúp bảo vệ các tế bào của cơ thể trước sự tấn công của các gốc tự do, đẩy lùi tốc
độ lão hóa và thậm chí là ngăn chặn bệnh ung thư. Hàm lượng anthocyanin có
trong Thanh long là rất cao. Anthocyanin là một loại chất chống oxy hóa. Nó có
thể giúp mọi người ngăn chặn xơ cứng mạch máu, bệnh tim và nguy cơ xuất huyết
não. Đồng thời, anthocyanin có thể chống lại các gốc tự do để trì hoãn sự lão hóa
5
của cơ thể con người và ngăn chặn sự hình thành của bệnh mất trí nhớ do tuổi già.

Hàm lượng sắt có trong Thanh long cũng là cao, sắt là nguyên liệu cần thiết để sản
xuất hemoglobin trong cơ thể con người vì vậy chúng ta có thể bổ sung sắt để ngăn
chặn bệnh thiếu máu bằng cách ăn Thanh long. Ngoài ra protein chay chứa trong
quả Thanh long có thể được tích hợp tích cực với các kim loại nặng trong cơ thể
con người để loại bỏ các độc tố và bảo vệ thành dạ dày.
2.2. Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum
2.2.1. Nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới Thanh long là cây ăn quả lâu năm được trồng nhiều ở Mỹ,
Nhật, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc, Đài Loan.
Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế
giới. Vì vậy, việc nâng cao năng xuất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm,
đã có rất nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long. Thanh long bị
gây hại bởi một số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.) bệnh đốm nâu
trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành
(Sphaceloma sp.) tuy nhiên những năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi
nấm N. dimidiatum đây là một bệnh có ảnh hưởng lớn nhất đến năng xuất chất
lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho người trồng Thanh long. Trước vấn đề cấp
thiết trên nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và tìm hiểu về nấm N.
dimidiatum.
Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình
thái tản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây
bệnh loét trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (Penz.) B. Sutton &
Dyko (1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Penz.)
Crous & Slippers (2006).
Đặc điểm vị trí phân loại của nấm N. dimidiatum (Agrios. 2005), (Crous &
Slippers. 2006).
Ngành Ascomyta
Lớp Dothideomycetes
Bộ Botryosphaeriales
6

Họ Botryosphaeriaceae
Chi Neoscytalidium
Loài: Neoscytalidium dimidiatum
N. dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh
dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có
một nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo
thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế
bào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất,
trong nước, trên cạn, thực vật động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật,
động vật, người gây nên những thiệt hại lớn. Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng
sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản
vô tính bằng bào tử đính (conidia), và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử
khác tính (+, -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp
cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân
chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào
tử túi. Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai
đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế.
Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ và
quả thể hở.
Chi Neoscytalidium được mô tả đầu tiên của Crous & Slippers vào năm 2006.
N. dimidiatum có cơ thể dạng sợi, đơn bào, phân nhánh có vách ngăn sinh
sản bằng hình thức sinh dưỡng đứt đoạn sợi nấm tạo cơ thể đơn bào hình tròn, bầu
dục, chứa một hay nhiều nhân.
Theo báo cáo đầu tiên về nấm N. dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G.
Polizzi & cs., 2008). Vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện
và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi (cam ngọt (Citrus sinensis (L.)
Osbeck cv.Tarocco Scirè ) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điển
hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm.
Trong một thời gian ngắn xuất hiện khối bào tử của nấm màu đen dưới lớp vỏ cây
7

và trên bề mặt vết thối. Sau khi phân lập trên môi trường PDA, xác định nấm có
đặc điểm giống nấm Scytalidium với các đặc điểm như sợi nấm màu nâu phân
nhánh có vách ngăn, bào tử hình trứng, elip, đỉnh tròn có 0 – 2 vách ngăn, màu
nâu. Sau khi phân lập tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR, DNA được chiết
suất từ sợi nấm sau đó sử dụng các mồi V9G và ITS4 để khuếch đại operon rRNA
hạt nhân kéo dài đầu 3' của gen 18S rRNA, các miếng đệm bên trong sao chép, gen
rRNA 5.8S, và một phần của kết thúc 5' của gen 28S rRNA. Sau khi phân tích trình
tự DNA trên cơ sở đặc điểm hình thái và các dữ liệu phân tử, bệnh đã được xác
định là do nấm N. dimidiatum gây ra. Bệnh đã được kiểm tra lại bằng phương pháp
lây nhân tạo trên cây cam ngọt 2 tuổi.
Theo báo cáo đầu tiên của về nấm N. dimidiatum và N. novaehollandiae trên
cây xoài tại Australia (J. D. Ray, T. Burgess anh V. M. Lanoiselet. 2010). N.
dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt
dẻ, sung, vả, cây có múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al.
1989). N. dimidiatum còn gây hại trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh
long (Brown 2012). N. dimidiatum gây nên các triệu chứng như héo cành, chết
mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết. Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự
phát triển của nấm N. dimidiatum là độ ẩm (Punithalingam and Waterson 1970;
Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar 2001).
N. dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh
chết mầm của xoài (2010). Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe cây
trồng do Bộ nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viên
Australia thực hiện. Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nhà nghiên cứu
đã tiến hành phân lập các triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ của cây sung,
sau khi tiến hành phân lập đã phát hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối
rễ, thối cây là do nấm Neoscytalidium spp. gây ra. Neoscytalidium spp. tiếp tục
được phân lập và tiến hành giải trình tự một phần DNA của vùng ITS kết quả xác
định là do Neoscytalidium dimidiatum (Fusicoccum dimidiatum, Torula dimidiata,
8
Scytalidium dimidiatum, Hendersonula toruloidea) gây ra. Trong cuộc khảo sát, N.

dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài lấy tại Derby, trong tháng 9 năm
2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst, Northern Territory vào
tháng 10 năm 2008. Sau khi phân lập các nhà khảo sát đã tiến hành lây bệnh nhân
tạo và tái phân lập theo quy tắc Koch đã thu được kết quả tốt. Tiến hành kiểm tra
lại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước (2005) các nhà khảo sát đã phát
hiện rằng N. dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại Australia trong thời gian dài
trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiata 1914)). Theo báo cáo này, yếu
tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh.
Trước đây N. dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum
dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula
toruloidea, (Crous et al. 2006).
Theo nghiên cứu của Mohd và ctv. 2013 viện nghiên cứu sở nông nghiệp,
Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh loét
đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan. Triệu chứng của bệnh là các
vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam. Bệnh được xác định do nấm N. dimidiatum
gây ra.
Năm 2008, 2009 nấm N. dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long
trồng ở Malaysia. N. dimidiatum đã gây triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau
đó mục nát. Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở
25
0
C trong 7 ngày. Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA, nấm có quả cành
màu đen, đường kính 90.0mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong
pha lê có 2 vách ngăn. DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA
thực hiện phản ứng khuếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5. Cuối cùng thực hiện lây
bệnh nhân tạo để so sánh và đánh giá bệnh.
Đến tháng 7 năm 2011 bệnh loét trên Thanh long đã được phát hiện ở Trung
Quốc với các đặc điểm là có nhiều vết nhỏ đốm nâu đỏ nhỏ hơn các vết bệnh ban
đầu, các vết này lan rộng và hình thành các vùng rộng lớn gây chết hoại. Nấm
9

được nuôi cấy trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) và ủ ở 28
o
C trong 3
ngày. Sau khi phân lập tiến hành phản ứng PCR (phản ứng khuếch đại gen), DNA
được chiết từ sợi nấm đã được nuối cấy trong 7 ngày sử dụng Kit DNAsecure thực
vật, miếng đệm ghi chép nội bộ (ITS) khu vực của rDNAs từ phân lập được
khuếch đại bởi mồi ITS1 và ITS4.
Đến năm 2012, Brown đã công bố báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium
dimidiatum gây hại trên Thanh long tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc.
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gấy bện loét trên cây Thanh
long, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam
(2011) rằng bệnh loét (đốm trắng hay đốm nâu ) do nấm Neoscytalidium
dimidiatum gây ra. Nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum hay
Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn
công mạnh vào mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là từ 20 – 30
o
C.
Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh.
Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh. Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở
những vườn có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che
mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn
sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung vi lượng đều
có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn. Vết bệnh
ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng
cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi
lên và gây ảnh hưởng nặng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị thương
phẩm của quả. Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn
chuẩn bị thu hoạch.
Bệnh loét (đốm trắng hay bệnh đốm nâu) Thanh long, trong dân gian bà con

nông dân còn gọi là bệnh đốm tắc kè, bệnh ma do đặc điểm hình dạng, màu sắc
và giai đoạn phát triển của vết bệnh. Bệnh loét được coi là “bệnh lạ chưa có tên
10
trong y văn”, thứ “bệnh phong chưa có thuốc trị”. Tại Việt Nam, bệnh đốm trắng
xuất hiện rải rác vào năm 2008 ở Bình Thuận với diện tích và tỉ lệ nhiễm rất ít.
Hiện nay vẫn có rất ít nghiên cứu về bệnh loét trên cây Thanh long.
Năm 2009, khi những ổ dịch đầu tiên được phát hiện ở Bình Thuận thì một
số nhà chuyên môn nhận định trên báo chí rằng: “Đây là bệnh do sinh lý, do thâm
canh kém và thắp đèn quá mức” (Báo điện tử nông nghiệp).
Tại Việt Nam mặc dù cũng có vài báo cáo công bố sơ lược về tác nhân gây
bệnh loét trên Thanh long nhưng vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề nghiên cứu cần làm
sáng tỏ thêm ( Nguyễn Thành Hiếu và ctv., 2011).
Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh, với diện tích gần 1.000 ha,
tỷ lệ nhiễm nặng từ 10% trở lên chiếm trên 80% và bệnh đã có mặt ở khắp các
vùng trồng Thanh long tập trung của Việt Nam như Bình Thuận, Tiền Giang và
Long An, đến tháng 6/2013 diện tích nhiễm bệnh đốm trắng đã lên đến gần 3.000
ha, tỷ lệ gây hại từ 20 – 50%.
Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích Thanh long bị nhiễm bệnh đốm
trắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha.
Tiền Giang, với gần 3.000 ha Thanh long thì có đến 2.420 ha nhiễm bệnh đốm
trắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80 ha. Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha,
nặng 41 ha, trong tổng số gần 2.700 ha và đang có xu hướng lây lan nhanh.
Theo báo điện tử nông nghiệp Việt Nam 28/11/2013 Thạc sĩ Nguyễn Mỹ Phi
Long, người phụ trách kỹ thuật của công ty Điền Trang cho biết đã phân lập và
nhân nuôi thành công bào tử của nấm gây nên bệnh loét. Mặc dù chưa khẳng định
100% nhưng có thể chắc chắn đến 90% rằng đấy là nấm N. dimiditatum. Nấm bệnh
này không mới nhưng là mới khi nó gây hại nặng trên cây Thanh long. Các báo cáo
khoa học về bệnh hại trên cây Thanh long của cả trong và ngoài nước đến hiện nay
vẫn chưa ghi tên nấm N. dimiditatum. N. dimiditatum chẳng những có mặt trên
thân, cành, lá, hoa, quả thực vật mà tồn tại cả trong đất. Trong quá trình nuôi cây

bào tử nấm bệnh, nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra một loài vi khuẩn đối kháng
Bacillus subtilis có khả năng kiềm chế quá trình phát triển của nấm này. Công ty
11
Điền Trang đã nhanh chóng đưa ra ứng dụng tại Long Trì, An Lục Long và Dương
Xuân Hội - Châu Thành - Long An đã thu được nhiều kết quả rất khả quan.
Qua thực tế thành công của nhiều nhà vườn tại Long An, Tiền Giang, Công
ty Điền Trang cùng nhà vườn trồng Thanh long đã đúc kết và đưa ra được biện
pháp khắc phục và phòng ngừa bệnh đốm trắng (đốm nâu) theo phương châm quản
lý dịch hại tổng hợp gồm 03 bước. Biện pháp này bước đầu đã mang lại hiệu quả
tích cực và khả quan đáng ghi nhận:
Bước 1:
Vệ sinh vườn, tạo thông thoáng cho vườn: Cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thu
gom tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vôi để xử lý. Không vứt cành bệnh, trái
bệnh xuống mương, rạch hoặc trong vườn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lan
nhanh.
Quản lý chặt nguồn nước: đánh rãnh thoát nước, không để ứ đọng nước trên
vườn.
Bước 2:
Bón vôi xung quanh gốc cây, 1 - 2 kg/trụ để nâng độ pH lên (nên nâng tối
thiểu phải đạt 4,5); không nên rải lên cây.
Đồng thời, phun các loại thuốc trừ nấm phổ rộng (nên sử dụng kết hợp 2 loại
thuốc có hoạt chất Hexaconazole, Carbendazim theo tỉ lệ 1:1), phun kỹ và đều
khắp tán cây, chú ý phun đẫm ngay đỉnh trụ. Phun định kỳ 5 - 7 ngày/1lần, phun
lặp lại 2 - 3 lần.
Bước 3: Sau khi thực hiện xong bước 2 được 7 ngày.
Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT chuyên dùng cho Thanh
long (nhãn hiệu 02 trái Thanh long) trên khắp tán cây, gốc cây và đỉnh trụ (liều
dùng 01 gói 500 gr/100 lít nước), phun liên tục 5 - 7 ngày/1lần. Chú ý phun lặp lại
sau khi mưa. Khi cây đã hết bệnh phun và tưới gốc định kỳ 10 - 15 ngày/lần.
Trong trường hợp lấy trái thì phải phun men TRICHOMIX- DT trực tiếp vào

nụ và trái 4 lần, lần 1 ở giai đoạn nụ 10 - 15 ngày tuổi, lần 2 khi rứt râu (bẻ hoa) và
lần 3, lần 4 trong giai đoạn nuôi trái, cách nhau 7 - 10 ngày/1lần.
Bón phân chuồng đã ủ hoai bằng nấm Trichoderma (3 - 5 kg/trụ) hoặc phân
hữu cơ TRICHOMIX-DT, TRIMIX-N1 (50 kg/bao, liều bón: 1 - 2 kg/gốc), bón
12
xung quanh gốc và nên tủ cỏ mục, rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bón 2 - 3 lần
liên tục cách nhau 20 - 30 ngày/lần.
Đến 25/2/2014 báo điện tử nông nghiệp Việt Nam cho biết ngày 23/2/2014
thứ trưởng Bộ NN-PTNT Lê Quốc Doanh đã có buổi làm việc với Viện Nghiên
cứu cây ăn quả miền Nam về kết quả nghiên cứu và biện pháp phòng trừ bệnh loét
(đốm trắng) trên cây Thanh long.
Ông Nguyễn Thành Hiếu, đại diện nhóm nghiên cứu bệnh loét (đốm trắng)
trên cây Thanh long (Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam) cho biết: Bệnh đốm trắng
trên cây Thanh long còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè… gây thiệt hại nghiêm trọng
và có xu hướng ngày càng lan rộng. Bệnh do nấm N. dimidiatum gây ra. Bắt đầu
xuất hiện rải rác vào năm 2008 tại Bình Thuận, Tiền Giang, từ 2011 trở lại đây thì
bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn. Mức độ bệnh xuất hiện ở các vườn dao
động từ 20 - 25%, có vườn mất trắng làm tổn thất về kinh tế khá lớn.
Bệnh gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch.
Lúc đầu triệu chứng trên bẹ/trái là những chấm nhỏ li ti như kim, phát triển thành
đốm tròn nhỏ màu trắng, vết bệnh trũng thấp so với bẹ, về sau vết bệnh có màu
vàng cam và phát triển nhô lên những vết ghẻ màu nâu và đôi khi gây thối nhũn
nếu bị bệnh tấn công nặng.
Trước thực trạng dịch bệnh ngày càng gây hại nghiêm trọng, Viện Nghiên
cứu CĂQ miền Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiều phương
pháp khoa học, chuyển giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trình quản lý tổng
hợp sâu bệnh hại quan trọng trên Thanh long” cho 480 nông dân ở Bình Thuận và
79 nông dân ở Tiền Giang.
Ngoài ra, Viện còn cử nhiều cán bộ đi kiểm tra, theo dõi định kỳ tại một số
xã trồng Thanh long ở huyện Chợ Gạo, Tiền Giang. Đồng thời đưa ra quy trình

“Quản lý bệnh đốm trắng trên Thanh long tạm thời” để giúp nhà vườn nắm bắt và
ứng dụng vào sản xuất.
Tại buổi làm việc, lãnh đạo Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam đã đề xuất với
Bộ NN-PTNT cho Viện tiếp tục nghiên cứu điều kiện phát sinh, phát triển của dịch
13
bệnh đốm trắng, nghiên cứu biện pháp vệ sinh vườn, xây dựng và chuyển giao mô
hình sản xuất phân hữu cơ vi sinh, sử dụng thuốc BVTV…
Đề nghị Bộ sớm ban hành quy trình quản lý bệnh đốm trắng tạm thời. Phân
công nhiệm vụ triển khai công tác phòng chống bệnh cho các đơn vị. Ban hành
một số loại thuốc BVTV trước mắt để phòng trừ kịp thời. Tổ chức tập huấn trên
diện rộng và xây dựng mô hình quản lý bệnh theo từng vùng
Thứ trưởng Lê Quốc Doanh chỉ đạo: Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam cần
điều chỉnh bổ sung thêm vấn đề nghiên cứu canh tác tổng hợp vào đề tài nghiên
cứu giống Thanh long đang thực hiện. Bệnh đốm trắng Thanh long là vấn đề
"nóng" cần phải làm ngay, không nhất thiết chờ kết quả nghiên cứu cuối cùng.
Cục BVTV tập hợp kết quả nghiên cứu quy trình quản lý bệnh đốm trắng trên
Thanh long tạm thời của Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam, Viện BVTV và Trung
tâm BVTV phía Nam để nhanh sớm đưa ra quy trình quản lý tạm thời trước
15/3/2014. Trung tâm Khuyến nông Quốc gia bố trí kinh phí để tập huấn, chuyển
giao quy trình quản lý dịch bệnh tạm thời tại Bình Thuận, Long An và Tiền Giang
14
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh loét trên cây Thanh long
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• Mẫu bệnh và các giống Thanh long dùng trong nghiên cứu
- Các mẫu bệnh loét trên cây Thanh long được thu thập trên cả hai giống
Thanh long ruột trắng và ruột đỏ tại một số vùng trồng Thanh long chính

ở Bình Thuận, Long An và Tiền Giang năm 2013 và 2014.
- Các giống Thanh long được dùng trong lây nhiễm bệnh nhân tạo là các
cây Thanh long khỏe của cả giống ruột trắng và ruột đỏ (Thu thập từ
Bình Thuận).
• Dụng cụ, hóa chất
- Dụng cụ trong phòng thí nghiệm gồm: tủ sấy, nồi hấp, lò vi sóng, tủ lạnh,
tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa petri, ống nghiệm,
đĩa petri, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun,…
- Dụng cụ để thu thập mẫu gồm: dao, kéo, dây chun, túi đựng mẫu,…
- Hóa chất và vật liệu để điều chế môi trường nuôi phân lập và cấy nấm
(WA, PDA): Agar, khoai tây, đường glucose, cồn, nước cất, và các hóa
cần thiết khác.
- Các vật liệu hóa chất cần thiết cho chiết DNA và thực hiện phản ứng
PCR như đệm CTAB, cặp mồi chung ITS4 và ITS5,
- Nguồn nấm đối kháng T. viride: do Bộ môn Bệnh cây, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam cung cấp.
- Thuốc thảo mộc: do Viện nghiên cứu hóa học cung cấp
- Thuốc bảo vệ thực vật: Dựa vào danh mục thuốc có bán tại các đại lý
thuốc bảo vệ thực vật cũng như hiệu lực phòng trừ nấm gây bệnh loét
trên cây Thanh long, chúng tôi sử dụng một số thuốc sau: Alvil 5SC,
Vicarben S 70 BTN, Dipcy 750WP.
15
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm điều tra, thu thập mẫu bệnh: Các vùng trồng Thanh long chính
tại Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc của tỉnh Bình Thuận, Long An và
một số chợ bán Thanh long cũng như vườn Thanh long của một số hộ gia
đình thuộc một số tỉnh miền Bắc.
- Các nghiên cứu trong phòng: Được tiến hành tại phòng thí nghiệm của bộ
môn Bệnh cây và Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Khoa Nông
học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

- Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo: Được tiến hành tại nhà lưới No.3 của bộ
môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
- Đề tài được thực hiện từ tháng 1 đến tháng hết 6/2014.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Thu thập mẫu bệnh
- Tiến hành thu thập mẫu bệnh loét trên cây Thanh long từ cuối năm
2013 và đầu năm 2014.
3.2.2. Trong phòng thí nghiệm
- Phân lập và nuôi cấy trên môi trường PDA.
- Quan sát đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh loét.
- Tìm hiểu đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh
- Xác định nấm gây bệnh bằng PCR và giải trình tự vùng ITS của nấm gây
bệnh loét.
- Khảo sát hiệu lực ức chế nấm gây bệnh bằng nấm đối kháng, một số thuốc
hóa học và thuốc thảo mộc trên môi trường PDA.
3.2.3. Nhà lưới
Lây bệnh nhân tạo lên các cây Thanh long khỏe gồm 2 giống ruột trắng và
ruột đỏ và tính tỷ lệ bệnh sau khi lây nhiễm nhân tạo.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh
16
Thu thập ngẫu nhiên mẫu quả có triệu chứng từ các chợ bán Thanh long tại
Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc.
Thu thập mẫu thân, quả Thanh long có triệu chứng tại các vườn Thanh long
tại Bình Thuận, Long An.
Thu thập các mẫu bệnh còn mới, có triệu chứng điển hình.
3.3.2. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, đũa thủy tinh được khử trùng ở
180

o
C trong 2 giờ.
Que cấy nấm, dao cắt, buồng cấy được khử trùng bằng tia cực tím, cồn và
đèn cồn.
3.3.3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường nhân
tạo PDA, WA
• Môi trường WA (Water agar)
Thành phần: Nước cất :1000ml
Agar :20 g
17
Cách điều chế:
Đun sôi nước cất sau đó cho Agar vào quấy đều cho tan hết rồi đổ vào trong
bình tam giác sạch, bịt kín miệng bằng giấy bạc. Sau đó đem hấp khử trùng ở
121
o
C (1.5atm) trong thời gian 20 - 25 phút, để nguội 55 - 60
o
C khi rót vào đĩa
peptri đã được khử trùng.
Môi trường WA là môi trường nghèo dinh dưỡng do vậy được sử dụng để
phân lập nấm thuần.
• Môi trường PDA - Potato Glucose Agar
Thành phần : Khoai tây: 200 gam
Glucose : 20 gam
Agar : 20 gam
Nước : 1000ml
Cách điều chế:
Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt sạch vỏ, thái nhỏ kích thước 1 x
2 x 1 cm cho vào nồi chứa 1000ml nước cất đun sôi, sau khi đun sôi được 30 phút

thì lọc lấy phần nước, bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml. Cho từ từ 20g đường
glucose và 20g agar vào dung dịch nước trên. Môi trường được cho vào bình tam
giác có đậy nút giấy bạc (bình tam giác đĩa petri đã được rửa sạch và sấy khô ở
nhiệt độ 160
o
C trong 2 giờ) sau đó hấp khử trùng ở 121
o
C, 1.5 atm trong thời gian
20 - 25 phút, để nguội 55 - 60
o
C trước khi rót vào đĩa peptri đã được khử trùng.
3.3.4. Phương pháp phân lập, nuôi cấy nấm
Mẫu bệnh thu thập từ các vườn Thanh long là những mẫu bệnh điển hình,
còn tươi. Đem về phòng thí nghiệm phân lập ngay hoặc bảo quản trong điều kiện
khô mát hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4
o
C nhằm tránh các loại nấm hoại sinh và vi
khuẩn phát triển. Khử trùng bề mặt mẫu bệnh bằng cồn 70% (C
2
H
5
OH) rồi cấy
trên môi trường WA. Hoặc khử trùng bề mặt mẫu bệnh trong dung dịch NaOCl 1%
trong 3 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng (trong 1 phút) rồi cấy mẫu
bệnh trên môi trường WA quan sát hằng ngày. Khi sợi nấm mọc thì cấy truyền
sang môi trường PDA. Kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định nấm gây bệnh. Toàn
18
bộ quá trình phân lập được thực hiện trong điều kiện vô trùng và cách ly trong
buồng cấy.
3.3.5. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm

Cấy các mẫu nấm trên đĩa môi trường PDA và ủ ở 25
o
C trong 7 ngày. Quan
sát các đặc điểm của nấm như tản nấm, sợi nấm và bào tử của nấm sau các ngày
nuôi cấy.
3.3.6. Xác định nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng ITS
Chọn các mẫu nấm nấm đại diện theo vùng và theo giống cây trồng (tổng
cộng 6 mẫu) được nuôi cấy trên môi trường PDA từ 3 - 5 ngày ở nhiệt độ phòng 27
- 30
o
C. DNA của nấm được chiết theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl
ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987).
Thành phần đệm chiết CTAB (100ml) gồm:
NaCl 2M : 11.68g
EDTA 25mM : 5ml
Tris HCl 100mM pH8 : 10ml
CTAB 2% : 2g
PVP 2% : 2g
Phương pháp chiết DNA bằng phương pháp CTAB (Doyle & Doyle 1987)
gồm các bước sau:
Bước 1 : Lấy sợi nấm cho vào ống Eppendorf 1.5 ml. Sau đó, nghiền bằng chày
nhựa trong đệm CTAB (thể tích khoảng 700µl). Ủ đệm CTAB + βME (100μl PME
+ 10ml CTAB) ở 65
o
C trong 10 phút.
Bước 2 : Cho mẫu bệnh cần chuẩn đoán vào ống 1.5 ml theo tỷ lệ 0.1g/1ml đệm
CTAB + βME.
Bước 3 : Cho vào ống 500μl CTAB + βME. Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ.
Bước 4 : Ủ ống trong điều kiện 60 - 65
o

C, trong khoảng 5 phút.
Bước 5 : Ly tâm trong 10 phút.
Bước 6 : Hút dịch trên tủa V = 700μl, cho sang ống mới.
Bước 7 : Bổ sung một thể tích tương đương Chloroform : isoamyl (24 :1) lắc đều
cho thành 1 dung dịch đồng nhất vào ống mới hút dịch.
Bước 8 : Ly tâm trong 10 phút.
Bước 9 : Lấy dịch trên tủa thể tích khoảng 500 - 600μl. Bổ sung tiếp một thể tích
tương đương Chloroform : isoamyl (24 :1). Lắc đều, sau đó ly tâm 10 phút.
19
Bước 10 : Lấy dịch trên tủa V = 400 - 500μl cho sang ống mới. Bổ sung tiếp một
thể tích tương đương Chloroform : isoamyl (24 :1).
Bước 11 : Lắc đều, để lạnh - 20
o
C trong 30 phút (tối thiểu).
Bước 12 : Lấy ra ly tâm trong 15 phút , bỏ dịch thu cặn.
Bước 13 : Rửa với cồn 75
o
(2 lần).
Bước 14 : Để khô trong không khí (box cấy).
Bước 15 : Bổ sung 30 - 50μl TE, búng để DNA tan hết, giữ tube ở điều kiện nhiệt
độ - 20
o
C.
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi
ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)
ITS5 (5′GAAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′) cho vùng ITS của rDNA (White
và cs, 1999). Điều kiện phản ứng PCR: Các phản ứng PCR được thực hiện trong
ống 0.5 ml với tổng thể tích phản ứng 15μl, thành phần của mỗi phản ứng PCR:
H
2

O :8.5μl
Go Taq 2x :10μl
ITS4 :0,5μl
ITS5 :0,5μl
DNA :0,5μl
Tổng thể tích: :20μl
Quy trình thực hiện phản ứng PCR:
94
o
C 4 phút x 1
94
o
C
54
o
C
72
o
C
1 phút
1 phút
1 phút 30 giây
x 35
72
o
C 5 phút x 1
Chạy điện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng
Chuẩn bị:
Pha đệm điện di TAE 0.5x từ dung dịch gốc TAE 50x: Lấy 100ml TAE 50X
cho vào cốc đong bổ sung thêm 1000ml nước cất, lắc đều.

20
Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100ml TAE
0.5x, sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose, sau khi agarose đã tan hoàn toàn đun
trong lò vi sóng 2 - 3 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100ml dung
dịch gel cho 5μl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng.
Lấy các ống 0.5ml đã hấp khử trùng, đánh số thứ tự. Cho vào mỗi tube 4μl
Loading Dye X6, đảo đều và Spin trong 5s. Nếu sử dụng cách 2 không cần cho
Loading Dye.
Tiến hành:
Sau 30 phút để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính
giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng).
Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 0.5x phủ ngập gel.
Nhỏ mẫu vào giếng: Dùng pipet hút 5μl với giếng nhỏ, 10 - 12μl với gel to
dung dịch mẫu cần chuẩn đoán cho vào mỗi giếng theo thứ tự. Ngoài các mẫu chạy
PCR còn nhỏ thêm 1 giếng Marker làm chuẩn.
Cắm nguồn điện di, đặt ở hiệu điện thế 100V trong 15 - 20 phút, tắt máy
điện di đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quán sát các vệt DNA
hiện lên và chụp ảnh.
Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng
Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 50
o
C.
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose 1% dùng kít tinh chiết thương
mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ
bằng điện di agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp. Sử dụng cặp mồi
PCR đặc hiệu và gửi đọc tại hãng Macrogen (Hàn Quốc).
3.3.7. So sánh trình tự vùng ITS của các mẫu nấm
Dựa cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại
NCBI (the National Centerfor Biotechnology Information)
( />3.3.8. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm

• Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau đến sự phát triển của nấm
Neoscytalidium dimidiatum.
21
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri
(đường kính lỗ đục 6mm) trên các nhiệt độ 5
o
C, 10
o
C, 15
o
C, 20
o
C, 25
o
C, 30
o
C,
35
o
C và 40
o
C.
Khảo sát tiến hành ở 8 ngưỡng nhiệt độ khác nhau, mỗi ngưỡng nhiệt độ nhắc
lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. Thời gian theo dõi: 7 ngày
Chỉ tiêu theo dõi:
Hình thái, màu sắc tản nấm.
Đo đường kính tản nấm (mm). Đường kính trung bình (d) được tính theo
công thức: d = (d1 + d2)/2. Trong đó, d1 và d2 là kích thước hai đường chéo của
tản nấm.
• Ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến sự phát triển của nấm

Neoscytalidium dimidiatum.
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri
(đường kính lỗ đục 6mm) trên các pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Khảo sát tiến hành ở 6 ngưỡng pH khác nhau, mỗi ngưỡng pH nhắc lại 3 lần,
mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. Thời gian theo dõi: 7 ngày
Chỉ tiêu theo dõi:
Hình thái, màu sắc tản nấm.
Đo đường kính tản nấm (mm). Đường kính trung bình (d) được tính theo
công thức: d = (d1 + d2)/2. Trong đó, d1 và d2 là kích thước hai đường chéo của
tản nấm.
3.3.9. Lây bệnh nhân tạo
Thí nghiệm thực hiện trên các cây Thanh long được trồng từ 1 - 2 tháng
trong nhà lưới.
Giống Thanh long: 2 giống (vỏ đỏ ruột trắng, vỏ đỏ ruột đỏ). Mỗi giống lây
10 - 20 cây.
Sử dụng hai phương pháp lây sát thương châm kim (Hildebrand, 1953), lây
không sát thương bằng cách phun bào tử và trực tiếp từ sợi nấm cấy trên môi
trường.
Thí nghiệm gồm 5 công thức mỗi công thức 2 phương pháp lây (trong đó có
1đối chứng) và 3 lần nhắc lại:
22
CT1: Đối chứng.
CT2: Lây bằng sợi nấm.
CT3: Lây bằng cách phun bào tử.
CT4: Lây bằng cách nhỏ trực tiếp bào tử.
Đối với phương pháp lây sát thương, dùng kim châm các chấm nhỏ lên
thân sau đó dán nấm được cấy trên môi trường PDA và vết châm hoặc phun bào
tử vào các vết châm, nhỏ bào tử trực tiếp vào vết châm. Đối với phương pháp
lây không sát thương dán sợi nấm hoặc phun, nhỏ trực tiếp bào tử vào thân cây
không có vết thương.

Nguồn nấm được lấy từ đĩa nấm đã được cấy thuần trên môi trường sau đó
soi trên kính hiển vi mật độ bào tử khoảng 10
6
.
Quan sát triệu chứng và nhận xét mức độ nhiễm bệnh trên từng cây ký chủ.
Chỉ tiêu theo dõi:
Quan sát triệu chứng biểu hiện trên thân.
Nhận xét khả năng gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum trong nhà
lưới so với ngoài đồng ruộng.
Tính tỷ lệ bệnh:
Tổng số cây bị bệnh
TLB (%) = x 100
Tổng số cây lây
Sau khi lây bệnh tiến hành phân lập lại tác nhân từ các triệu chứng theo
quy tắc Koch.
3.3.10. Thử hiệu lực ức chế nấm bằng nấm đối kháng Trichoderma viride
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri
(đường kính lỗ đục 6mm). Sau khi cấy xong đặt ở nhiệt độ 30
o
C.
Thí nghiệm gồm 4 công thức mỗi công thức 3 lần nhắc lại:
CT1 (Đối chứng): Chỉ cấy T. viride và chỉ cấy N. dimidiatum.
CT2: Cấy T. viride trước sau 24 giờ cấy tiếp N. dimidiatum vào.
CT3: Cấy N. dimidiatum trước sau 24 giờ cấy tiếp T. viride vào.
CT4: Cùng cấy T. viride và N. dimidiatum.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm của N. dimidiatum và T. viride sau
các ngày nuôi cấy. Đường kính trung bình (d) mỗi loại nấm được tính theo công
thức: d = (d1 + d2)/2. Trong đó, d1 và d2 là kích thước hai đường chéo của tản
nấm.
3.3.12. Thử hiệu lực ức chế nấm bằng thuốc thảo mộc trên môi trường nhân PDA

23
Sau khi cấy được nấm thuần trên môi trường PDA, sử dụng các nguồn nấm
thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri đã đổ sẵn môi trường được pha
thuốc thảo mộc với các nồng độ khác nhau (đường kính lỗ đục 6mm).
Thí nghiệm gồm 5 công thức, 1 công thức đối chứng và 4 nồng độ thuốc.
CT1: Đối chứng, cấy trên môi trường PDA.
CT2: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.05.
CT3: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.1.
CT4: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.2.
CT5: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.3.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy. Đường
kính trung bình (d) được tính theo công thức: d = (d1 + d2)/2. Trong đó, d1 và d2
là kích thước hai đường chéo của tản nấm.
3.3.11. Khảo sát hiệu lực ức chế nấm bằng thuốc hóa học trên môi trường PDA.
Loại thuốc: Một số loại thuốc trừ nấm như: Anvil 5SC, Dipcy 750WP,
Vicarben - S 70WP
Nồng độ: Thử ở các nồng độ khác nhau: 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri
trên môi trường PDA được pha các loại thuốc với nồng độ khác nhau (đường kính
lỗ đục 6mm). Nghiên cứu của chúng tôi gồm 3 thí nghiệm 5 công thức (1 đối
chứng) và 3 lần nhắc lại.
Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu lực ức chế nấm của thuốc Anvil 5SC
CT1: Đối chứng.
CT2: Nồng độ thuốc 0.05%.
CT3: Nồng độ thuốc 0.1%.
CT4: Nồng độ thuốc 0.2%.
CT5: Nồng độ thuốc 0.3%.
Thí nghiêm 2: Khảo sát hiệu lực ức chế nấm của thuốc Vicarben - S 70WP
CT1: Đối chứng.
CT2: Nồng độ thuốc 0.05%.

CT3: Nồng độ thuốc 0.1%.
CT4: Nồng độ thuốc 0.2%.
CT5: Nồng độ thuốc 0.3%.
Thí nghiêm 3: Khảo sát hiệu lực ức chế nấm của thuốc Dipcy 750WP
CT1: Đối chứng.
24
CT2: Nồng độ thuốc 0.05%.
CT3: Nồng độ thuốc 0.1%.
CT4: Nồng độ thuốc 0.2%.
CT5: Nồng độ thuốc 0.3%.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy. Đường
kính trung bình (d) được tính theo công thức: d = (d1 + d2)/2. Trong đó, d1 và
d2 là kích thước hai đường chéo của tản nấm.
Hiệu lực ức chế nấm của thuốc được tính theo công thức ABBOTT
C - T
H (%) = x 100
C
Ghi chú: C : Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng .
H(%) : Hiệu lực ức chế nấm của thuốc.
T : Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm.
3.3.12. Xử lý thống kê
Các số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT
phiên bản 5.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh loét hại Thanh long
Thanh long là cây ăn quả nhiệt đới, thích hợp khí hậu nắng nóng, chịu hạn
tốt. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm, lượng mưa cao ở Việt Nam
những năm gần đây cây Thanh long đã bị gây hại nghiêm trọng bởi bệnh loét. Bệnh
gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch làm ảnh hưởng
lớn đến diện tích trồng và năng suất của Thanh long.

Trên ruộng Thanh long, bệnh hại trên thân và quả. Trên quả, vết bệnh lúc đầu
là những đốm tròn nhỏ màu trắng, vết lõm thấp hơn so với bề mặt quả, sau 7 - 10
ngày những đốm trắng lõm xuống tạo thành mảng, vết bệnh có màu vàng cam và phát
triển nhô lên nếu bị nặng gây thối, quả nhũn. Trên thân, có nhiều triệu chứng khác
nhau như vết loét to và có nhiều chấm đen trên bề mặt vết bệnh, vết trắng nhỏ lõm và
vết nâu đỏ lồi.
Bệnh thích hợp trong điều kiện nhiệt độ 20 - 35
o
C. Bệnh hại thân và quả làm
cây sinh trưởng, phát triển kém, giảm năng suất chất lượng quả.
25