CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA HPLC-FPLC

SINH VIÊN THỰC HiỆN
LỚPGIÁO VIÊN HƯỚNG DẪNĐỀ TÀI
CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT
CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT
ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA
ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA
HPLC-FPLC
HPLC-FPLC
MÃ SỐ SINH VIÊN
Mở đầu

Từ khi được nhà thực vật học người
Nga Mikhail Semyonovich Tsvet
phát minh ra đến nay, kĩ thuật sắc kí
đã phát triển nhanh chóng trong
suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu
nhận thấy nguyên tắc nền tảng của
sắc kí Tsvet có thể được áp dụng
theo nhiều cách khác nhau, từ đó
xuất hiện nhiều loại sắc kí khác
nhau
1872–1919
Mở đầu
Mở đầu

High-performance liquid
chromatography-HPLC (sắc ký
lỏng hiệu năng cao) xuất hiện
từ những năm 1960 như là
nhánh của sắc ký lỏng thực
hiện trên cột,trong đó công

nghệ chế tạo cột và các bộ
phận của thiết bị đã được cải
tiến
Mở đầu
So với sắc ký lỏng cột áp suất thấp truyền thống,
HPLC có những ưu điểm vượt trội hơn như:

Tốc độ nhanh

Độ phân giải được cải thiện tốt hơn

Độ nhạy tốt hơn

Khả năng tái sử dụng cột

Lý tưởng cho những ion hoặc phân tử lớn

Thu hồi mẫu dễ
Các ứng dụng của HPLC trong thời kỳ đầu
gồm có phân tích dư lượng thuốc trừ sâu
trong rau quả, các acid hữu cơ, lipid, acid
amin, chất độc và vitamin. Ngày nay, sắc ký
lỏng hiệu năng cao tiếp tục được ứng dụng
để phân tích nhiều loại vật liệu sinh học
khác.Trong đó có kỹ thuật phân tích protein
FPLC (Fast protein liquid chromatography)
Mở đầu

Việc nghiên cứu cấu tạo, nguyên lý hoạt động
của HPLC-FPLC nhằm ứng dụng trong phân

tích sinh học rất cần thiết cho hoạt động nghiên
cứu về sau của sinh viên
CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT
CẤU TẠO, NGUYÊN TẮC HOẠT
ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA
ĐỘNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA
HPLC-FPLC
HPLC-FPLC
đó chính là lý do em chọn đề tài…
Sắc ký là khái niệm chung áp dụng cho nhiều kỹ thuật
tách đa dạng dựa vào sự phân đoạn hoặc phân bố
của mẫu (chất tan) giữa pha di chuyển (pha động) và
pha cố định (pha tĩnh)
TỔNG QUAN
1.1 Phương pháp sắc ký
Chương I
Chương I
1.1.1 Sắc ký là gì?

Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới
chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ
có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá
trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh
này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp
phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với
pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký
so với các chất tương tác yếu hơn pha này
1.1.1 Sắc ký là gì?

Kết quả là các thành phần có trong mẫu sẽ được tách ra

thành từng dãi trong pha động
1.1.1 Sắc ký là gì?

Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự phân bố
trong hai pha như khả năng hòa tan các thành phần
trong 2 pha,khả năng hấp phụ, trao đổi ion, kích thước
các phân tử… nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng
hấp phụ phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động
chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của
việc tách sắc ký
Có nhiều tiêu chí để phân loại các phương pháp
sắc ký, trong đó tiêu chí được sử dụng nhiều nhất
là phân loại theo hệ pha, tức là chất phân tích
phân bố giữa hai pha là gì
Sắc ký
giấy
1.1.1 Sắc ký là gì?
1.1.2 Phân loại sắc ký
Phương pháp
sắc ký
Sắc ký lỏng
HPLC
SK khí-rắn SK khí-lỏng
Sắc ký
phân bố
lỏng-lỏng
Sắc ký
rắn-lỏng
Sắc ký khí
SK phẳng

Sắc ký
điện di
mao quản
Sắc ký
điện di
lớp mỏng
1.1.3 Phân loại sắc ký
1.1.4 Các lực liên kết trong hệ sắc
ký
Trong hệ sắc ký, chất phân tích có thể là các ion, phân tử
trung hoà hay các chất phân cực; đối tượng tác động của
nó cũng có thể là ion, phân tử trung hoà hay chất phân
cực. Từ đó chúng tương tác với nhau theo các lực
liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành 4
loại

Lực liên kết ion

Lực phân cực

Lực Van der Waals

Lực tương tác kỵ nước
1.2 Sắc ký lỏng trên cột
1.2 Sắc ký lỏng trên cột
Cấu tạo hệ thống HPLC:
Bình chứa pha động.
Bộ phận khử khí (degasse)
Bơm cao áp
Bộ phận nạp mẫu

Cột sắc ký (pha tĩnh)
Đầu dò ( detector)
Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu,
xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống
In dữ liệu
•
Thông thường máy HPLC có 4 bình chứa pha động.
Mục đích: Tạo nồng độ pha động theo gradient để thực
hiện rửa giải trong quá trình sắc ký.
•
Không sử dụng hết 4 bình khi dùng máy.
Bình chứa pha động
Vai trò: loại trừ các bọt nhỏ có trong dòng pha động.
Các hiện tượng khi không khử sạch bọt khí :
+ Tỷ lệ pha động cuả các đường dung môi lấy không
đúng sẽ làm cho pic không chính xác.
+ Nếu lượng bọt khí quá lớn, bơm sẽ không bơm
được pha động, máy ngừng làm việc.
Bộ phận khử khí
Bơm cao áp
Mục đích: vận chuyển pha động qua hệ thống sắc ký.
Đặc điểm: Lưu lượng dòng chảy trong bơm thường là 1ml/phút
Được kiểm soát đảm bảo tính đúng và chính xác
Hai loại bơm thường được sử dụng vận hành ở chế
độ: áp suất không đổi hoặc thể tích không đổi.
Cấu tạo: Bơm áp suất không đổi có thiết kế dạng pittong
hoặc dạng bơm tiêm.
Dạng pittong tạo dòng chảy có xung động, vì vậy phải có bộ
phận khử xung cơ học hoặc điện tử để loại trừ dao động của
áp suất. Bộ phận khử xung cơ học gồm 1 bộ phận có thể thay

đổi thể tích tương ứng sự thay đổi áp suất ( ví dụ như kim loại
dễ biến dạng, ống chứa đầy chất lỏng dễ nén…)
Dạng tiêm trục vít tạo ra dòng chảy không có xung nhưng
thể tích bơm hạn chế.
Bộ phận nạp mẫu
Vai trò: Đưa mẫu vào dòng pha động để nạp vào cột sắc
ký.
Ngày nay, hầu như tất cả hệ thống HPLC đều sử
dụng van nạp mẫu. Bơm tiêm sẽ đưa mẫu đến van nạp
mẫu để nạp mẫu vào cột
Cấu tạo của van nạp mẫu
•
Van nạp mẫu là van 6 cổng, trong đó có 1 cổng để
nạp mẫu vào vòng nạp mẫu.
•
Vòng nạp mẫu(sample loops) có thể tích cố định ở áp
suất thường. Thể tích vòng nạp thường dùng là 10-
100 microlit
•
Van có thể điều chỉnh để xoay theo các vị trí LOAD
và INJECT
Nguyên tắc hoạt động của van nạp mẫu:
Khi van nạp ở vị trí LOAD: mẫu được nạp qua bơm
tiêm vào vòng ngoài, lúc đó pha động chảy trực tiếp
vào cột sắc ký.
Khi van nạp xoay đến vị trí INJECT: vòng chứa mẫu trở
thành 1 bộ phận trong dòng chảy của pha động và mẫu
sẽ theo pha động vào cột.
Cột sắc ký

Vai trò: Là công cụ chính để tách riêng các cấu tử có
trong mẫu.
Cấu tạo: Gồm 2 phần chính: +Phần cứng
+Vật liệu nhồi cột
Cột phân tích:
Kích thước cột thường dùng có đường kính trong 4, 5, 6 mm;
chiều dài cột là 10, 15, 25cm.
Cột được nhồi bằng các hạt 3, 5, 10 mm, vận hành ở điều kiện
lưu lượng 1-2ml/phút.
Cột sắc ký
Phần cứng
Dạng ống bằng thép không rỉ, thủy tinh silica nung chảy, titan,
nhựa PEEK (polyether ether ketone); có 1 đầu nối với bộ nạp
mẫu, 1 đầu nối với detector của hệ thống.
Cột precolumn: Là các cột phụ kiện đặt trước cột phân tích
HPLC. 2 loại cột phổ biến nhất là cột precolumn bão hòa và
cột bảo vệ:
•
Cột precolumn bão hòa: chứa những hạt silica trầncos kích
thước lớn. Cột được đặt giữa bơm và bộ nạp mẫu để bão hòa
pha động với silica, nó giúp làm chậm quá trình hòa tan các
vật liệu nhồi trên nền silica trong quá trình sử dụng pha động
chứa nước.
•
Cột bảo vệ: Được phủ bên trong bằng lớp mỏng pha liên kết
hoặc vật liệu nhồi vi hạt giống cột phân tích. Cột được đặt
giữa bộ nạp mẫu và cột phân tích để bảo vệ cột phân tích khỏi
bị nhiễm bẩn bởi những thành phần có tính hấp thụ mạnh. Cột
bảo vệ cần được nhồi lại hoặc thay thế khi năng lực liên kết bị
giảm đáng kể và tạp chất bắt đầu xâm nhập vào cột phân tích.

Vật liệu nhồi cột HPLC
Các yêu cầu chung của vật liệu nhồi cột
+ Vật liệu nhồi cột có chức năng chính là làm chất mang của hệ thống
sắc ký.
Trong sắc ký lỏng-lỏng cổ điển, vật liệu nhồi chỉ có chức năng làm
chất mang cho pha tĩnh. Trong sắc ký loại trừ kích thước, sự tương tác
giữa chất tan và vật liệu nhồi cột là không cần thiết ( do quá trình tách
chỉ dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử). Trong sắc ký hấp
thụ ( sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực) vật liệu nhồi thực hiện đồng thời
cả chức năng là chất mang và chức năng của pha tĩnh. Do đó, có thể
thấy, vật liệu nhồi có thể có liên quan đến quá trình tách thật sự hoặc
không.
+ Vật liệu nhồi phải là sẵn có với kích thước hạt chính xác, đồng đều,
ít thay đổi.
+ Độ bền cơ học đủ lớn để chống lại áp suất tạo ra trong quá trình
nhồi cột và sử dụng.
+ Độ bền hóa học cao, tránh bị ăn mòn nhanh chóng.
Vật liệu nhồi
Chất nhồi cột dựa trên nền silica
1. Silica rỗng: +Đáp ứng khá tốt các yêu cầu của vật liệu nhồi cột.
Các hạt silica có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau tùy mục
đích sử dụng cột sắc ký mà ta chọn loại hạt cho thích hợp.
+Các hạt silica hạt chứa nhiều lỗ nhỏ, có thành phần
chủ yếu là SiO2 với mỗi nguyên tử nằm ở tâm tứ diện đều. Tại bề mặt
hạt, một hóa trị còn lại thường được nhóm OH chiếm, và gọi đó là
silanol, có tác dụng biến tính bề mặt của hạt silica do tính chất hoạt
động của nó.
2. Pha liên kết: được tạo ra nhờ liên kết đồng hóa trị của nhóm
hydrocacbon vào bề mặt silica qua các nhóm silanol tại bề mặt
Nhược điểm chính của chất nhồi trên nền silica : bộ khung silica

hòa tan dần trong dung dịch có nước khi pH>8.
Một số vật liệu được sử dung thay thế: alumina, zirconia, titania,
cacbon graphit rỗng, hydroxyapatite.
3. Vật liệu nhồi có màng mỏng: Tạo bằng cách phủ lớp mỏng lên
bề mặt của vi hạt trơ, thường không rỗng. Vật liệu làm lõi có thể có
bản chất như hạt silica hoặc polymer, latex. Các nhóm chức như
các vị trí trao đổi ion chỉ có ở bề mặt, lõi chỉ đảm nhận làm tăng độ
bền cơ học. Nhược điểm chính: lớp phủ bề mặt làm mất đi số
lượng tâm tương tác làm hiệu quả liên kết giảm.
Chất nhồi cột polymer:
- Bền
- Có thể thay đổi các đặc tính tương tác qua biến đổi hóa học trực
tiếp.

Có 2 dạng vật liệu polymer:
1. Vi lỗ: các hạt tồn tại ở dạng gel, mỗi loại hạt có 1 độ xốp nhất định,
chúng có thể trương nở hoặc co lại khi có sự thay đổi pha động, tuy
nhiên có thể gây vỡ hạt, truyền khối kém, trở lực dòng chảy lớn…
2. Lỗ lớn: Có nhiều liên kết ngang(>50%), gồm 1 mạng các hạt gel
tiểu cầu liên kết nhau tạo thành 1 hạt lớn. Thường được dùng trong
HPLC hơn dạng vi lỗ.
Detector
Vai trò: Nhận biết sự thay đổi nồng độ trong dung dịch ra khỏi cột và
biểu hiện ở dạng tín hiệu điện.
Lựa chọn detector dựa vào: bản chất, nồng độ chất tan, độ nhạy,
phạm vi tuyến tính của detector, tính tương thích với dung môi và chế
độ chạy của pha động ( đẳng dòng hay theo gradient) sử dụng, và cả
tính kinh tế, chi phí vận hành…
Các loại detector được sử dụng rộng rãi nhất :


detector quang phổ khả kiến-tử ngoại,

phổ huỳnh quang

đo chỉ số khúc xạ

phân tích điện hóa
Detector đo dộ hấp thụ UV-VIS

Sử dụng khi hợp chất có chứa nhóm mang màu: chất không no như
ketone, hợp chất có nối đôi liên hợp, vòng thơm, một số ion vô cơ và
các phức chất khác.
Độ lớn của tín hiệu hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích
theo định luật Beer:
A= e x d x C
Detector UV-VIS có 3 kiểu thiết bị khác nhau:
+ Bước sóng đo cố định
+ Bước sóng đo thay đổi được
+ Sử dụng mảng diode
Detector có bước sóng đo cố định:
•
Là kiểu thiết kế đơn giản nhất, vận hành ở bước sóng cố định.
•
Sử dụng 1 kính lọc để tách vạch bức xạ đơn từ nguồn bức xạ (như đèn thủy
ngân…)
•
Dễ vận hành, không đắt tiền
•
Khả năng ứng dụng bị hạn chế.
Detector có bước sóng thay đổi được:

•
Được sử dụng phổ biến nhất
•
Đơn giản, vận hành ở các bước sóng có thể điều chỉnh được.
•
Nguồn bức xạ là đèn tungsten hoặc deuterium, việc lựa chọn bức xạ được
thực hiên nhờ máy đơn sắc.
Detector sử dụng màng diode:
•
Là phương pháp hiện đại, đem lại nhiều thông tin hơn về thành phần mẫu.
•
Cho phép nhận biết các hợp chất có trong 1 hỗn hợp và có thể dùng để đánh
giá độ tinh khiết.
•
Chi phí lớn.
•
Ở thiết bị này, toàn bộ ánh sáng từ đèn deuterium được trải thành 1 phổ trên
một mảng các photodiode gắn trên 1 con chip silic. Thiết bị đo đồng thời độ
hấp thụ tại tất cả các bước sóng và máy tính xử lý số liệu.
Detetor huỳnh quang:

Sử dụng cho các hợp chất hữu cơ có khả năng trả lại 1 phần bức xạ
UV-VIS tại 1 bước sóng dài hơn: hiện tượng phát huỳnh quang, ví dụ
như: vitamin trong thực phẩm, thuốc; các hydrocacbon thơm trong
nước thải…

Đối với những hợp chất có khả năng phát huỳnh quang thì việc đo
dễ dàng. Đối với các hợp chất không có khả năng phát huỳnh quang
thì ta phải biến đổi hợp chất ban đầu thành các dẫn xuất có khả năng
phát huỳnh quang.


Đây là phương pháp có tính chọn lọc và độ nhạy rất cao, là detector
lý tưởng để phân tích lượng vết.

Có giới hạn nhận biết đối với cùng 1 hợp chất nhỏ hơn 100-1000 lần
so với phổ hấp thụ, dễ bị nhiễu nền do bức xạ bên ngoài.