Nghiên cứu tạo kháng thể kháng Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà

i

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
o0o




TRẦN THỊ CẨM TIÊN



NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG Streptococcus iniae
GÂY BỆNH Ở CÁ CHẼM BẰNG CÔNG NGHỆ
TẠO KHÁNG THỂ IgY Ở GÀ



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC



GVHD: ThS. NGUYỄN THỊ KIM CÚC

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

i

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập, được sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình, bạn bè, cùng
với sự nỗ lực của bản thân em đã hoàn thành đề tài này. Qua đây em xin bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến cô ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy,
truyền đạt kinh nghiệm, góp nhiều ý kiến thiết thực, quý giá trong suốt thời gian thực
hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học &
Môi trường. Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu,
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập để em có được nền tảng
kiến thức vững vàng cho những chặng đường tiếp theo.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật đã quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để
bài luận văn được hoàn thành.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả những người bạn đã luôn quan tâm,
động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học cũng như thực hiện đề tài.
Cuối cùng, con xin kính gửi tới bố mẹ và gia đình lòng biết ơn sâu sắc nhất đã
luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ con trong những năm qua.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm
quý báu này!
Nha Trang, tháng 07 năm 2013
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Cẩm Tiên
ii

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH viiii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) 3
1.1.1. Lịch sử phát triển 3
1.1.2. Tổng quan về trứng gà 4
1.1.3. So sánh IgY (kháng thể lòng đỏ trứng gà) và IgG (kháng thể động vật hữu nhũ) 6
1.1.3.1. So sánh cấu trúc của IgY và IgG 6
1.1.3.2. Ưu và nhược điểm của việc sản xuất IgY so với IgG 6
1.1.4. Tính chất của IgY 8
1.2. Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà 9
1.2.1. Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng 9
1.2.2. Các tế bào và cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch 10
1.2.2.1. Các tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch 10
1.2.2.2. Các cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch 11
1.2.3. Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch 11
1.2.4. Các tính chất của đáp ứng miễn dịch 13
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà 14
1.2.5.1. Kháng nguyên 14
1.2.5.2. Liều lượng tiêm 15
iii

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên

1.2.5.3. Vị trí tiêm 15
1.2.5.4. Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm 16
1.2.5.5. Tá dược 17
1.2.5.6. Các nhân tố khác 18
1.3. Thu nhận, tinh sạch và bảo quản IgY 19
1.3.1. Thu nhận lòng đỏ trứng gà 19
1.3.2. Tinh sạch IgY 19
1.3.2.1. Các phương pháp phân tách protein tan trong nước (chứa IgY) và lipid
19
1.3.2.2. Các phương pháp phân tách IgY khỏi phần protein tan trong nước 21
1.3.3. Bảo quản IgY 22
1.4. Dịch bệnh do Streptococcus iniae gây ra 23
1.4.1. Tình hình dịch bệnh 23
1.4.2. Các phương pháp điều trị do Streptococcus iniae hiện nay 24
1.4.3. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán và điều trị hiện nay 25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu 26
2.2. Vật liệu 26
2.2.1. Chủng vi khuẩn 26
2.2.2. Gà mái 26
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất chuyên dụng 26
2.3. Nội dung nghiên cứu 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu 28
2.4.1. Phương pháp gây miễn dịch trên gà 28
2.4.1.1. Chuẩn bị kháng nguyên bất hoạt (vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt) 28
2.4.1.2. Tiến hành gây miễn dịch trên gà 29
iv

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
2.4.2. Phương pháp Bradford 29

2.4.3. Phương pháp SDS - PAGE 30
2.4.4. Phương pháp tách chiết và tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà 35
2.4.4.1. Tách chiết và tinh sạch theo phương pháp Polson 35
2.4.4.2. Tách chiết và tinh sạch IgY theo phương pháp Polson có hiệu chỉnh 37
2.4.4.3. Tách chiết và tinh sạch IgY theo phương pháp acid hóa 38
2.4.5. Phương pháp xác định hiệu giá ngưng kết (agglutination) vi khuẩn
Streptococcus iniae với IgY tinh sạch 38
2.4.6. Phương pháp ELISA 39
2.4.7. Phương pháp Dot Blot 40
2.4.8. Phương pháp xác định khả năng ức chế Streptococcus iniae của IgY tinh
sạch 42
2.4.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 43
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Kết quả nồng độ IgY qua các tuần với các liều kháng nguyên khác nhau 44
3.2. Kết quả tách chiết và tinh sạch IgY 47
3.2.1. Hàm lượng protein (IgY) của các phương pháp tinh sạch 48
3.2.2. Kết quả SDS-PAGE 48
3.3. Một số đặc điểm của IgY kháng Streptococcus iniae 51
3.3.1. Kết quả SDS-PAGE xác định khối lượng phân tử của IgY 51
3.3.2. Tính đặc hiệu và hiệu giá ngưng kết vi khuẩn của IgY trong dịch kháng thể
tinh sạch từ lòng đỏ trứng 53
3.3.2.1. Kết quả ngưng kết vi khuẩn Streptococcus iniae của IgY tinh sạch 53
3.3.2.2. Kết quả ELISA 54
3.3.2.3. Kết quả Dot Blot 55
3.4. Kết quả xác định khả năng ức chế Streptococcus iniae của IgY tinh sạch 56
v

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58
4.1. Kết luận 58

4.2. Đề nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC 64





vi

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên

CÁC TỪ VIẾT TẮT
ABTS 2,2’, azino-di-ethylbenzothiazolinesulfonic
ANOVA Analysis Of Variance
BSA Bovine Serum Albumin
DAB 3-3’-diaminobezidine tetrahydrochloride
DDT Dithiothreitol
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FCA Freund’s Complete Adjuvant
FIA Freund’s Incomplete Adjuvant
IgG Immunoglobulin G
IgY Egg - Yolk Immunoglobulin
kDa Kilo Dalton
OD Optical Density
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PBS - T Phosphate Buffered Saline - Tween
PBS Phosphate Buffered Saline
PEG Polyethylene Glycol
SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TEMED N,N,N,N’– Tetramethylethylenediamine
vii

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thành phần chính trong quả trứng, vỏ ngoài, lòng trắng và lòng đỏ 4
Bảng 1.2. Các thành phần protein và lipid trong lòng đỏ trứng gà 5
Bảng 1.3. So sánh hiệu suất thu nhận kháng thể đa dòng của thỏ và gà (trong suốt giai
đoạn hai tuần theo sau lần miễn dịch thứ hai) 7
Bảng 1.4. Qui trình đề nghị liên quan đến miễn dịch trên gà 16
Bảng 1.5. Thành phần lipid và protein trong dịch nổi khi sử dụng các loại gum khác
nhau 20
Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà mái ở 2 lần tiêm đầu 28
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch BSA dựng đường chuẩn 30
Bảng 2.3. Thành phần và các dung dịch điện di protein 34
Bảng 3.1. Nồng độ IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà qua các tuần sau khi gây miễn
dịch 44
Bảng 3.2. Bảng ANOVA kiểm định kết quả đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm miễn
dịch (T
1,
T
2,
T
3
) và nhóm đối chứng (X) 46
Bảng 3.3. Bảng ANOVA kiểm định ảnh hưởng của các liều kháng nguyên khác nhau
đến sự đáp ứng miễn dịch trên gà 47
Bảng 3.4. Hàm lượng protein (IgY) của 3 phương pháp tinh sạch 48

Bảng 3.5. Kết quả ngưng kết của các nồng độ kháng thể 53
Bảng 3.6. Kết quả Dot Blot ở các nồng độ kháng thể pha loãng khác nhau 56


viii

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên




DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Thành phần cấu trúc của vỏ trứng, màng trứng, lòng trắng và lòng đỏ 4
Hình 1.2. Mô hình đơn giản cấu trúc của kháng thể động vật hữu nhũ (IgG) của thỏ so
với kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) 6
Hình 1.3. Quá trình nhận diện kháng nguyên của các lympho bào 10
Hình 1.4. Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch thu được 11
Hình 1.5. Tính đặc hiệu, nhớ và tự giới hạn của đáp ứng miễn dịch 13
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 27
Hình 2.2. Mô tả hiện tượng biến tính của protein khi ủ với SDS 31
Hình 2.3. Mô hình gel điện di (SDS-PAGE) 33
Hình 2.4. Mô hình của PEG với các khối lượng phân tử khác nhau 1500, 6000 và
20000 Da trong dung dịch nước 36
Hình 2.5. Sơ đồ chẩn đoán miễn dịch theo phương pháp Dot Blot 41
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ IgY và liều kháng nguyên
Streptococcus iniae 45
Hình 3.2. Kết quả SDS-PAGE so sánh 3 quy trình tinh sạch 49
Hình 3.3. Kết quả điện di SDS-PAGE xác định trọng lượng5Error! Bookmark not

defined.
Hình 3.4. Kết quả ELISA ở các nồng độ pha loãng IgY 54
Hình 3.5. Đường cong ức chế sinh trưởng của S. iniae 57

1

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị chống nhiễm
trùng cho con người, động vật đã gây ra một vấn nạn đáng lo ngại, đó chính là sự
kháng kháng sinh của nhiều vi khuẩn có hại như: Streptococcus pneumoniea,
Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria
gonorrhoeae [38]. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học phải tìm ra phương pháp mới
vừa tiêu diệt được vi khuẩn gây hại mà không gây ra tình trạng xuất hiện các vi khuẩn
kháng lại kháng sinh. Phương pháp dùng kháng thể ra đời đã mở ra cuộc cách mạng
mới trong điều trị bệnh cho người và động vât. Sản xuất kháng thể theo cách truyền
thống lấy từ huyết thanh của động vật hữu nhũ (thỏ, cừu, dê , ngựa ) đã gặp những
cản trở lớn: gây đau đớn cho động vật, tốn kém trong việc chăm sóc, tinh sạch kháng
thể và lượng kháng thể thu được không đáng kể, nên chỉ dùng trong điều trị cho người,
gây khó khăn trong công tác điều trị cho các loại động vật. Việc tìm ra cơ chế tạo
kháng thể lòng đỏ trứng từ gà đã giải quyết được khó khăn khi dùng động vật hữu nhũ
vì kháng thể trứng gà có thể thu nhận dễ dàng dựa trên việc thu nhận trứng, ngoài ra
sản xuất IgY có nhiều thuận lợi do chi phí nuôi gà thấp, chăm sóc dễ dàng và năng xuất
sản sinh kháng thể cao.
Việc ứng dụng công nghệ tạo kháng thể IgY trong điều trị và chẩn đoán bệnh
trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam còn nhiều hạn chế. Đối tượng chúng tôi chọn
làm kháng nguyên là vi khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh trên cá chẽm - một loài cá
có giá trị kinh tế cao đang được đưa vào nuôi trồng trong thời gian gần đây. Cá chẽm là
loài giá trị dinh dưỡng cao, nhu cầu thị trường ngày càng mở rộng và là loài phân bố
rộng, dễ nuôi nên được nuôi rất phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới: Trung Quốc, Ấn Độ,

Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam, Australia, Mỹ, Hà
Lan, Anh và Israel….[39]. Việc nuôi cá chẽm ngày càng phổ biến nên vấn đề dịch
bệnh trên cá chẽm được quan tâm nhiều hơn. Có nhiều tác nhân gây bệnh trên cá chẽm
trong đó bệnh nhiễm khuẩn do Streptococcus iniae có tỉ lệ gây chết đến 70% trong một
2

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
thời gian ngắn gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh xảy ra trên cả cá chẽm
nuôi nước ngọt lẫn nước mặn. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo
kháng thể kháng Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm bằng Công nghệ tạo kháng
thể IgY ở Gà” với mục đích sản xuất kháng thể IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà nhằm
tạo tiền đề cho các ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn
Streptococcus iniae gây ra.
Nội dung chính của đề tài
 Khảo sát đáp ứng miễn dịch của Gà với vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt
 Khảo sát quy trình tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng
 Xác định một số đặc điểm của chế phẩm IgY (trọng lượng phân tử, độ sạch, tính
đặc hiệu)

3

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY)
1.1.1. Lịch sử phát triển
Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên chứng minh rằng việc tiêm một kháng
nguyên vào gà mái dẫn đến việc chuyển giao các kháng thể đặc hiệu tương ứng từ
huyết thanh vào lòng đỏ trứng. Trong hơn một trăm năm không có ứng dụng khoa học
cho kiến thức này. Nhưng khi vấn đề đạo đức khoa học được coi trọng thì kết quả của
Klemperer đã thu hút sự chú ý lớn, đặc biệt là từ những năm 1980. Sản xuất kháng thể
từ lòng đỏ trứng tỏ ra ưu thế hơn so với phương pháp lấy huyết thanh lúc bấy giờ vì
hạn chế đau đớn cho động vật thí nghiệm, lượng kháng thể thu được cao từ đó giảm số
lượng động vật thí nghiệm [28], [29].
Từ năm 1980, kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) đã được ứng dụng rộng rãi theo sự
xuất hiện các dạng thương mại như kit tinh sạch IgY, các loại kháng thể thứ cấp kháng
lại IgY gắn kết với các enzyme như alkaline phosphatase, peroxidase… Để mô tả việc
sản xuất, ứng dụng IgY thuật ngữ kỹ thuật IgY ra đời và đã được chấp nhận trên toàn
cầu vào năm 1996. Cũng cùng năm đó, Trung tâm Phê chuẩn Các phương pháp thay
thế ở Châu Âu (European Centre for the Validation Alternative methods - ECVAM) đã
khuyến khích việc sử dụng IgY thay thế cho IgG trong động vật hữu nhũ, để nhằm làm
giảm bớt đau đớn gây ra bởi việc thu nhận kháng thể ở huyết thanh. Đồng thời
ECVAM cũng đưa ra nhiều thông tin về chăm sóc gà đẻ, gây tạo miễn dịch, sử dụng tá
dược và các phương pháp tinh sạch IgY. Năm 1999 cơ quan thú y của chính phủ Thụy
Sĩ đã chấp nhận kỹ thuật IgY như là một phương pháp thay thể để bảo về động vật tốt
hơn [28].
Ngày nay kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực như phát hiện và điều trị bệnh. IgY có thể ứng dụng trong các phương pháp
miễn dịch kiểm nghiệm, mà theo truyền thống thường sử dụng với kháng thể động vật
hữu nhũ, đặc biệt là phương pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch enzyme, Western

4

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
blotting Bên cạnh đó IgY đã được báo cáo là chất bảo về miễn dịch thụ động được sử
dụng thành công trong điều trị các bệnh khó điều trị bằng kháng sinh truyền thống hay
bệnh thiểu năng miễn dịch [23].
1.1.2. Tổng quan về trứng gà
a. Thành phần của trứng gà
Thành phần cấu trúc chính của trứng gồm vỏ ngoài, lòng trắng và lòng đỏ.

Hình 1.1. Thành phần cấu trúc của vỏ trứng, màng trứng, lòng trắng và lòng đỏ [37]
Bảng 1.1. Các thành phần chính trong quả trứng, vỏ ngoài, lòng trắng và lòng đỏ [37]
Thành phần
của trứng
(% tổng)
Thành ph
ần xấp xỉ, % (w/w)

Hàm ẩm Protein Lipid Carbonhydrate

Tro
(khoáng)

T
ổng trứng

(100%)
Vỏ trứng
(9-11%)
Lòng trắng

(60-63%)
Lòng đỏ
(28-19%)
66,1

1,6

87,6

48,7
12,8 - 13,4

6,2 - 6,4

9,7 - 10,6

15,7 - 16,6
10,5 - 11,8

0,03

0,03

31,8 - 35,5
0,3 - 1,0

Dạng vết

0,4 - 0,9

0,2 - 1,0
0,8 - 1,0

91 - 92

0,5 - 0,6

1,1

5

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
b. Thành phần của lòng đỏ
Lòng đỏ trứng gà bao gồm 48% nước, 32 - 35% lipid, 15,7 - 16,6% protein, 0,2 -
1,0 % carbonhydrate, 1,1% thành phần tro. Protein của lòng đỏ trứng gà được chia thành
plasma và granules. Thành phần chính của plasma là lipoprotein mật độ thấp và livetin,
còn thành phần của granule là lipoprotein mật độ cao (được biết là α - và β - lipovitellin)
và phosvitin [37].
Livetin là thành phần chứa kháng thể IgY quan tâm hay còn gọi là γ - livetin, ngoài
ra trong livetin còn có α - livetin (albumin huyết thanh), β - livetin (α
2
- glycoprotein).
Khối lượng phân tử của ba loại livetin lần lượt là 180.000, 80.000, 45.000 Daton.
Bảng 1.2. Các thành phần protein và lipid trong lòng đỏ trứng gà [32]
Thành ph
ần

Thành ph
ần chính

T
ỉ lệ %

Protein
Apovitellenin I
-
VI

Lipovitellin apoprotein
α-Lipovitellin
β-Lipovitellin
Livetins
α-Livetin (albumin lòng trắng)
β-Livetin (α-2-glycoprotein)
γ-Livetin (γ-globulin)
Phosvitin
Biotin gắn với protein
37,
3


26,7
13,3

2,7
4,0
2,7
13,3
Dạng vết
Lipid

Triglyceride

Phosphatidylcholine
Phosphatidylethanolamine
Lysophosphatidylcholine
Cholesterol
Sphingomyelin
65

26
3,8
0,6
4
0,6
6

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
1.1.3. So sánh IgY (kháng thể lòng đỏ trứng gà) và IgG (kháng thể động vật hữu nhũ)
1.1.3.1. So sánh cấu trúc của IgY và IgG
IgY và IgG đều có cấu tạo gồm hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ. IgY có hai
chuỗi nặng (Hv) với khối lượng phân tử 67 - 70 kDa mỗi chuỗi và hai chuỗi nhẹ (L)
với khối lượng phân tử là 25 kDa mỗi chuỗi [33].
Giữa IgY và IgG có điểm khác biệt rõ nhất là số lượng của vùng cố định (C)
trong chuỗi nặng: IgG có ba vùng cố định (Cγ1 - Cγ3), trong khi đó IgY có bốn vùng
cố định (Cυ1 - Cυ4). IgY có thêm một vùng cố định thêm vào với hai chuỗi
carbonhydrate tương ứng nên IgY có khối lượng phân tử là 180 kDa lớn hơn so với
IgG 150 kDa.
Do sự thiếu hụt của vùng hinge giữa Cγ1 và Cγ2 nên IgY ít linh động hơn so với
IgG, trong khi đó vùng này lại là đặc trưng của động vật có vú. Có một số vùng trong
IgY (gần biên giới của Cυ1 - Cυ2 và Cυ2 - Cυ3) chứa điểm chứa glycine và proline

làm giới hạn sự linh động. IgY có điểm đẳng điện là 5,7 - 7,6 thấp hơn IgG và có tính
kị nước hơn IgG [23].

Hình 1.2. Mô hình đơn giản cấu trúc của kháng thể động vật hữu nhũ (IgG) của
thỏ so với kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) [23]
1.1.3.2. Ưu và nhược điểm của việc sản xuất IgY so với IgG
a. Ưu điểm
Việc sử dụng phương pháp sản suất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà thay cho
phương pháp lấy huyết thanh truyền thống từ động vật hữu nhũ góp phần đáng kể trong
7

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
việc giảm đau đớn cho động vật thí nghiệm vì lấy huyết thanh thường gây đau đớn, ảnh
hưởng đến sức khỏe động vật thí nghiệm và vi phạm vấn đề đạo đức. Thay vì lấy máu
định kì theo phương pháp lấy huyết thanh truyền thống thì chỉ cần thu trứng hàng ngày
sau khi gây tạo miễn dịch. Bên cạnh đó gà có phổ phát sinh thấp hơn động vật hữu nhũ
nên mức độ nhạy cảm thần kinh thấp hơn, do đó giảm đau đớn khi tiêm kháng nguyên
tạo miễn dịch.
Sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng còn làm giảm đáng kể số lượng động vật thí
nghiệm vì gà sản xuất ra lượng IgY cao hơn nhiều so với IgG của động vật hữu nhũ
cùng kích thước [20]. Gà đẻ trứng có thể cho gần 250 - 300 trứng một năm và có thể
thu nhận 17 – 35 g IgY tinh sạch từ lòng đỏ của những trứng này. Ngược lại, phương
pháp thu nhận huyết thanh thu được huyết thanh miễn dịch 40 – 50 ml/con thỏ nên chỉ
có khoảng 1400 mg của IgG tinh sạch thu nhận được. Ngoài ra chi phí cho việc nuôi gà
mái sản xuất IgY thấp hơn so với động vật hữu nhũ. Vì vậy, IgY là phương pháp miễn
dịch có hiệu quả kinh tế cho sản xuất qui mô lớn cho kháng thể đặc hiệu khi so với
phương pháp miễn dịch động vật truyền thống [13], [24], [28], [37].
Bảng 1.3. So sánh hiệu suất thu nhận kháng thể đa dòng của thỏ và gà (trong suốt
giai đoạn hai tuần theo sau lần miễn dịch thứ hai) [23]
Đ

ộng vật

Th
ỏ

Gà

Lư
ợng
đ
ộng vật

Phương pháp thu nhận mẫu
Thể tích mẫu (trong 2 tuần)
Tổng lượng kháng thể
Lượng kháng thể đặc hiệu
Thỏ/gà-tổng số
Thỏ/gà-đặc hiệu
Sự hiện diện của những kháng
thể khác
1

Lấy máu (20 ml/tuần)
40 ml máu
200 mg
5% (10 mg)
5 - 6
2 - 11
IgM, IgA, IgE
1

Thu nhận trứng hàng ngày
14 trứng = 210 ml lòng đỏ
1120 mg
2 - 10% (22,4 - 112 mg)
1
1
Không

8

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
Protein của động vật có vú có tính bảo tồn cao thỉnh thoảng lại không đáp ứng
miễn dịch trong thỏ nhưng kháng thể kháng lại những protein này lại thường thành
công trong hệ thống miễn dịch của gà [30].
IgY không gắn kết với protein A và G, không ràng buộc bổ sung cho động vật
có vú, không xuất hiện để phản ứng chéo với globulin miễn dịch động vật có vú, do đó
làm giảm nguy cơ cho kết quả dương tính giả. Đồng thời không kết gắn với protein A
và G, không có phản ứng chéo đối với những nhân tố gây bệnh thấp khớp [20], [28].
b. Nhược điểm
Bên cạch các ưu điểm vượt trội so với IgG thì IgY cũng còn những mặt hạn chế sau:
 IgY không có khả năng trong việc kết dính với protein A và G, mà những
protein này thường sử dụng trong việc phân lập IgY. Tuy nhiên, hiện nay đã có các
nghiên cứu cho phép tách chiết IgY đơn giản. Bên cạnh đó, nghiên cứu “protein
A/protein G” nhằm cho quá trình phân lập IgY đã được tiến hành [32].
 IgY là có khả năng kết tủa kháng nguyên thấp hơn IgG. Đôi lúc kết tủa có thể
tốt hơn bằng cách tăng nồng độ muối trong dung dịch đệm, nhưng khả năng kết tủa
kháng nguyên thấp của IgY vẫn còn là sự thiếu sót có thể ngăn cản việc sử dụng của
của nó trong chuẩn đoán bệnh [32].
 Ngoài ra còn có một số nguyên nhân phụ như: ít sử dụng gà là động vật thí

nghiệm nói chung và những yêu cầu chăm sóc đặc biệt cho loài gà.
1.1.4. Tính chất của IgY
IgY có điểm đẳng điện của IgY nằm trong khoảng thấp hơn so với IgG. IgY
nằm trong khoảng 5,7 - 7,6 trong khi đó các IgG nằm khoảng 6,1 - 8,5.
Có nhiều nghiên cứu về sự ổn định của IgY trong điều kiện pH thay đổi. Có thể
thấy rằng hoạt động của IgY giảm ở pH = 3,5 và gần như hoàn toàn bị mất ở pH = 3.
Trong môi trường kiềm hoạt động của IgY không thay đổi cho đến khi pH tăng lên đến
11. Tuy nhiên, hoạt động bị giảm đáng kể ở pH =12 hoặc cao hơn [32].
9

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
Đối với enzyme, IgY tương đối kháng trypsin hoặc chymotrypsin, nhưng khá
nhạy cảm với pepsin. Hatta (1993) đã chứng minh hầu như tất cả các hoạt động của
IgY đã bị mất sau khi ủ với pepsin, nhưng sau khi 8 giờ ủ với trypsin hoặc
chymotrypsin thì hoạt động của IgY vẫn còn 39% và 41% tương ứng [29].
Theo Shimizu (1992), Hatta (1993) và các cộng sự, IgY ổn định ở nhiệt độ
khoảng 60
0
C và 70
0
C. Hoạt động của IgY giảm khi nung nóng trong 15 phút ở 70
0
C
hoặc cao hơn và IgY đã biến tính nghiêm trọng khi được xử lý nhiệt ở nhiệt độ cao hơn
75
0
C [29].
1.2. Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà
1.2.1. Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng
Giống như động vật hữu nhũ, gà bảo vệ thế hệ con bằng cách truyền kháng thể

sang thông qua giai đoạn sớm của trứng. Do đó, gà mới nở được bảo vệ bởi cơ chế
miễn dịch thụ động cho đến khi hệ thống miễn dịch của chính chúng phát triển một
cách đầy đủ [28].
Kháng thể ở gà gồm có ba loại: IgA, IgM và IgY. Khi trứng gà vẫn còn trong
buồng trứng, gà mái tiến hành chuyển kháng thể vào trứng theo cơ chế sau: IgA và
IgM (nồng độ khoảng 0,15 và 0,7 mg/mL) được tiết ra cùng với những protein khác là
thành phần của lòng trắng trứng gà tại vòi trứng. Trong khi đó, IgY trong huyết thanh ở
nồng độ khoảng 25 mg/mL được chuyển một cách đặc hiệu sang màng lòng đỏ vào
trong lòng đỏ trong suốt quá trình phát triển. Vì receptor đặc hiệu cho việc chuyển IgY
xuất hiện trên bề mặt của màng lòng đỏ. Ở gà con mới nở, IgY được tìm thấy trong
máu, còn IgA và IgM trong đường tiêu hóa [24], [33].
Dựa trên nguyên lý này, muốn thu kháng thể đặc hiệu thì tiến hành gây miễn
dịch trên gà mái. Sau khi bị tiêm kháng nguyên thì gà mái sẽ tự động tạo ra IgY đặc
hiệu cho kháng nguyên quan tâm. IgY đặc hiệu này sẽ được chuyển vào trong lòng đỏ
trứng gà. Tiến hành thu nhận lòng đỏ trứng của gà miễn dịch sẽ thu được kháng thể đặc
hiệu mong muốn.
10

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
1.2.2. Các tế bào và cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch
1.2.2.1. Các tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch [2]
Các tế bào chính của hệ miễn dịch là tế bào lympho, tế bào trình diện kháng
nguyên, và tế bào hiệu quả. Tế bào lympho là những tế bào có khả năng nhận diện một
cách đặc hiệu kháng nguyên lạ và tạo phản ứng chống lại chúng. Do vậy, lympho bào là
tế bào trung gian của cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Có nhiều tiểu quần thể
tế bào lympho khác nhau về cả cách nhận diện kháng nguyên lẫn chức năng của chúng.
Tế bào lympho B là tế bào duy nhất có thể sản xuất kháng thể hòa tan. Chúng
nhận diện kháng nguyên ngoại bào (kể cả kháng nguyên trên bề mặt tế bào) và biệt hóa
thành tế bào tiết kháng thể, do đó chúng có tác dụng như tế bào trung gian của miễn
dịch thể dịch. Tế bào lympho T nhận diện kháng nguyên của vi sinh vật nội bào và có

chức năng tiêu diệt những vi sinh vật này hoặc những tế bào bị nhiễm trùng.
Sự khởi động và phát triển đáp ứng miễn dịch thu được cũng đòi hỏi kháng
nguyên phải được bắt giữ và trình diện cho tế bào lympho. Tế bào chịu trách nhiệm
làm việc này được gọi là tế bào trình diện kháng nguyên (APC). Tế bào trình diện
kháng nguyên được chuyên môn hóa cao nhất là tế bào hình sao (dendritic), chúng bắt
giữ những vi sinh vật từ bên ngoài xâm nhập vào, vận chuyển những kháng nguyên này
đến các cơ quan lympho và trình diện kháng nguyên cho những tế bào T để khởi động
đáp ứng miễn dịch.

Hình 1.3. Quá trình nhận diện kháng nguyên của các lympho bào [2]
11

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
1.2.2.2. Các cơ quan tham gia vào hệ thống miễn dịch
Hệ thống miễn dịch của gà bao gồm bìu fabricius, tủy xương, tụy, tuyến giáp,
tuyến Harderian, nốt bạch huyết, lympho bào tuần hoàn, lympho mô trong đường dinh
dưỡng. Tế bào lympho B được sản xuất từ túi Fabricius. Tủy xương gà là nguồn tạo ra
tế bào túi và mầm thymus, còn tụy là trung tâm cho việc phát triển của tế bào huyết
thanh và tế bào nhớ. Gà không có tụy sẽ sản sinh ra kháng thể thấp. Tuyến ức là trung
tâm phát triển phân hóa tế bào gốc thành lympho T. Sự kích hoạt lympho T tương tự
động vật có vú [13].
Trong các cơ quan miễn dịch của gà, một cơ quan rất đặc biệt khác với động vật
hữu nhũ là túi Fabricius. Túi này là cơ quan lympho - biểu mô nằm ở gần hậu môn, có
chức năng tạo ra tế bào B và tham gia vào đáp ứng miễn dịch dịch thể. Như đã biết, tế
bào B chịu trách nhiệm sản sinh IgY. Vì vậy, nếu cắt bỏ túi này trong giai đoạn phôi
trước khi trứng nở, sẽ làm rối loạn miễn dịch thể dịch làm giảm hàm lượng IgY rất nhiều
và sinh vật sẽ không sản xuất được kháng thể khi gây cảm nhiễm với mầm bệnh [29].
1.2.3. Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch
Quá trình đáp ứng miễn dịch có thể chia ra thành nhiều giai đoạn khác nhau: nhận
diện kháng nguyên, hoạt hóa tế bào lympho và giai đoạn hiệu quả (loại trừ kháng

nguyên). Sau đó là sự trở lại hằng định nội môi và duy trì tính nhớ miễn dịch.

Hình 1.4. Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch thu được [2]
12

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
a. Nhận diện kháng nguyên [2]
Thuyết clon lần đầu tiên được đưa ra bởi Niels Jerne vào năm 1955 và được
Macfarlane Burnet làm sáng tỏ vào năm 1957. Nội dung của thuyết chỉ ra rằng, mỗi cá
thể sở hữu một lượng tế bào lympho với rất nhiều clon khác nhau. Mỗi clon mang sẵn
những yếu tố để nhận diện và đáp ứng với một quyết định kháng nguyên nhất định. Khi
kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể nó tìm đến clon tương ứng và hoạt hóa nó.
Weill và Reynaud (1996) lại đưa ra cơ chế gene để giải thích cho sự đa dạng của
kháng thể. Theo giả thuyết này, động vật có vú hay gà không thể sản xuất ra kháng thể
đa dạng khổng lồ nếu mỗi phân tử kháng thể được mã hóa với những gene riêng biệt.
Thực tế chỉ ra rằng chỉ có một phần gene được dùng trong mã hóa kháng thể. Theo
Weill và Reynaud, có ba cơ chế cơ bản giải thích cho sự đa dạng này: sự sắp xếp lại
của gene, sự đổi chỗ gene và đột biến thể soma.
b. Hoạt hóa tế bào lympho
Sự hoạt hóa tế bào lympho đòi hỏi 2 tín hiệu khác nhau: tín hiệu thứ nhất là
kháng nguyên và tín hiệu thứ hai là các sản phẩm vi sinh vật hoặc là các thành phần
của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đối với vi sinh vật. Ý tưởng này được gọi là thuyết hai
tín hiệu đối với sự hoạt hóa lympho bào. Yêu cầu về kháng nguyên (tức tín hiệu 1)
nhằm đảm bảo tính đặc hiệu của đáp ứng miễn dịch. Còn yêu cầu về kích thích phụ do
sản phẩm vi khuẩn hoặc của đáp ứng bẩm sinh đối với vi sinh vật nhằm đảm bảo phản
ứng chỉ được tạo ra khi cần thiết (tức để chống vi sinh vật) chứ không chống lại các
chất vô hại bao gồm kháng nguyên bản thân.
c. Giai đoạn hiệu quả của đáp ứng miễn dịch: loại bỏ kháng nguyên
Trong suốt giai đoạn hiệu quả của đáp ứng miễn dịch, các lympho bào đã được
kháng nguyên hoạt hóa để tạo ra những chức năng hiệu quả để tiến đến việc loại bỏ

kháng nguyên. Kháng thể loại bỏ kháng nguyên ngoại bào và tế bào T loại bỏ kháng
nguyên nội bào. Chức năng này của kháng thể và tế bào T thường yêu cầu sự tham gia
13

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
của tế bào hiệu quả khác không thuộc hệ lympho và cả cơ chế đề kháng của miễn dịch
bẩm sinh.
d. Hằng định nội môi và duy trì trí nhớ miễn dịch
Vào cuối đáp ứng miễn dịch, hệ thống miễn dịch trở lại trạng thái nghỉ cơ bản
do phần lớn các tế bào tiền thân của lympho bị kháng nguyên kích thích đã chết do
hiện tượng chết lập trình (apoptosis). Chết lập trình là một dạng chết sinh lý được
chuẩn bị trước, trong đó nhân tế bào bị đặc lại và vỡ ra từng mảng, màng bào tương nổi
bọt, không còn sự tách biệt của lớp lipid màng và tế bào chết nhanh chóng bị thực bào
mà các chất nội bào không cần bị giải phóng ra ngoài. Một số tế bào lympho B và
lympho T được biệt hóa thành tế bào ghi nhớ miễn giúp cho đáp ứng miễn dịch lần sau
với chính kháng nguyên đó nhanh và mạnh hơn.
1.2.4. Các tính chất của đáp ứng miễn dịch

Hình 1.5. Tính đặc hiệu, nhớ và tự giới hạn của đáp ứng miễn dịch [2]
 Tính đặc hiệu: Đảm bảo các kháng nguyên khác nhau tạo ra đáp ứng đặc hiệu
riêng cho chúng.
 Tính đa dạng: Cho phép hệ thống miễn dịch đáp ứng được nhiều loại kháng nguyên.
 Tính nhớ: Dẫn đến đáp ứng mạnh hơn đối với kháng nguyên đã từng tiếp xúc.
14

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
 Tính chuyên môn hóa: Tạo ra đáp ứng tối ưu chống lại nhiều loại vi sinh vật
khác nhau.
 Tính tự giới hạn: Cho phép hệ thống miễn dịch đáp ứng được với các kháng
nguyên mới xâm nhập.

 Tính không tự phản ứng với bản thân: Ngăn ngừa các tổn thương đối với cơ thể
chủ trong suốt quá trình phản ứng với kháng nguyên lạ.
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà
1.2.5.1. Kháng nguyên
Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, song một số chất được coi
là kháng nguyên nhưng không gây đáp ứng miễn dịch. Ví dụ, hapten là các chất có
khối lượng phân tử thấp có thể gắn với kháng thể đặc hiệu nhưng bản thân nó không
kích thích tạo kháng thể. Hapten bao gồm các phân tử đường, axit amin, các polime
nhỏ và nhiều loại kháng sinh [3].
Điều kiện bắt buộc của một chất sinh miễn dịch phải có ba yếu tố sau đây [3]:
 Tính lạ: Chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ với cơ thể,
bởi vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với các chất của bản thân. Chất càng
lạ với cơ thể bao nhiêu, khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu.
 Khối lượng phân tử lớn: Nhìn chung kháng nguyên có khối lượng phân tử lớn
hơn 10000 Da. Nếu < 1000 Da (penicilin, progesteron, aspirin…) thì không có tính
sinh miễn dịch. Từ 1000 đến 6000 Da (insulin) có thể có hoặc không có khả năng đáp
ứng miễn dịch.
 Cấu trúc phân tử phức tạp: Một chất có tính sinh miễn dịch phải là chất có cấu
trúc hóa – lí tương đối phức tạp. Các chất có cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn
dịch càng cao.
Kháng nguyên có thể hiện diện với hệ thống miễn dịch là phức hợp kháng
nguyên (ví dụ, vi khuẩn, virus và kí sinh vật) hay là kháng nguyên đơn giản (ví dụ,
protein hay polysaccharide). Protein được nhận diện là kháng nguyên hiệu quả bởi vì
15

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
cấu trúc và sự khác biệt xuất hiện giữa các loài và các cá thể. Peptide (khối lượng phân
tử thấp dưới 10 kDa) có thể được sử dụng là kháng nguyên, nhưng nó nên được kết
hợp với chất mang ví dụ Bovine Serum Albumin hay keyhole limpet haemocyanin theo
Schade (2005) và các cộng sự. Kháng nguyên polysaccharide cũng hiệu quả. Tuy

nhiên, lipid và nucleic acid không thể là kháng nguyên nếu chúng không được bắt cặp
với protein hay polysaccharide [29].
Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay giữa kháng nguyên với tế bào
lympho luôn mang tính đặc hiệu cao. Kháng thể hay tế bào lympho không phải liên kết
với toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ với những phần nhất định của kháng nguyên,
gọi là quyết định kháng nguyên hay epitope. Phần tương ứng với nó trên mỗi kháng thể
gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratope. Phần tương ứng với quyết định kháng
nguyên nằm trên tế bào lympho gọi là thụ thể. Kích thước của epitope khoảng 7×12×35
A
0
gồm 5 - 7 axit amin. Một kháng nguyên có nhiều epitope khác nhau sẽ tạo thành
nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng epitope [3].
1.2.5.2. Liều lượng tiêm
Liều lượng của kháng nguyên ảnh hưởng rất nhiều đến đáp ứng miễn dịch. Quá
nhiều hay quá ít kháng nguyên có thể dẫn đến sự giảm bớt, độ nhạy, sức chịu và những
đáp ứng không mong muốn khác [29].
Liều lượng tiêm phù hợp phụ thuộc rất nhiều vào loại kháng nguyên. Nếu kháng
nguyên là protein thì lượng protein khoảng 10 - 100 µg protein nên được sử dụng [21].
Trong các nghiên cứu tạo kháng thể từ vi khuẩn bất hoạt nồng độ kháng nguyên
thường dùng trong khoảng 10
4
- 10
9
CFU/ml [34].
1.2.5.3. Vị trí tiêm
Có nhiều cách tiến hành thực hiện miễn dịch như là tiêm vào tĩnh mạch; tiêm ở
bụng; tiêm dưới da; tiêm cơ ngực…. Trong phòng thí nghiệm, gà có thể tiêm vào dưới
da cổ. Với động vật còn non, thích hợp cho việc tiêm vào trong cơ của cơ ngực, bởi vì
tiêm dưới da thường khó thực hiện hơn và có thể gây ra stress. Việc tiêm vào trong cơ
16

GVHD: Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Trần Thị Cẩm Tiên
dưới chân cần tránh, vì chúng có thể dẫn đến việc đi khập khiểng [32]. Đối với gà
trưởng thành việc tiêm dưới da dễ tiến hành thường tiêm dưới da ở phần cánh, việc
tiêm dưới da cần tránh các mạch máu, vị trí tiêm cần có độ lan tốt, không nên bị ứ đọng
gây nên các u cục tại vị trí tiêm.
Gần đây, phương pháp miễn dịch bằng đường miệng cũng thu hút nhiều sự chú
ý. Mặc dù khả năng kích thích theo miễn dịch theo đường miệng là thấp hơn nhiều so
với phương pháp tiêm. Tuy nhiên, miễn dịch bằng đường miệng thường được xem là
bớt gây đau hơn cho động vật, và được xem là sự tiến bộ trong các phương thức miễn
dịch tạo kháng thể. Phương pháp này được thực hiện bằng cách đưa hỗn hợp kháng
nguyên và tá dược qua đường miệng và qua đường mũi họng [12].
1.2.5.4. Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm
Bảng 1.4. Qui trình đề nghị liên quan đến miễn dịch trên gà [32]

Đ
ề nghị

Tá dư
ợc (adjuvant)


Lượng kháng nguyên
Vị trí tiêm

Thể tích tiêm
Tần số tiêm

Khoảng cách giữa thời gian tiêm
Độ tuổi của gà

Tá dư
ợc Freund dạng
không hoàn toàn, Specol,
lipopeptide (Pam
3
-Cys-Ser-(Lys)
4
; 250 μg)
10ng - 1mg (tối thích nên 10 - 100 μg)
Tiêm vào trong cơ (đối với gà còn non)
Tiêm dưới da (đối với gà già hơn)
<1 ml
2 - 3 lần, kích hoạt miễn dịch trong suốt giai đoạn
đẻ trứng
4 - 8 tuần
Toàn bộ thời kì đẻ trứng (khoảng 1 năm)
Tổng số lần tiêm phụ thuộc vào loại và liều lượng kháng nguyên, cũng như tá
dược được sử dụng. Trong mọi trường hợp, phải có ít nhất hai lần miễn dịch. Nếu
lượng kháng thể bắt đầu giảm thì nên gây tạo miễn dịch để duy trì kháng thể đặc hiệu
luôn ở mức độ cao. Kháng thể lòng đỏ nên được kiểm tra sau 14 ngày của lần miễn