Phân lập và xác định khả năng gây bệnh lở loét của vi khuẩn Vibrio trên cá ngựa (Hippocampus spp.) tại các trại nuôi ở Nha Trang

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG





PHAN THỊ THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
LỞ LOÉT CỦA VI KHUẨN VIBRIO TRÊN CÁ NGỰA
(HIPPOCAMPUS SPP.) TẠI CÁC TRẠI NUÔI
Ở NHA TRANG









Nha Trang, năm 2013



TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG



PHAN THỊ THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
LỞ LOÉT CỦA VI KHUẨN VIBRIO TRÊN CÁ NGỰA
(HIPPOCAMPUS SPP.) TẠI CÁC TRẠI NUÔI
Ở NHA TRANG









Nha Trang, năm 2013
i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã quan tâm, chỉ bảo và giảng
dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập
tại trường.
Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ sinh học, Ban Giám đốc Viện
Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đồ
án tốt nghiệp tại Phòng Vi sinh - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trong
thời gian từ ngày 02/08/2012 đến ngày 02/06/2013.

Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến
cô Văn Hồng Cầm, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực
hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đặng Thúy Bình – Viện phó Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, chủ nhiệm đề tài “Bảo tồn và lưu trữ nguồn gene các loài
ốc cối (Conus spp.), trai tai tượng (Tridacna spp.) và cá ngựa (Hippocampus spp.)
ven biển Nam Trung Bộ và Nam Bộ, Việt Nam” đã tạo điều kiện để tôi được thực
hiện các nghiên cứu trong mảng bệnh học trên cá ngựa của đề tài. Xin chân thành
cảm ơn ThS. Trương Thị Thu Thủy - cán bộ quản lý Phòng Vi sinh đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những
người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn
giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và
thực hiện đồ án vừa qua. Xin chân thành cảm ơn!
Do bước đầu làm quen với môi trường nghiên cứu khoa học, kinh nghiệm
còn hạn chế nên có thể còn nhiều điều thiếu sót. Kính mong nhận được những ý
kiến đóng góp của quý thầy cô giáo và các bạn.

Nha Trang, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Phan Thị Thảo
ii

DANH MỤC VIẾT TẮT

APW Alkaline Peptone Water
ATCC American Type Collection Culture
(Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ)

CFU Colony-forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
FDA U.SFood and Drug Administration
(Cục Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ)
KIA Kligler Iron Agar
MA Marine Agar
MHA Muller Hinton Agar
MR Methyl Red
NA Nutrient Agar
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
(Ủy Ban Quốc gia về Tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàn)
PCR Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng chuỗi trùng hợp)
RV Rappaport – Vassiliadis
TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salf Sucrose
VP Voges - Proskauer


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC VIẾT TẮT ii
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC BẢNG vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về cá ngựa 3
1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá ngựa 3
1.1.2 Giá trị của cá ngựa 9
1.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá ngựa (Hippocampus spp.)

trên thế giới 11
1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá ngựa (Hippocampus spp.) ở Việt
Nam 13
1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản 14
1.3 Mục tiêu của đề tài 15
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 Đối tượng nghiên cứu 18
2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1 Phân lập vi sinh vật 18
2.3.2 Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa 20
2.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 21
2.5 Lập kháng sinh đồ 22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1 Kết quả 23
3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn 23
3.1.2 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 27
iv

3.1.3 Kháng sinh đồ 31
3.2 Thảo luận 34
3.2.1 Định danh vi khuẩn dựa trên các đặc điểm sinh hóa và 16S rDNA 34
3.2.2 Độc lực của các chủng phân lập được 35
3.2.3 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh 36
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
4.1 Kết luận 37
4.2 Kiến nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu tạo của cá ngựa 4
Hình 1.2: a) Loài Hippocampus kuda 6
Hình 1.2: b) Loài Hippocampus spinosissimus 6
Hình 1.3: Bản đồ phân bố cá ngựa trên thế giới (Project Seahorse, 1999). 7
Hình 1.4: Bản đồ phân bố cá ngựa đen Hippocampus kuda và cá ngựa gai
Hippocampus spinosissimus (Lourie và cs., 1999). 8
Hình 1.5: Một số loài cá ngựa tại vùng biển Khánh Hòa 9
Hình 1.6: Cá ngựa đen (Hippocampus kuda) bị bệnh lở loét bị bạc da và lở loét
đuôi 16
Hình 2.1: Sơ đồ xác định chủng vi sinh vật 19
Hình 2.2: Cá ngựa đen được gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vây ngực 22
Hình 3.1: a) Chủng TNX-X1 trên môi trường TCBS 25
Hình 3.1: b) Chủng TNX-X1 phát sáng trên môi trường NA + NaCl 3% 25
Hình 3.2: Chủng YR-X2 trên môi trường TCBS 25
Hình 3.3: a) Biểu hiện của cá ngựa sau khi cảm nhiễm chủng TNX-X1 28
Hình 3.3: b) Biểu hiện của cá ngựa sau khi cảm nhiễm chủng YR-X2 28
Hình 3.4: Tỷ lệ cá chết tích luỹ (%) theo thời gian cảm nhiễm 2 chủng vi khuẩn
TNX-X1 và YR-X2 28
Hình 3.5: LD
50
do chủng vi khuẩn TNX-X1 gây ra trên cá ngựa đen (H. kuda) sau
khi cảm nhiễm. 29
Hình 3.6: LD
50
do chủng vi khuẩn YR-X2 gây ra trên cá ngựa đen (H. kuda) sau
khi cảm nhiễm. 30

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2 26
Bảng 3.2: Kết quả cảm nhiễm chủng TNX-X1 trên cá ngựa đen H. kuda 29
Bảng 3.3: Kết quả cảm nhiễm chủng YR-X2 trên cá ngựa đen H. kuda 30
Bảng 3.4: Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của hai
chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2. 31
Bảng 3.5: Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của TNX-X1 với các dữ trên
Genbank 33







1

LỜI MỞ ĐẦU

Cá ngựa (Hippocampus spp.) phân bố khắp các vùng nhiệt đới Ấn Độ - Thái
Bình Dương (Lourie và cs., 1999). Chúng thường sống ngụy trang trong các thảm
cỏ biển, rạn đá, rạn san hô. Từ lâu, cá ngựa được biết đến là nhóm động vật thủy sản
có giá trị cao trong y - dược học. Hằng năm, trên thế giới, có khoảng 20 triệu cá
ngựa được đánh bắt từ tự nhiên (Vincent, 1996) với mục đích: điều trị nhức mỏi,
viêm nhiễm, yếu sinh lý hoặc khó sinh nở (Ryan và Ray, 2004; Trương Sỹ Kỳ và
Đỗ Hữu Hoàng, 2006; Ryua và cs., 2010). Cá ngựa không chỉ dùng làm thuốc chữa

bệnh mà còn được làm cá cảnh. Do nhu cầu tiêu thụ cá ngựa ngày càng lớn làm
nguồn lợi cá ngựa ngoài tự nhiên giảm. Theo Hilomen-Garcia (1999), ở một số
vùng, lượng khai thác cá ngựa giảm 50% chỉ trong vòng 5 năm. Vì lý do đó, cá
ngựa trở thành đối tượng được nhiều nhà nghiên cứu bảo tồn thiên nhiên chú ý và
được nhiều ngư dân nuôi trồng thủy sản quan tâm (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Gần đây, cá ngựa đã trở thành đối tượng nuôi của nhiều quốc gia trên thế
giới. Ở Ấn Độ, cá ngựa đen Hippocampus kuda được nuôi phổ biến (Raj và cs.,
2010). Tại Iloilo (Philippines), Sở Nuôi trồng và phát triển thủy sản Đông Nam Á
(SEAFDEC) đã tiến hành nuôi và sản xuất giống cá ngựa Hippocampus kuda
(Bleeker, 1852). Ở Việt Nam, nuôi cá ngựa đã được phát triển ở nhiều nơi như:
Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bà Rịa-Vũng Tàu…
Trong thời gian qua, để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong và ngoài nước, các cơ
sở, trại nuôi đã mở rộng quy mô sản xuất lớn. Tuy nhiên, các cơ sở nuôi cá ngựa
luôn phải đối mặt với các vấn đề như điều kiện dinh dưỡng không đảm bảo, đặc biệt
là bệnh xảy ra đã làm cá ngựa chết hàng loạt trong thời gian ngắn (Truong, 1998;
Murugan và cs., 2009).
Cá ngựa là loài có khả năng đề kháng yếu, rất dễ nhiễm các tác nhân gây
bệnh. Trong số các vi khuẩn gây bệnh lở loét ở cá, Vibrio được công bố nhiều nhất
là tác nhân gây bệnh trên nhiều loài cá nước mặn. Hiện đã có nhiều công trình trong
và ngoài nước nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh của vi
2

khuẩn Vibrio trên nhiều loài cá. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về bệnh trên
cá ngựa vẫn còn hạn chế.
Từ những lý do trên, tôi nghiên cứu đồ án “Phân lập và xác định khả năng
gây bệnh lở loét của vi khuẩn Vibrio trên cá ngựa (Hippocampus spp.) tại các
trại nuôi ở Nha Trang”. Qua nghiên cứu này, tôi phân lập, định danh và xác định
độc lực của một số chủng vi khuẩn phân lập trên cá ngựa có biểu hiện bệnh. Đồng
thời xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được,
góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho việc ngăn ngừa và điều trị bệnh.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cá ngựa
1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá ngựa
1.1.1.1 Đặc điểm sinh học
Cá ngựa thuộc bộ phụ cá Chìa Vôi, họ Syngnathidae, giống Hippocampus và
xuất hiện cách đây ít nhất 40 triệu năm (Fritzsche, 1980). Kích thước của các loài cá
này thay đổi khá lớn, loài nhỏ nhất H. minotaur (được tìm thấy ở Úc) chỉ dài 10 –
20mm, trong khi đó loài H. ingens ở Thái Bình Dương dài đến 300mm (Vincent,
1996). Cá ngựa có hình dáng kỳ lạ, đầu giống đầu ngựa, mõm hình ống, không có
răng, thân không có vảy, không có vây đuôi như các loài cá thông thường khác. Cơ
thể cá ngựa có nhiều vòng xương ở thân và đuôi. Cá thường bơi đứng, di chuyển
chậm. Do khả năng di chuyển chậm nên cá thường sống ngụy trang trong các thảm
cỏ biển, rạn đá, rạn san hô và có thể thay đổi màu sắc cơ thể theo môi trường sống
để trốn tránh kẻ thù. Đặc biệt, cá ngựa là loài duy nhất có con đực đẻ con. Do đó, cá
ngựa đực trưởng thành có túi ấp dưới phần bụng, cá ngựa cái không có túi này. Khi
buồng trứng đạt đến giai đoạn chín muồi thì cá cái chuyển trứng của mình vào túi
ấp trứng của con đực - nơi trứng được thụ tinh. Tùy thuộc vào loài và nhiệt độ nước
mà quá trình mang thai có thể kéo dài từ 10 ngày đến 6 tuần (Lourie và cs., 1999).
Cá ngựa con được sinh ra và sống độc lập, không nhận được sự chăm sóc từ cá bố
mẹ. Hầu hết các loài cá ngựa đẻ từ 100 - 200 cá ngựa con trong mỗi đợt sinh nở
(Vincent, 1996).

4


Hình 1.1: Cấu tạo của cá ngựa

(Nguồn: Sarah Jones, Florida Institute of Technology:

Cá ngựa con ăn được nhiều loại động vật phù du khác nhau và động vật giáp
xác cỡ nhỏ. Chế độ ăn uống của cá ngựa thay đổi khi chúng lớn (Lourie và cs.,
1999). Thức ăn chính của cá ngựa lớn là những động vật phù du Copepoda, tôm
Mysidaceae và Artemia, đặc biệt chúng chỉ ăn những con mồi còn tươi sống. Trong
điều kiện nuôi nhốt, chúng có thể ăn thức ăn nổi, ăn đáy hoặc ăn những con mồi
bám vào thành bể. Cá ngựa theo dõi con mồi ở nhiều tư thế và vị trí khác nhau. Khi
phát hiện con mồi, cá chọn vị trí thích hợp rồi bất chợt tấn công, khi đớp mồi có
phát ra tiếng tép (Trương Sĩ Kỳ, 2000). Trên thế giới có tất cả 32 loài cá ngựa
(Lourie và cs., 1999). Ở Australia tìm thấy một số loài như H. abdominalis (cá ngựa
bụng lớn), H. angustus (cá ngựa bụng hẹp), H. bargibant (cá ngựa Bargibant), H.
breviceps (cá ngựa mõm ngắn), H. histrix (cá ngựa gai dài), H. minotaur (cá ngựa
Bullneck), H. planifrons (Dahl's Seahorse), H. whitei (cá ngựa vương niệm), H.
spinossissimus (cá ngựa gai), H. zebra (cá ngựa vằn), ở Bắc Mỹ có H. erectus (cá
Con đực
Con cái
Thân
Mắt
Mắt
Túi ấp trứng
Vây lưng
Đuôi
Đuôi
Vây hậu môn
Thân
Mõm
Mõm
Vây lưng
Vây ngực

Vây ngực
5

ngựa đốm trắng), H. ingens (cá ngựa Thái Bình Dương), H. reidi (cá ngựa Brazil); ở
châu Âu có H. hippocampus (cá ngựa mõm ngắn), H. ramulosus (cá ngựa mõm
dài), Hippocampus algiricus (cá ngựa Tây Phi) được tìm thấy ở bờ biển phía tây của
châu Phi và nhiều loài cá ngựa ở Ấn Độ - Thái Bình Dương như H. kelloggi (cá
ngựa thân trắng), H. borboriensis…
Vì cá ngựa thay đổi màu sắc rất linh hoạt để phù hợp với môi trường sống
nên việc xác định loài thường gặp nhiều khó khăn, vì thế chúng có tới 120 tên gọi
khác nhau. Vincent (1996) cho rằng cá ngựa có màu đen (tên thông thường của loài
H. kuda) là tên gọi chung cho ít nhất 10 loài riêng biệt và được dân gian dùng làm
thuốc chữa bệnh từ lâu.
Theo ITIS (Integrated Taxonomic Information System - Hệ thống phân loại
sinh vật quốc tế) cá ngựa được phân loại như sau :
Giới: Animalia (Động vật)
Ngành: Vertebrata (Động vật có xương sống)
Lớp: Osteichthyes (Cá xương)
Bộ: Gasterosteiformes
Họ: Syngnathidae (Cá chìa vôi)
Giống: Hippocampus (Cá ngựa)

Như đã nói trên, có khoảng 32 loài cá ngựa khác nhau. Tuy nhiên, trong nội
dung bài viết, tôi trình bày về việc phân lập vi khuẩn Vibrio gây bệnh lở loét trên 2
đối tượng chính: Hippocampus kuda (cá ngựa đen) và Hippocampus spinosissimus
(cá ngựa gai).
Cá ngựa đen (Hippocampus kuda)
Cá có màu đen hoặc nâu. Đôi khi cá có màu vàng và sự thay đổi màu và hiện
tượng này chỉ xảy ra đối với con cái. Chiều dài cá khai thác dao động từ 80 –
160mm (Trương Sĩ Kỳ, 2000).

Cá sinh sản quanh năm, mùa đẻ chủ yếu vào tháng 4 - 5 và tháng 9 – 12
(Trương Sĩ Kỳ và Đoàn Thị Kim Loan, 1994). Cá cái chín muồi sinh dục ở kích
6

thước 100 mm (khoảng 1 năm tuổi). Cá ngựa đực 1 năm tuổi có kích thước 90 mm
đã chín muồi sinh dục có thể nhận trứng để ấp trong túi của mình, mỗi cá thể đực có
thể nhận 231 - 1405 trứng để ấp trong túi (Trương Sĩ Kỳ và Đoàn Thị Kim Loan,
1994). Thời gian phát triển phôi là 17 ngày ở nhiệt độ nước 27 - 30
0
C (Trương Sĩ
Kỳ và Đoàn Thị Kim Loan, 1994; Foster và Vincent, 2004). Cá bột sau khi nở vẫn
nằm trong túi ấp của cá bố, dinh dưỡng nhờ khối noãn hoàng lớn ở bụng đến khi
phát triển hoàn chỉnh thành cá con thì cá bố đẻ con vào môi trường. Nếu vì một lý
do nào đó trứng trong túi ấp không nở thì cá cũng sẽ chết (Trương Sĩ Kỳ, 1994).
Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus)
Cá ngựa gai có màu vàng hoặc nâu, đôi khi có các đốm trên thân với những
màu khác nhau. Thân và đuôi có nhiều gai nhọn. Chiều dài khai thác dao động từ
70-170mm (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Cá sinh sản quanh năm, mùa sinh sản chủ yếu vào tháng 5 - 11. Theo các kết
quả nghiên cứu trong bể nuôi thí nghiệm cho thấy, mỗi lứa cá đực ấp từ 205 - 622
trứng, thời gian phát triển phôi ở nhiệt độ 27 - 30
0
C là 11 - 12 ngày (Trương Sĩ Kỳ,
2000).

Hình 1.2: a) Loài Hippocampus kuda b) Loài Hippocampus spinosissimus
7

(Bleeker, 1852) (Weber, 1913)
(

1.1.1.2 Phân bố
Cá ngựa phân bố khắp nơi trên thế giới khoảng từ vĩ độ 45
0
Bắc – 45
0
Nam
(Project Seahorse, 1999). Cá ngựa sống chủ yếu ở vùng cỏ biển, rừng ngập mặn, rạn
san hô hoặc khu vực cửa sông của vùng biển nhiệt đới và ôn đới (Lourie và cs.,
1999). Hầu hết các loài phân bố trong khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương
(IndoPacific) (Vincent, 1996), từ trung tâm Baja California, phía bắc Mexico, qua
Guatemala, El Salvador, Panama, Columbia, Ecuador Pucusana, phía nam Peru, mở
rộng đến phía tây quần đảo Galapagos (Fritzsche, 1980).
Hầu hết cá ngựa được tìm thấy ở độ sâu từ 1 đến 15 mét. Phạm vi di chuyển
của cá ngựa trong môi trường sống tương đối nhỏ và có sự khác nhau giữa con đực
và con cái. Nghiên cứu loài cá ngựa Hippocampus whitei ở Úc cho thấy phạm vi cư
trú của con đực khoảng 1m
2
, con cái khoảng 100m
2
(Vincent, 1996).

Vùng phân bố của cá ngựa
(
Hình 1.3: Bản đồ phân bố cá ngựa trên thế giới (Project Seahorse, 1999).
Cá ngựa thường sống ở độ mặn 30 - 34‰, nhiệt độ nước 25 - 32
0
C, trên
những rạn san hô hoặc những vùng có thảm thực vật lớn (như rong tảo, cỏ biển), độ
8

trong cao (Trương Sĩ Kỳ, 2000). Chúng dùng đuôi cuốn chặt vào các nhánh cây để
giữa cho thân thẳng đứng và không bị dòng nước hay sóng đẩy đi.
Cá ngựa đen H. kuda và cá ngựa gai H. spinosissimus tập trung chủ yếu ở
khu vực Đông Nam Á: Campuchia, Indonesia, Malaysia, Myanmar, Philippines,
Thái Lan , Việt Nam và một số nước khác như Australia, Trung Quốc, Pháp, Ấn
Độ, Nhật Bản, Pakistan, Singapore (Lourie và cs., 2004).

Khu vực phân bố của cá ngựa đen và cá ngựa gai.
Hình 1.4: Bản đồ phân bố cá ngựa đen Hippocampus kuda và cá ngựa gai
Hippocampus spinosissimus (Lourie và cs., 1999).
Ở Việt Nam, người ta thường thấy cá ngựa ở Vịnh Bắc bộ, Đà Nẵng, Quảng
Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu -
Côn Đảo, Kiên Giang, Phú Quốc (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Tại Khánh Hoà có 7 loài cá ngựa đã được tìm thấy, sống chủ yếu ở các rạn
san hô, thảm cỏ biển và cửa sông dọc theo bờ biển (Trương Sĩ Kỳ, 2000). Một số
loài cá ngựa được tìm thấy tại vùng biển Khánh Hòa như: Cá ngựa gai
(Hippocampus spinosissimus), cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus), cá
ngựa đen (Hippocampus kuda), cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi), cá
ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix).
9


Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus, Leach và Nodder, 1814)
(

Cá ngựa gai nhọn Cá ngựa thân trắng
(Hippocampus histrix) (Hippocampus kelloggi)
(Kaup, 1856 ) (Jordan và Snyder, 1902)
Hình 1.5: Một số loài cá ngựa tại vùng biển Khánh Hòa
1.1.2 Giá trị của cá ngựa

1.1.2.1 Lịch sử khai thác và sử dụng cá ngựa
Cá ngựa là loài có giá trị xuất khẩu cao. Theo người tiêu dùng, cá có màu
trắng hoặc màu vàng có chất lượng tốt hơn. Gần 77 quốc gia và vùng lãnh thổ có
các hoạt động buôn bán và kinh doanh cá ngựa (Project Seahorse, 2006; Salin và
Mohankumaran, 2006). Thông thường cá càng lớn giá càng cao, cá ngựa gai và cá
ngựa thân trắng có giá trị cao hơn các loài cá khác (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Trong những năm 1980, chỉ tính riêng ở châu Á, tiêu thụ hàng năm được
ước tính khoảng 45 tấn cá ngựa. Sử dụng cá ngựa với mục đích chữa bệnh tăng 10
lần và tiếp tục tăng từ 8 đến 10% trong mỗi năm sau đó (Vincent, 1996).
Các quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan là các nhà nhập khẩu cá ngựa lớn
nhất. Năm 1992, Trung Quốc tiêu thụ khoảng 20 tấn cá ngựa khô. Năm 1994, Đài
Loan nhập khẩu khoảng 3.000.000 con cá ngựa (Seahorse culture, 1998). Theo báo
10

cáo của Vincent (1996), vào năm 1995, có ít nhất 20 triệu con cá ngựa khô đã được
giao dịch trên toàn thế giới. Các nhà xuất khẩu cá ngựa lớn nhất hàng năm là Ấn Độ
với sản lượng bán ít nhất là 1,3 triệu con cá ngựa; Philippines, Thái Lan với sản
lượng bán khoảng 3.000kg cá ngựa khô trên thị trường (Vincent, 1996).Tại
Australia, các dịch vụ kiểm tra ước tính rằng hơn 150.000 mẫu cá ngựa được xuất
khẩu trong khoảng thời gian từ tháng 7 năm 1995 đến tháng 1 năm 1997 (Robert
Hill, 1997).
Tại Việt Nam, nhìn chung cá ngựa tiêu dùng trong nội địa không lớn, chủ
yếu cá được xuất khẩu ra các khu vực như Trung Quốc, Đài Loan thông qua các
Công ty Xuất nhập khẩu Hải sản. Sản lượng xuất khẩu được ước tính ít nhất là 5 tấn
cá ngựa trong năm 1996. Các tỉnh miền Trung (từ Đà Nẵng đến Bình Thuận) sản
lượng khai thác cá ngựa khoảng 2 tấn khô/năm. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam,
giá mỗi con cá ngựa đen khoảng 20.000 – 30.000 VNĐ tùy thuộc vào kích thước. Ở
HongKong, giá 1kg cá ngựa khô (chiều dài 150mm trở lên) có thể lên đến 1.200
USD (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
1.1.2.2 Giá trị dƣợc liệu của cá ngựa

Cá ngựa không chỉ được dùng làm dược liệu mà còn được làm cá cảnh.
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, cá ngựa đươc xem như một phương thuốc quý
để chữa các bệnh bao gồm bệnh hen suyễn, gãy xương, rối loạn thận. Ngoài ra, cá
ngựa còn được sử dụng để điều trị nhức mỏi, viêm nhiễm, yếu sinh lý hoặc khó sinh
nở (Trương Sỹ Kỳ và Đỗ Hữu Hoàng, 2006; Ryua và cs., 2010), tác dụng làm giảm
kích thước của tế bào ung thư, thúc đẩy quá trình tạo bạch cầu hoặc hóa lỏng các khối
u ở người của cá ngựa đã được công bố (Zhang và cs., 2003).
Theo Đông y, cá ngựa có tính ôn, vị ngọt, không độc. Ở Trung Quốc, hàng
năm có tới 5.000kg cá ngựa khô làm dược liệu và được ghi đầu tiên vào bộ sách
Bản Thảo Cương mục Thập Di của Triệu Học Mẫn (1765). Các nước Đông nam Á
từ lâu cũng dùng cá ngựa để điều chế thuốc chữa bệnh và thuốc bổ (Sách đỏ Việt
Nam, 2007).
11

Một số nghiên cứu chứng minh cá ngựa có thành phần amino acid rất đầy đủ
và có tiền chất của prostaglandine - hormone kích thích quá trình sinh tinh ở nam
giới (Đỗ Tuyết Nga, 1991; Lin và cs., 2008; Lin và cs., 2009). Các chất này giúp
phục hồi sinh lực nhanh, tái tạo tinh trong thời gian ngắn ở phái nam nhờ vậy tăng
cơ hội thụ tinh ở nhiều cặp vợ chồng hiếm muộn (Zhang và cs., 2003). Trong thực
tế, ngư dân khi bắt được cá ngựa sẽ bảo quản sản phẩm bằng cách ngâm rượu ngay
khi cá ngựa còn sống hoặc đem phơi nắng cho khô rồi sau đó ngâm rượu, hoặc sao
vàng tán nhuyễn thành bột bán trên thị trường để phục vụ cho các mục đích trên
(Hoàng Tùng và cs., 2011).
1.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá ngựa (Hippocampus spp.) trên
thế giới
Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ cá ngựa trong nước và quốc tế, gần đây nhiều
quốc gia tiến hành nuôi cá ngựa như Australia (H. abdominalis), Sri Lanka (H. kuda),
Việt Nam (H. kuda), Indonesia (H. kuda), Brazil (H. reidi), Mexico (H. erectus), Ai-len
(H. hippocampus) và New Zealand (H. abdominalis) (Project Seahorse, 2006). Tuy
nhiên vấn đề về dinh dưỡng và bệnh làm cá chết hàng loạt đã gây ảnh hưởng nghiêm

trọng đến việc nuôi cá ngựa (Truong, 1998; Lourie và cs., 1999).
Sự suy thoái môi trường sống, điều kiện quản lý không thích hợp là nguyên
nhân dẫn đến sự xuất hiện các tác nhân gây bệnh. Phần lớn bệnh do vi khuẩn gây ra
làm giảm mạnh số lượng loài trong thời gian qua (Sreepada và cs., 2002).
Trong số các vi khuẩn gây bệnh ở cá biển, Vibrio spp. là một trong những
nguyên nhân gây ra các thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế. Vi khuẩn này thường có
mặt trong môi trường biển và bùng phát dịch bệnh xảy ra khi cá tiếp xúc với tác
nhân gây bệnh hiện diện khi điều kiện môi trường bị suy thoái (Austin và Austin,
1993). Các nghiên cứu bệnh trên cá ngựa gần đây cho thấy Vibriosis gây chết với tỉ
lệ hơn 90% (Alcaide và cs., 2001). Ortigosa Moo và cs. (1989) cho rằng sự xuất
hiện của V. harveyi và V. mediterranei liên quan mật thiết với nhiệt độ. Vibrio được
phân lập từ nước biển tại Hàn Quốc trong tháng 8 khi nhiệt độ nước và nhu cầu oxy
hóa học (COD) cao, độ pH và độ mặn thấp (Kim và cs., 1990). Tỷ lệ phân lập được
12

chủng V. cholerae tăng khi nhiệt độ và lượng chất hữu cơ tăng (Redacliff và cs.,
1993).
Bệnh Vibriosis là bệnh do một số loài vi khuẩn như Vibrio
parahaemolyticus, V. algonolyticus, V. harveyi, V. vulnificus gây nên với các biểu
hiện mòn vây, cụt đuôi, lở loét, xuất hiện nhiều đốm xuất huyết trên bề mặt cơ thể,
xuất huyết dưới da và phần cơ. Bệnh xảy ra ở nhiều loài cá biển và cửa sông, chúng
thường xuất hiện khi môi trường nước xấu, cá bị sốc và thiếu dinh dưỡng (Glenn và
cs., 2007). Khi nhiễm Vibrio, cơ thể cá trở nên bạc màu, lờ đờ, chán ăn, có các vết
loét đỏ trên cơ thể (Bloch, 1790).
Theo nhiều báo cáo cho thấy rằng vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae xuất hiện
rất nhiều trong đường tiêu hóa của loài cá và giáp xác (Dempsey và cs., 1989;
Ringo và cs., 1995; Spanggaard và cs., 2000; Oxley và cs., 2002) và loài vi khuẩn
này cũng được phân lập từ đường ruột của cá ngựa H. guttulatus trong điều kiện
nuôi nhốt (Balcazar và cs., 2010).
Theo nghiên cứu của Alcaide và cs. (2001), Tendencia (2002), Bombardini

và cs. (2006), Balcázar và cs. (2011), Martins và cs. (2010) cho thấy Vibrio harveyi,
V. alginolyticus và V. splendidus là nguyên nhân chính gây bệnh ở cá ngựa, dấu
hiệu chính là xuất huyết và gây hoại tử trên da.
Nghiên cứu của Martins và cs. (2010) cho thấy sự xuất hiện bệnh do Vibrio
alginolyticus gây ra trên cá ngựa Hippocampus reidi ở Brazil làm ảnh hưởng đến
sản lượng cá nuôi ở nước này. Vì Vibrio alginolyticus có khả năng sinh độc tố (Lee,
1997) gây tổn thương các cơ quan chức năng như thận, mang và gan cá làm ảnh
hưởng đến hoạt động trao đổi chất của cá dẫn đến tỷ lệ chết cao. Kết quả của việc
phân lập tám mẫu cá ngựa bệnh với các triệu chứng lờ đờ, bỏ ăn, hoại tử ở đuôi
được thu thập từ hồ của Viện nghiên cứu biển (IIM-CSIC, Tây Ban Nha) vào giữa
tháng 3 năm 2007 đến tháng 5 năm 2009 đã chứng minh rằng Vibrio alginolyticus
và Vibrio splendidus là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương cho cá ngựa.
Bên cạnh đó, Vibrio harveyi được báo cáo là một tác nhân gây bệnh cơ hội ở
một số loài cá nước mặn (Austin và Austin, 2007). Theo mô tả của Raj và cs.
13

(2010), Vibrio harveyi là tác nhân gây bệnh đốm trắng, thối đuôi và hoại tử trên cơ
thể của cá ngựa nuôi nhốt, Hippocampus kuda. Ngoài Vibrio, vi khuẩn
Aeromonasspp., Tenacibaculum maritimum cũng là tác nhân gây chết cao ở cá với
triệu chứng lở loét da (Bombardini và cs., 2006). Theo nghiên cứu của Ringo và cs.
(1995) cho thấy các vi khuẩn được phân lập từ ruột của cá ngựa còn có các chủng
Bacillus spp., Vibrio spp., Staphylococcus sp., Burkholderia sp., Providencia spp.,
Enterococcus sp., Pseudoalteromonas sp., Phaeobacter spp., Enterovibrio sp. và
Shewanella spp.
Ngoài ra, các khối u trong gan, thận, mang kết hợp với các tổn thương của da
và mang bị ăn mòn đã được Cheung và cs. (1980) xác định ở cá ngựa là do tác nhân
ký sinh trùng như Uronemamarinum gây ra.
1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá ngựa (Hippocampus spp.) ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cá ngựa được phát triển ở nhiều nơi như: Huế, Đà Nẵng,
Khánh Hòa, Ninh thuận, Vũng Tàu…Tuy nhiên, cá ngựa là loài có khả năng đề

kháng yếu, rất dễ nhiễm bệnh do các tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn và
nấm(Vincent và Clifton-Hadley, 1989). Theo báo cáo của Trương Sĩ Kỳ (2000),
bệnh ở cá ngựa con 5 – 30 ngày tuổi thường gặp là do động vật nguyên sinh
Zoothamnium gây ra. Biểu hiện ban đầu là xuất hiện một vài cá thể Zoothamnium ở
đuôi. Sau đó chúng sinh sản thành tập đoàn, phủ đầy đuôi cá ngựa như những sợi
bông gòn làm cho cá mất khả năng bơi lội và kiếm ăn.
Đối với cá trưởng thành, đôi khi thấy xuất hiện bệnh đốm trắng, bệnh phát
sinh do nhiễm Ichthyophthinius mutifiliis. Khi nhiễm bệnh, cá thường xuất hiện các
đốm trắng trên thân và đuôi, cá bơi lội kém linh hoạt, thường ở trên mặt nước. Sau
vài ngày da cá bị phá hủy dần và làm cá chết (Trương Sĩ Kỳ, 2000).
Ngoài các tác nhân nêu trên, cá ngựa có thể bị nhiễm giun tròn, giun dẹp
hoặc các động vật ký sinh bên ngoài như Amyloodinium, Epistylis, Vorticella và
một số vi khuẩn gây bệnh như: Vibrio alginolyticus, V. anguillarius, …(Trương Sĩ
Kỳ, 2000).

14

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản
Bệnh do chi (genus) Vibrio gây ra thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales,
lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Họ Vibrionaceae có 6 chi, trong
đó chi Vibrio gồm nhiều loài gây bệnh nguy hiểm cho người và động vật (Phạm
Hồng Sơn, 2005). Đặc điểm chủ yếu của chi Vibrio là có dạng hình que hoặc hơi
uốn cong như dấu phẩy, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm. Hầu hết các chi Vibrio đều
phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20-40‰. Chúng không hình thành
bào tử (Ryan và Ray, 2004) và di động nhờ tiên mao đơn cực (Thompson và cs.,
2005). Chúng sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, liên
quan đến các động vật biển, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật
biển. Vibrio spp. gây bệnh ở cả hai nhóm động vật thủy sản nước mặn và ngọt: cá,
giáp xác, nhuyễn thể. Những vi khuẩn này có thể là tác nhân chính hoặc tác nhân cơ
hội khi được kết hợp với một hoặc nhiều tác nhân khác. Nguyên nhân đầu tiên của

bệnh chính là các yếu tố môi trường, yếu tố cơ học hay sinh vật ký sinh (như nấm,
virus, kí sinh trùng) gây thương tổn trên bề mặt cơ thể động vật thủy sản nuôi, tạo
điều kiện cho vi khuẩn Vibrio xâm nhập và gây bệnh.
Trong các hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể theo
một số con đường: nguồn nước, dụng cụ sản xuất, từ tôm bố mẹ hoặc tôm giống,
đặc biệt là các loại thức ăn tươi sống như Artemia và có thể chúng đã có sẵn trên
thành bể hoặc trong ao nuôi (Khắc Lâm, 2012).
Bệnh ăn mòn da do một số chủng vi khuẩn gây ra như Vibrio
alginolyticus (Austin và cs., 1995) hoặc Vibrio mediterranei (Huys và cs., 2001)
luôn là mối đe dọa lớn cho nghề nuôi trồng thủy sản.
Các loài trong chi Vibrio là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, hầu hết các loài đều cần
ion Na
+
để sinh trưởng (Madigan và Martinko, 2005). Hầu hết các loài trong chi
Vibrio đều dương tính với phép thử oxidase và catalase, lên men glucose nhưng
không sinh hơi (Baumann và Schubert, 1984). Các vi khuẩn nhạy cảm với môi
trường acid và phát triển tốt nhất ở khoảng pH từ 7,5 - 8,5; chúng bị ức chế ở pH
dưới 6,8 và trên 10,2 (Rujiwat, 2007).
15

Một số loài Vibrio là tác nhân gây bệnh chính trên các loài thủy sản nước
mặn như: Vibrio anguillarum, V. ordalii, V. harveyi, V. splendida, V. orientalis, V.
fischeri… Trong báo cáo của Panchayuthapani (1997), V. alginolyticus, V. costicola,
V. harveyi, V. splendidus, và V. parahaemolyticus là các nguyên nhân chính
gâybệnh cho tôm ở Ấn Độ. V. salmonicida gây bệnh trên cá Hồi (Austin và Austin,
1993) và các loài khác như V. vulnificus, V. alginolyticus, V. splendidus được xem
là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú thương phẩm…. Một số loài vi khuẩn
Vibrio có khả năng phát sáng như V. harveyi, V. splendida, V. orientalis, V. fischeri,
V. vulnificus gây bệnh ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau của tôm với các triệu
chứng như nhiễm trùng, hình thành các u trong một loạt các cơ quan bao gồm tim,

mang, gan tụy, lớp biểu bì, làm giảm sút sản lượng tôm nuôi. Trong đó, V. harveyi
được xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng ở trai ngọc Pinctada maxima, tôm sú
Penaeus monodon (Lavilla-Pitogo và cs., 1990) và tôm he Nhật bản Penaeus
japonicus (Pass và cs., 1987; Lavilla-Pitogo và cs., 1990; Karunasagar và cs., 1994;
Leano và cs., 1998) và cá chẽm Lates calcarifer (Tendencia, 2002). Bệnh do nhóm
vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philipines,
Ấn Độ và Indonesia.
Năm 1998, ở Tây Ban Nha, tác nhân gây chết hàng loạt cá ngựa đen
(Hippocampus kuda) và cá ngựa (Hippocampus sp.) được xác định là có liên quan
đến chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm và theo báo cáo của Alcaide và cs. (2001)
chủng vi khuẩn đó là V. harveyi.
1.3 Mục tiêu của đề tài
1.3.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tại các trại nuôi cá ngựa ở (Ba Làng, Sông Lô – Nha Trang – Khánh Hòa),
tình trạng cá ngựa chết xảy ra càng nhiều và đã được ghi nhận trong thời gian
(8/2012 - 12/2012). Cá bệnh thường có các triệu chứng ban đầu như da nhợt nhạt,
cá bị cong đuôi, biếng ăn, bơi lờ đờ; sau đó xuất hiện các vết lở loét trên da, cổ,
mõm (Hình 1.6 và 1.7).

16


Hình 1.6: Cá ngựa đen (Hippocampus kuda) bị bệnh lở loét.


Hình 1.7: Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus)
bị bạc da và lở loét đuôi.
Với mục đích phân lập và xác định tác nhân gây bệnh lở loét trên cá ngựa
đen (Hippocampus kuda) và cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus). Xác định
khả năng gây bệnh và khả năng nhạy cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi

khuẩn phân lập được. Đồng thời, bổ sung các dữ liệu khoa học, làm cơ sở cho việc
phát triển nghề nuôi trồng thủy sản nước nhà.




17

1.3.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Thu thập mẫu cá ngựa bệnh (cá ngựa đen và cá ngựa gai) tại các trại nuôi ở
Ba Làng và Sông Lô (Nha Trang – Khánh Hòa)
- Phân lập vi khuẩn Vibrio từ mẫu cá ngựa đen (Hippocampus kuda) và cá
ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) bệnh.
- Giám định hình thái và các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Vibrio phân lập được trên cá ngựa đen và cá ngựa gai. Định danh các chủng vi sinh
vật phân lập được dựa trên các test sinh hóa và bước đầu giải trình tự gene 16S
rDNA.
- Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập được bằng cách gây cảm
nhiễm lên cá ngựa đen khỏe.
- Thực hiện kháng sinh đồ cho chủng vi khuẩn phân lập được.