Phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt (Erwinia spp.) trên cà chua nguyên liệu sau thu hoạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



TRẦN THỊ DIÊN


PHÂN LẬP VI KHUẨN GÂY BỆNH THỐI ƯỚT
(ERWINIA SPP.) TRÊN CÀ CHUA
NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH




ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM









Nha Trang - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



TRẦN THỊ DIÊN



PHÂN LẬP VI KHUẨN GÂY BỆNH THỐI ƯỚT
(ERWINIA SPP.) TRÊN CÀ CHUA
NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


Giáo viên hướng dẫn
1. ThS. Phạm Thị Đan Phượng
2. PGS.TS. Trang Sĩ Trung




Nha Trang - 2013

i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt đợt thực tập tốt nghiệp này, tôi đã nhận được nhiều

sự ủng hộ, giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn:
Gia đình đã động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong suốt
những năm con đi học.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Công nghệ Thực
phẩm và các thầy cô giáo đã tận tình dạy dỗ, dìu dắt và truyền đạt cho chúng
em nhiều kiến thức bổ ích.
Cô Phạm Thị Đan Phượng, thầy Trang Sĩ Trung đã tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
Thầy Nguyễn Công Minh, thầy Hoàng Ngọc Cương đã hướng dẫn,
giúp đỡ, hỗ trợ kinh phí cho em trong suốt thời gian làm đề tài.
Cô Nguyễn Minh Nhật (Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường) và
cô Trần Thị Hiền Mai (Khoa Chế biến) đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt
nhất cho em.
Các bạn lớp 51CBTP2 cùng các bạn làm tại phòng Chế biến 3, phòng
Công nghệ Sinh học đã động viên, hỗ trợ tôi trong thời gian làm đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, tháng 6 năm 2013


Trần Thị Diên



ii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về cà chua 3
1.1.1. Giới thiệu về cà chua 3
1.1.2. Thành phần hóa học của cà chua 3
1.1.3. Tác dụng của cà chua 4
1.1.4. Các biến đổi của cà chua sau thu hoạch 5
1.1.5. Các phương pháp bảo quản cà chua 5
1.1.6. Bệnh thối ướt ở cà chua 7
1.2. Vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối ở cà chua 8
1.2.1. Phân loại 8
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn 8
1.2.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu 12
2.1.1. Cà chua 12
2.1.2. Vi khuẩn Erwinia spp 13
2.1.3. Hóa chất, môi trường 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu 13
2.2.1. Phương pháp khảo sát 13

iii
2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 14
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt ở cà chua 15
2.2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quan sát khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 17
2.2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng gây hư hỏng bằng phương pháp
gây bệnh nhân tạo của vi khuẩn gây bệnh thối ướt ở cà chua 20
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1. Kết quả khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua tại các chợ đầu mối ở thành
phố Nha Trang 22
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối ướt trên cà chua sau
thu hoạch và kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn 24
3.3. Kết quả xác định khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn Erwinia spp.
bằng phương pháp gây bệnh nhân tạo 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39








iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Bảng khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua sau thu hoạch tại các
chợ đầu mối ở thành phố Nha Trang 14
Bảng 3.1. Bảng kết quả khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua sau thu
hoạch tại các chợ đầu mối ở thành phố Nha Trang 22
Bảng 3.2. Bảng quan sát đặc điểm khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn 24
Bảng 3.3. Bảng theo dõi khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn Erwinia spp 29

v
DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cà chua bị bệnh thối ướt 8
Hình 2.1. Cà chua dùng để gây bệnh 12
Hình 2.2. Cà chua nguyên liệu bị bệnh thối ướt 12
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 14
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt 15
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quan sát khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn 17
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn 20
Hình 3.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường PGA 25
Hình 3.2. Hình thái tế bào của chủng Er
8
26
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng Er
12

27
Hình 3.4. Hình thái tế bào của chủng Er
13
27
Hình 3.5. Hình thái tế bào của chủng Er
14
27
Hình 3.6. Hình thái tế bào của vi khuẩn Erwinia chrysanthemi 28
Hình 3.7. Cà chua bị bệnh thối ướt do chủng Er
12
gây ra 34
Hình 3.8. Cà chua của chủng Er
12
cắt đôi sau 2 ngày gây bệnh 34
Hình 3.9. Cà chua bị bệnh thối ướt do chủng Er
14
gây ra 34
Hình 3.10. Cà chua của chủng Er
14
cắt đôi sau 4 ngày gây bệnh 35
Hình 3.11. Cà chua đối chứng có tạo vết thương 36
Hình 3.12. Cà chua của chủng ĐC
c
cắt đôi sau 4 ngày gây bệnh 37
Hình 3.13. Cà chua đối chứng không tạo vết thương 37
Hình 3.14. Cà chua của chủng Đc
k
cắt đôi sau 4 ngày gây bệnh 37

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PGA : Potato Glucose Agar
DNA : Deoxyribonucleic acid
PCR : Polymerase Chain Reaction
µl : microlít
µm : micromét
ml : mililít
g : gam
h : giờ
Er
1
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 1
Er
2
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 2
Er
3
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 3
Er
4
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 4
Er
5
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 5
Er
6
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 6
Er
7
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 7

Er
8
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 8
Er
9
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 9
Er
10
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 10
Er
11
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 11
Er
12
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 12
Er
13
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 13
Er
14
: ký hiệu chủng vi khuẩn thứ 14

ĐC
c
: ký hiệu mẫu đối chứng có vết rạch
ĐC
k
: ký hiệu mẫu đối chứng không có vết rạch

1
LỜI MỞ ĐẦU

Rau quả ở nước ta vô cùng phong phú và đa dạng, có nhiều loại rau quả
có giá trị kinh tế cao được xuất khẩu sang nhiều nước. Vấn đề bảo quản rau
quả sau thu hoạch ngày càng được chú trọng để tránh làm giảm giá trị dinh
dưỡng, đảm bảo được chất lượng, đảm bảo an toàn thực phẩm, đặc biệt là các
bệnh đến từ rau quả. Rau quả sau thu hoạch thì vẫn tiếp tục hô hấp, phân giải
các chất, mất nước và giảm khối lượng. Ngoài ra, hầu hết rau quả có cấu trúc
tương đối mềm, hàm lượng nước cao nên dễ bị trầy xước, chảy dịch làm cho
rau quả rất dễ bị hư hỏng. Thế nên, mỗi loại rau quả cần phải có phương pháp
bảo quản hợp lý.
Cà chua cũng là loại rau ăn quả dễ bị hư hỏng nếu không có biện pháp
thu, hái, vận chuyển, bày bán và bảo quản phù hợp. Cà chua là loại quả mọng,
vỏ mỏng, thịt quả chứa nhiều thành phần dinh dưỡng, hàm lượng nước cao
nên khi bị dập nát, chảy dịch thì dịch cà chua sẽ là môi trường tốt cho vi sinh
vật gây hư hỏng phát triển. Một số loài vi sinh vật thường gặp là nấm mốc, vi
khuẩn gây thối trong đó có vi khuẩn Erwinia spp. Vi khuẩn Erwinia làm quả
cà chua bị dập nát, tổn thương bề mặt trở nên mềm nhũn, có mùi hôi, gây ra
bệnh thối ướt trên cà chua. Theo khảo sát tại các chợ đầu mối ở Nha Trang thì
tỷ lệ cà chua bị mắc bệnh thối ướt khá cao, chiếm từ 5,8 – 6,7%. Khi vi khuẩn
Erwinia có mặt trên một lô hàng thì không những gây bệnh cho các quả cà
chua bị dập nát mà còn làm hư hỏng các quả khác trong lô hàng do quá trình
lây nhiễm chéo. Hiện nay có nhiều nghiên cứu về bệnh thối ướt trên các loài
thực vật khác nhau như khoai tây, bắp cải, cà rốt, hành tây, củ cải đường và
nhiều cây trồng khác [19], [37]. Vì vậy, đề tài: “Phân lập vi khuẩn gây bệnh
thối ướt (Erwinia spp.) trên cà chua nguyên liệu sau thu hoạch” sẽ mở ra

2
hướng đi khác trong nghiên cứu bệnh thối ướt do vi khuẩn Erwinia gây ra trên

cây trồng, đó chính là cà chua.
Đề tài gồm một số nội dung sau:
- Tìm hiểu về bệnh thối ướt trên cà chua sau thu hoạch, về vi khuẩn Erwinia spp.
- Khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua tại các chợ đầu mối ở thành phố
Nha Trang.
- Phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt (Erwinia spp.) trên cà chua sau
thu hoạch.
- Xác định hình thái và đặc điểm tế bào của một số chủng vi khuẩn gây bệnh.
- Xác định khả năng gây hư hỏng của vi khuẩn bằng phương pháp gây bệnh
nhân tạo.
Tuy đã cố gắng rất nhiều nhưng trong quá trình thực hiện vẫn còn thiếu sót,
rất mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô, bạn bè để đề tài này hoàn chỉnh hơn.














3
Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cà chua

1.1.1. Giới thiệu về cà chua
Cà chua đem lại cho con người một nguồn dồi dào các vitamin như
vitamin C, vitamin A, vitamin K, vitamin B cùng một số chất khoáng như K,
Mg, Cr, Cu, Fe, protein và chất xơ. Đặc biệt trong cà chua có 4 loại caroten là
α-caroten, β-caroten, lutein, lycopen.
Cà chua là loại rau ăn quả thuộc họ cà Solanaceae, có nguồn gốc từ Nam Mỹ.
Cà chua có tên tiếng anh là tomato và tên khoa học là Lycopersincon esculetum [26].
1.1.2. Thành phần hóa học của cà chua
1. Glucid
Hàm lượng glucid trong cà chua khoảng chiếm 4-8% [4], [33], bao gồm:
- Đường chiếm 2-5%, phần lớn là glucose, fructose, saccharose chiếm
rất ít khoảng 0,5%.
- Tinh bột chỉ ở dạng vết khoảng 0,07 - 0,26%, trong quá trình chín,
tinh bột sẽ chuyển thành đường.
- Cenllulose có nhiều trong quả xanh, chiếm khoảng 0,8 %, càng chín,
hàm lượng càng giảm dần.
2. Độ acid
Độ acid chung của cà chua khoảng 0,4% (theo acid malic). Độ acid
hoạt động trong khoảng pH = 3,1 - 4,1. Ngoài ra còn có acid citric và lượng
nhỏ acid tatric [4], [33]. Khi cà chua còn xanh, acid ở dạng tự do, khi chín
acid ở dạng muối.
3. Chất khoáng
Chất khoáng trong cà chua chiếm khoảng 0,4%, gồm một số chất
khoáng như canxi, photpho, sắt, magie [4], [12], [33].

4
4. Glucozit
Cà chua thường có vị hăng là do chứa glucozit solanin.
- Cà chua xanh có hàm lượng solanin khoảng 4%.
- Cà chua ửng có hàm lượng solanin khoảng 5%.

- Cà chua chín có hàm lượng solanin khoảng 8%.
5. Sắc tố
Trong cà chua có nhóm sắc tố thuộc nhóm carotenoid như: caroten,
lycopen, xantophyl. Quả cà chua xanh còn có chlorophyll. Tùy theo mức độ
chín mà sắc tố tăng dần nên màu của quả đậm hơn.
6. Vitamin
Trong cà chua chứa nhiều vitamin [4], [12], [33], gồm có:
- Vitamin C chiếm khoảng 20 – 40 (mg%).
- Vitamin B
1
chiếm khoảng 0,08 – 0,15 (mg%).
- Vitamin B
2
chiếm khoảng 0,05 – 0,07 (mg%).
- Vitamin PP chiếm khoảng 0,5 – 16,5 (mg%).
1.1.3. Tác dụng của cà chua
Trong cà chua có sắc tố lycopen cùng với caroten vừa ngăn chặn tế bào
ung thư vừa chống sự hình thành các cục máu đông trong thành mạch nên
giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, chống lại các bệnh thoái hóa thần kinh và
bệnh liên quan đến tiểu đường. Lycopen được xem là chất chống oxy hóa
mạnh, có khả năng hóa giải các gốc tự do, ngăn chặn tế bào ung thư [3], [33].
Cà chua chứa vitamin C, B
1
, B
6
, PP, lycopen, β-caroten, chất khoáng
dễ hấp thu, giúp cho cơ thể tăng cường khả năng miễn dịch, phòng chống
nhiễm trùng [4], [10], [33]. Ngoài ra trong cà chua, hàm lượng đạm, đường,
chất béo có rất ít nên cà chua được xem là một loại thực phẩm nghèo năng
lượng (khoảng 35 calorie [33]) dành cho người béo phì. Cà chua có tính bình,

5
vị chua, hơi ngọt, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, chống khát nước, giúp
thông tiểu tiện và tiêu hóa tốt [3], [4], [33].
Cà chua còn là loại rau ăn quả thường được sử dụng để tạo vị ngon và
màu sắc hấp dẫn cho món ăn, thức uống. Cà chua ăn tươi, làm nước ép thì
không bị mất vitamin C nhưng khi nấu lại làm tăng khả năng hấp thu lycopen
và β-caroten [3], [33].
1.1.4. Các biến đổi của cà chua sau thu hoạch
Cà chua chứa nhiều loại vitamin, đường, chất khoáng, thịt quả chứa
nhiều dịch bào là môi trường giàu dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn sinh
sống và phát triển. Hàm lượng nước trong cà chua rất nhiều khoảng 90 - 95%
[4], [34]. Cấu trúc của cà chua lại mềm, vỏ mỏng nên dễ bị xây xước, dập nát
tạo điều kiện vi sinh vật dễ xâm nhập và gây hư hỏng quả. Trong quá trình
bảo quản các quá trình sinh lý, sinh hóa vẫn diễn ra, phân giải đường, vitamin
làm giảm chất lượng cà chua tạo điều kiện cho vi sinh vật có hại phát triển
[4], [12], [33]. Tuy cà chua dễ bị giảm chất lượng sau khi thu hoạch nhưng
khi áp dụng các biện pháp bảo quản thích hợp thì sẽ không những kéo dài
được thời gian sử dụng mà còn giúp cho cà chua giữ nguyên chất lượng, đảm
bảo được an toàn vệ sinh thực phẩm.
1.1.5. Các phương pháp bảo quản cà chua
Tùy vào độ chín của cà chua, vào mục đích sử dụng mà có phương
pháp bảo quản cà chua hợp lý.
Khi bảo quản cà chua xanh thì cần giữ ở nhiệt độ 10
o
C, độ ẩm khoảng
80 – 90%, thời gian bảo quản được 4 – 6 tháng.
Cà chua vừa chín tới được bảo quản ở nhiệt độ thường không quá 2 ngày.
Cà chua chín đỏ, mềm được bảo quản 2
o

C – 3
o
C trong 1 ngày.
Khi bảo quản cà chua trong kho, yêu cầu của kho cần thoáng, sạch sẽ,
cao ráo, nên sử dụng kho lạnh để bảo quản cà chua trong thời gian dài.

6
Một số cách bảo quản cà chua:
1. Bảo quản ở nhiệt độ thường
Cà chua sau khi thu hoạch có thể đưa vào phòng mát, thoáng khí và có
độ ẩm thích hợp. Bảo quản ở nhiệt độ thường nhằm kéo dài mức độ tươi của
cà chua trước khi đưa vào chế biến, tiêu thụ [4], [10], [12].
2. Bảo quản lạnh
Cà chua nên bảo quản lạnh dưới 16
o
C [33] để giảm hư hỏng và ngăn
quá trình giảm chất lượng. Đây là cách bảo quản phổ biến nhất [4], [10], [12],
[33].
3. Bảo quản cà chua trong môi trường không khí thay đổi
Bảo quản trong môi trường không khí thay đổi là bao cà chua trong
các vật liệu chắn khí, trong đó môi trường khí được thay đổi để ức chế tác
nhân gây hư hỏng, nhờ đó có thể duy trì chất lượng và kéo dài thời hạn sử
dụng. Bảo quản bằng phương pháp này có thể kéo dài thời gian bảo quản của
cà chua từ 15 đến 20 ngày ở nhiệt độ từ 10 – 20
o
C, ở nhiệt độ thường có thể
bảo quản khoảng từ 3 đến 4 ngày [4], [10], [12], [33].
Có 2 phương pháp bảo quản đó là bảo quản trong túi màng mỏng và tạo
màng:
- Phương pháp bảo quản trong túi màng mỏng: Rau quả được đựng

trong túi màng mỏng có tính thẩm thấu chọn lọc. Rau quả được xử lý rồi đóng
gói trong các túi màng mỏng có đục lỗ thích hợp và bảo quản trong kho mát.
- Bảo quản bằng phương pháp tạo màng: Lớp màng mỏng được phủ
trên bề mặt rau quả để thay thế lớp sáp bảo vệ tự nhiên, giảm quá trình hô
hấp, cản trở sự bốc hơi nước, làm chậm quá trình chín đảm bảo trao đổi khí ở
mức cần thiết.

7
1.1.6. Bệnh thối ướt ở cà chua
Cà chua chứa nhiều vi sinh vật có nguồn gốc từ đất, nước, không khí.
Các vi sinh vật này sinh trưởng rất nhanh trong các quả cà chua bị trầy xước,
dập nát và gây ra bệnh thối ướt. Một số vi sinh vật thường gây bệnh thối ướt ở
cà chua là Rhizopus nigricans, Fusarium, Aspergillus niger, Clostridium,
Pseudomonas, Erwinia [27], [29], [37]. Cà chua khi bị bệnh thối ướt sẽ mất
giá trị dinh dưỡng và mùi vị đặc trưng, giảm chất lượng nhanh chóng [12].
Bệnh thối ướt do vi khuẩn Erwinia spp. gây hại với các triệu chứng như
thối nhũn một phần hoặc cả quả cà chua, có mùi thối, màu sắc biến đổi, vỏ
nhăn [12], [25]. Các triệu chứng trên sẽ phát triển nhanh chóng khi nhiệt độ
và độ ẩm cao. Bệnh thối ướt là loại bệnh phổ biến và gây thiệt nghiêm trọng
đối với cà chua trong quá trình bảo quản, cất giữ, chuyên chở và xuất nhập
khẩu. Nếu không phát hiện và cách ly kịp thời những quả bị hỏng thì dễ làm
lây nhiễm sang các quả nguyên khác, gây tổn thất cả lô hàng.
Bệnh thối ướt có thể phát sinh ngay từ khi cà chua mới thu hoạch và
kéo dài trong thời gian bảo quản. Bệnh ít xảy ra ở tháng 1 đến tháng 3 bởi vì
giai đoạn này nhiệt độ thấp không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhiễm gây
bệnh. Bệnh thối ướt quả cà chua phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao
và ẩm độ cao nên trong những tháng mùa hè bệnh thối ướt phát triển mạnh
nhất, cao điểm của bệnh vào các tháng 6, tháng 7, tháng 8. Bệnh tiếp tục phát
sinh gây hại và mức độ bệnh giảm dần vào những tháng 10, 11, 12 khi điều kiện
ngoại cảnh không thuận lợi cho vi khuẩn gây thối ướt [24], [28], [30].

Trong quá trình bảo quản trong kho, bệnh thối ướt có thể phát sinh
nhưng mức độ bị bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó yếu
tố nhiệt độ, độ ẩm và chất lượng cà chua giữ vai trò quyết định. Khi bề mặt
quả bị ẩm, không khí trong kho lưu thông kém hoặc bề mặt quả bị tổn thương
thì vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây hư hỏng.

8

Hình 1.1. Cà chua bị bệnh thối ướt
1.2. Vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối ở cà chua
1.2.1. Phân loại
Vi khuẩn Erwinia spp. thuộc:
Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Phylum) : Proteobacteria
Lớp (Class) : Gamma-Proteobacteria
Bộ (Order) : Enterobacteriales
Họ (Family) : Enterobacteriaceae
Giống (Genus) : Erwinia
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn
Erwinia là loài vi khuẩn có họ hàng với Enterobacteriaceae, được chia
thành hai nhóm: nhóm gây bệnh thối mềm và nhóm gây bệnh héo ở cây trồng
[5]. Chi Erwinia bao gồm chủ yếu là các loài vi khuẩn gây bệnh thực vật,
được gọi tên theo nhà vi khuẩn thực vật học đầu tiên là Erwin Frink Smith. Vi
khuẩn Erwinia có 3 loài là amylovora, herbicola và carotovora. Trong đó có
một số vi khuẩn thường gặp là Erwinia carotovora ssp. carotovora, Erwinia
carotovora ssp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi [23], [32], [34], [38]. Đây
là chi vi khuẩn Gram âm có quan hệ gần với Escherichia coli, Shigella,
Salmonella và Yersinia [1], [24], [37].

9

Vi khuẩn Erwinia spp. có tế bào dạng hình que, kích thước khoảng từ
1-2 micromet, đứng đơn, thành cặp hoặc chuỗi ngắn, hai đầu hơi tròn, có 2 - 8
lông roi bao quanh mình, di động, kỵ khí không bắt buộc, không sinh bào tử,
sinh trưởng tối ưu ở 30
o
C [5], [18], [38]. Nuôi cấy trên môi trường pepton
saccarose, khoai tây, agar khuẩn lạc có màu trắng xám, hình tròn, bề mặt
khuẩn lạc ướt.
Vi khuẩn phát triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng từ 20
o
C –
38
o
C [19], [25]. Nhiệt độ thích hợp nhất là 27
o
C – 32
o
C, nhiệt độ tới hạn chết
là 50
o
C; phạm vi pH cũng khá rộng từ pH = 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH =
7,2. Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô và dưới ánh nắng.
Vi khuẩn Erwinia spp. phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới lẫn ôn đới
[28]. Vi khuẩn được tìm thấy trong đất, nước, trên bề mặt cây, trong các dụng
cụ chứa đựng và các thiết bị [22]. Vi khuẩn gây bệnh ở nhiều loại cây khác
nhau như khoai tây, bắp cải, hành, tiêu, dưa leo [19], [37] do có khả năng sản
xuất ra các enzyme như pectinmethylesterase, polygalacturonase, pectinlyase,
một vài isoenzyme của pectatelyase, endoglucanase và protease. Các emzyme
này phá vỡ thành tế bào thực vật, làm các chất dinh dưỡng thoát ra tạo môi
trường tốt cho vi khuẩn sinh sống phát triển [16], [18], [31], [36], [38].

Endoglucanase có khả năng phá vỡ cellulose trong thành tế bào của cây chủ.
Pectinase có khả năng phân hủy pectin trong thành tế bào thực vật, gây tổn
thương tế bào và làm mô bị mềm nhũn [8], [18], [24], [31].
Vi khuẩn thường xâm nhập vào thực vật thông qua lỗ tự nhiên như khí
khổng, lỗ vỏ, thân, rễ hoặc qua các vết thương do xây xước, côn trùng [18].
Khi vi khuẩn xâm nhập vào vết thương của quả cà chua, chúng sẽ sinh trưởng
và nhân lên, sản sinh ra các enzyme phá vỡ thành tế bào, làm mềm mô và
chảy dịch. Dịch bào chảy ra lại cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát
triển. Vi khuẩn tiếp tục di chuyển, tiết ra emzyme và gây thối nhũn quả cà

10
chua. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia spp. phụ thuộc 3 yếu tố: độc
lực, số lượng vi khuẩn và đường xâm nhập [6], [7], [13]. Độc lực của vi
khuẩn là năng lực gây bệnh của vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn ban đầu phải đủ
lớn thì mới có khả năng gây bệnh. Cuối cùng, vi khuẩn phải xâm nhập đúng
con đường và đường xâm nhập phải thích hợp như vết thương, chỗ dập nát
trên quả.
Một số vi khuẩn gây bệnh cho người như Salmonela, Shigella,
Escherichia, Listeria có thể tồn tại trên bề mặt quả cà chua tươi và chúng có
thể nhân lên trong điều kiện thích hợp [24], [27], [37]. Khi vi khuẩn Erwinia
spp. bắt đầu gây bệnh thối ướt thì sẽ làm pH tăng nhẹ, tạo điều kiện thuận cho
một số vi khuẩn gây bệnh thực phẩm hoạt động như Salmonela, Shigella [1],
[18], [19]. Các quả cà chua bị bệnh thối ướt còn có một số loài nấm sẽ sinh
sống và phát triển, trong đó có nấm mốc. Nấm mốc có trong quả cà chua sẽ
sinh ra một số độc tố có hại cho cơ thể con người. Vì vậy, để đảm bảo an toàn
thực phẩm thì cần loại bỏ những quả đã hư, mềm nhũn, chảy dịch, có mùi thối
nhằm tránh lây lan bệnh thối ướt cho các quả tươi và ngăn chặn khả năng
nhiễm bệnh từ thực phẩm.
1.2.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia spp.
Trên thế giới:

Có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia spp. và bệnh thối
ướt trên các loài thực vật khác nhau. Perombelon (1987) [28] tìm hiểu về
bệnh thối ướt trên khoai tây ở Scotland và Israel. Helias và cộng sự (2000)
[23] đã nghiên cứu các triệu chứng gây bởi Erwinia carotovora subsp
atroseptica ở khoai tây và các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất. Fiori và
Schiaffino (2003) [20] nghiên cứu vi khuẩn Erwinia carotovora subsp
carotovora gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu tại các nhà kính ở Sardinia,
Italia. Amodu (2006) [15] nghiên cứu về bệnh thối củ gây ra bởi vi khuẩn

11
Erwinia spp. Jennifer (2005) [23] nghiên cứu về sự có mặt của Salmonella và
Shigella trên cà chua bị bệnh thối ướt gây ra bởi vi khuẩn Erwinia
carotovora. Các nghiên cứu trên đã cho thấy, vi khuẩn Erwinia spp. là nguyên
nhân gây ra bệnh thối ướt ở thực vật. Bệnh thối ướt đã gây thiệt hại lớn đến
cây trồng và thu nhập nông dân. Bệnh thối ướt chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu
tố, đặc biệt là nhiệt độ và độ ẩm. Vì vậy khi bảo quản cần điều chỉnh nhiệt độ
và độ ẩm cho hợp lý. Ngoài ra, trong bản thân mỗi cây chủ có những chất
kháng khuẩn nên làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn Erwinia. Tại mỗi vết
bệnh, ngoài vi khuẩn gây bệnh thối ướt thì còn có các vi khuẩn thứ sinh khác,
chúng cạnh tranh lẫn nhau để sinh tồn. De Boer (1979) [17] nghiên cứu sự có
mặt của Erwinia carotovora trong đất. Schober (1999) [34] tìm hiểu về mối
quan hệ giữa nước và nhiệt độ đến sự phát triển và gây bệnh của Erwinia spp.
Từ các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Erwinia spp. có mặt ở mọi nơi từ đất,
nước, không khí, trên cây và dụng cụ, thiết bị. Ngoài ra, các nghiên cứu trên
cũng đề cập đến các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tồn của vi khuẩn,
các đặc tính sinh trưởng, hình thái khuẩn lạc, tế bào và DNA của chi Erwinia
spp.
Tại Việt Nam:
Anh (2009) [1] đã xác định và đánh giá bệnh thối nhũn trên cây lan do
vi khuẩn Erwinia spp. gây ra tại thành phố Hồ Chí Minh. Hà (2006) [5] phát

hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan bằng
phương pháp PCR. Hai nghiên cứu trên cho thấy vi khuẩn Erwinia spp. là
nguyên nhân gây bệnh thối ướt cho cây cảnh. Ngoài ra, các nghiên cứu còn
chỉ ra hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia spp. trên mỗi môi trường
nuôi cấy.


12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Cà chua
Cà chua dùng để gây bệnh: Quả có màu đỏ tươi, vỏ căng bóng, mùi cà
chua đặc trưng, tỷ lệ thịt quả nhiều, cấu trúc cứng. Cà chua nguyên liệu được
mua tại chợ Đầm – Nha Trang, được thu, hái, vận chuyển từ Đà Lạt.

Hình 2.1. Cà chua dùng để gây bệnh
Cà chua bị bệnh: Quả có màu đỏ, trên bề mặt quả vỏ bị nứt, có vết nhũn
mềm, có thể xuất hiện nấm mốc và bị chảy dịch. Quả cà chua được lấy tại chợ
Đầm- Nha Trang, được thu, hái, vận chuyển từ Đà Lạt.

Hình 2.2. Cà chua nguyên liệu bị bệnh thối ướt

13
2.1.2. Vi khuẩn Erwinia spp.
Các chủng vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh trên cà chua sau thu hoạch.
2.1.3. Hóa chất, môi trường
Môi trường PGA
- Khoai tây : 200g
- Glucose : 20g

- Agar : 20g
- Nước cất : 1000ml
Hóa chất
Hóa chất dùng trong nhuộm tế bào:
-Dung dịch xanh methylene.
- Dung dịch tím tinh thể.
- Dung dịch lugol.
- Ethanol 95%.
- Dung dịch safranin.
Hóa chất dùng trong cấy:
- Cồn 96
o
.
- Cồn 70
o
.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp khảo sát
Tiến hành khảo sát trực tiếp tại các cơ sở thu mua nông sản ở thành phố
Nha Trang. Mỗi chợ đầu mối sẽ thu thập số liệu của 3 quầy hàng. Tổng số
lượng cà chua, tổng sản phẩm bị hư hỏng và tổng sản phẩm bị bệnh thối ướt
là tổng của 3 quầy hàng. Phiếu thu nhận kết quả khảo sát bệnh thối ướt trên cà
chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối ở thành phố Nha Trang được trình bày
theo Bảng 2.1.

14
Bảng 2.1. Bảng khảo sát bệnh thối ướt trên cà chua sau thu hoạch tại các
chợ đầu mối ở thành phố Nha Trang
Địa điểm

Định kỳ
nhập cà
chua
(ngày)
Thời
gian
lưu trữ
(ngày)
Đi
ều kiện
bảo quản

Tổng sản
lượng
(kg)
Sản phẩm
bị hỏng
(kg)
Sản phẩm
hỏng do
thối ướt
(kg)





2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thuyết minh quy trình
- Cà chua bị bệnh được lấy từ chợ Đầm – Nha Trang.
- Sau đó tiến hành phân lập và giữ chủng.
- Bước tiếp theo là quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào.
Vi khuẩn Erwinia spp.

Quan sát khuẩn
lạc và tế bào
Đánh giá khả năng gây
bệnh của vi khuẩn
Phân lập
Giữ chủng
vi khuẩn
Gây bệnh
nhân tạo
Cà chua
không bệnh
Cà chua bị bệnh

15

- Tiến hành bào gây bệnh nhân tạo và theo dõi diễn biến của bệnh.
- Xác định chủng vi khuẩn Erwinia spp.
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt ở cà chua























Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh thối ướt
Rửa cồn 70
o

Cân 10g mẫu
b
ệnh

100ml nước
cất vô trùng
Pha loãng
Cấy trang trên môi
trư
ờng PGA

Môi trường
PGA

Ủ (37
o
C, 24h)
Cấy ria trên môi
trư
ờng PGA

Môi trư
ờng PGA

Cấy ria trong ống nghiệm
Môi trường
PGA

Ủ (37
o
C, 24h)

10
-
5

10
-
4

10
-
3

Cà chua b
ị bệnh

C
ồn 70
o

Ủ (24h)
Ủ (37
o
C, 24h)


16

Phân lập là khâu quan trọng trọng trong quá trình nghiên cứu vi khuẩn.
Mục đích của phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo
thành các khuẩn lạc thuần khiết để khảo sát đặc tính tăng trưởng, biến dưỡng,
sinh hóa và định danh. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi
trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc mang tính
đặc trưng của từng loài vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách
rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn [2], [9],
[14].
Thuyết minh quy trình
- Chọn những quả cà chua bị dập nát, mềm nhũn, chảy dịch, có mùi thối.
- Rửa bằng cồn 70
o
để loại bỏ bụi, đất, vi khuẩn và nấm trên bề mặt quả
cà chua.
- Để cà chua ở điều kiện thường 24 giờ.
- Lấy mẫu bệnh và cân 10g, hòa với 100ml nước cất vô trùng.
- Pha loãng thành các nồng độ 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
.
- Cho môi trường PGA đã thanh trùng vào đĩa petri vô trùng, chiều cao
lớp thạch khoảng 1/3 chiều cao của đĩa.
- Tiến hành cấy trang
Ứng với mỗi nồng độ, lắc đều mẫu và dùng pipet vô trùng lấy chính
xác 0,1ml dịch mẫu đưa lên bề mặt môi trường thạch trong đĩa petri.
Nhúng đầu que cấy trang vào cồn 96
o

, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử
trùng và cháy hết cồn ở đầu que cấy. Để đầu que cấy trang nguội trong không
gian vô trùng của ngọn lửa.
Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que cấy lên bề mặt thạch của đĩa petri.
Dùng đầu que cấy trải đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch.
- Sau khi cấy xong, chờ bề mặt thạch khô, tiến hành bao gói, lật ngược
đĩa, ủ ở 37
o
C, thời gian 24 giờ.
- Cấy ria trên đĩa chứa môi trường PGA.
Dùng que cấy ria đã vô trùng gạt lấy một ít khuẩn lạc trên bề mặt thạch.

17
Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi
đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện
đường ria tiếp theo.
- Tiến hành bao gói, lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ 37
o
C và thời gian 24 giờ.
- Hơ que cấy ria đã vô trùng qua ngọn lửa đèn cồn, để nguội rồi gạt lấy
một ít khuẩn lạc trên bề mặt thạch. Đặt nhẹ đầu que cấy chứa vi khuẩn lên bề
mặt môi trường ở đáy ống, sau đó cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm
lên đến đầu trên của mặt thạch nghiêng.
- Sau khi cấy xong đặt các ống nghiệm vào giá đỡ rồi đem ủ ở 37
o
C
trong 24 giờ.
2.2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quan sát khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quan sát khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
Xử lý sơ bộ
Cấy trang

Môi trường
PGA
Ủ (37
o
C, 24h)
C
ấy ria

Môi trường PGA
Ủ (37
o
C, 24h)

Cấy ria trong ống nghiệm
Môi trường
PGA
Ủ (37
o
C, 24h)
Cà chua bị bệnh
Quan sát khuẩn lạc

Quan sát tế bào vi khuẩn
Nhuộm đơn
Nhuộm gram