ách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài Endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
Tên để tài:
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH
VẢ NGHIÊN CỨU TĨNH CHAT MỘT VẢI
ENDONUCLEAZA GIỚI HẠN TÙ'CÁC NGUổN
VI SINH VẬT CỦA VIỆT NAM
* *
Mã s ô : QG. 97.10
Cliiì trì đề tài: P(iS. TS. Nguyền Ván Mũi
ĩIà nôi, tháng; 1 -2000
ĐẠI HỌC QUÔC GIA HA NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH
VÀ NGHỈÈN CỨU TỈNH CHẤT MỘT VÀI
ENDONUCLEAZA GIỚI HẠN TỪ CÁC NGUỚN
VI SÍNH VẬT CỦA VIỆT NAM
í •
MÃ s ố : ọ c. 97.10
Chủ í rì dể tài: PGS. TS. Nguvễn Vã II Mùi
Các cán bộ than ỉ gia:
GS. TSKH. Nguyễn Đình Quyến
TS. Phan Tuân Nghĩa
TS. Vũ Thị Minh Đức
IliS. Ta niị Bình
CN. Phạm Hài Yen
CN. Niỉiiycn Tliị Bích Liên
ỉ là nội, tháng j -2í )(}{>
M Ờ 7 ® d L / H Ơ Q l
ĐỔ hoàn thành đề tài nghiên cứu này, cluing lỏi xin cliíìn thành cám ƠI1 Ran
Giám Đốc, Ban Khoahọc Công nghệ - Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Ban Ciiám

Hiệu, Phòng KHCN-SĐH, Phòng Tài Vụ trường Đại Học Khoa I lọc Tự Nhiên.
Ban chú nhiệm khoa, các bộ môn Irong khoa Sinh học- đăc biệt các cán hò cùa
các hộ moil I loá Sinh, Vi sinh và Di truyền đã giúp đỡ cluing tỏi vồ mọi mãi.
Chủ nhiệm dề tài
PGS. 1 s Q ĩtỊiiụễiỉ '(h h i /Nài
BÁO CẢO TÓM TẮT
Các entlonucleaza giới hạn có khả năng phân fill các phíìn lư \I)N (t
những Irình tự đặc hiệu. Vì vậy I1Ó líi “công cụ" dặc biệt cho sinh l)'K I'lifnt
lư và cóng nghệ sinh học. Hiện tại đã có 400 loại eii7.ini giói h;in tin ítirợc
tinh sạch trong số hàng ngàn loại (liíiíc phái hiện.
Các en/im giới hạn có mặt ớ nhiều loài vi khnắn, hơn nữa IIƯOX \i\ i;ii
(l;i tlạng về cá c loài vi sinh vậi. cluin g là n g u ồn e n /im giới hail i;ti fill ('lie
pliìí. Vì vây cluing lôi licn hành (.liều tra, lách chiél \ a linh sạch mo( \;ii
í.’i!7Ìm gif'ii liỊìii có trong một sô' vi .sinh vậl pliAn lập (Itioc, (V Việt nam. Cóng
II ình (tược thực hiện trong 2 năm từ tháng 7-1997 lie’ll tin'll!” 7 1 hu
chiực niỏt SỔ kcl quá:
- 'í rong. 5 chúng vi khuẩn phAn lập được, dã pluíl liiỌn <!ư<v I C/Ì1H nu
có enzim giới hạn và có hoạt tính rất cao (chiếm tỷ lệ 1/5). Tioiiịi 13 cliiMiu
xạ khuẩn, có 2 chúng có biểu hiện có enzim giới hạn (chiếm lý lệ I/C'I.
Biizim giói hạn của chùng vi khuẩn xác clỊnli (lược là Mac III. nin!
Inại Cell phân lư AD N X cho (lầu hằng (c1À 11 (ii).
- Đệm chiêl enzim Hat' III ciìtt fillin g vi khuẩn này có pl 1 kltíì tu
5,5-8,0 vii bị lie ch ố ớ nồng (lộ muỏi NaCI 0,2M.
Khi SU'đụng cột sắc ký ;ìi lực Heparin scplumva CL-hB. cn/nn ll;ir
III dil'o'c lách klióị CÓI lọc ỉid Scphacryl S.200. en/im Hat’ III (lum I;kh i;i
CỊHÍI CÒI sác ký .I’iii'a dính I và (lính N.
'lai s;ic ký trên CỘI trao dổi ion DEAE-xcnltil(v;i. C'ii/im I l;ic III
(•1111» (lil'n'c lách i;i khỏi cột (V nồng (lộ muối NaCI 0.15-0.2M.
- Ụuu Ikiì In rức sắc ký: sầc ký lọc gel Sepliam/a S.200 Víi !;Í1 s;i< |,Y
tiên llcpaiin Si'|>]iaroza CX-6Ị} cn/im Hac ill có clò Siich c;m VỈI r<' Ill'll”

lining khoíiim (>0 kỊ)a.
- Điổi! kiện phán ứng thích hợp cho enzim Hac III eLU) chum: vi UtiiMii
Iiíty 1Ỉ1 (ỈỌm NIĨR2, ioil MíV + và ờ nhiệt độ 37°c
( ) mọi chủng xạ kliufin cung (iã phát liièn ró rn/im íỉiiii h;m
< 'hung \ọ liiin i! 18 (.0 l!iC là Sítcll (cn /in i c:H A D N À I;||> ff;ìM VI l<") V.I
V !"'mg .\ạ kfiu;:m 20 Ihô tìi Xíin I iar/,im cat /M)N lan drill sole).
í o (bu IrJ <k' f:ii ( lui Iihlém il(' f;ii
( ’«> (ịtííin (ỊHÓn ly dế Ini
SUMMARY
Restriction cndonucleases can cleave DNA molecules at specific scquenccs.
Il is therefore a useful tool for molecular biology and biotechnology. At
present, about 400 restriction enzymes have been purified from thousands of
isolated ones.
Restriction enzymes are present in many bacteria and in our counfrv. I here
has been a variety of micro-organisms which then becomc a plentiful MHitt c
of restriction endonucleases. Tims we investigate, isolate and puril'v scvciiil
restriction enzymes from a small number of micro-organisms isolated ill
Vietnam. TTiis project has been carried out for 2 years from 7-1997 to
7-1999 and following results are obtained:
- One strain containing restriction enzyme with a very high ;u livily
has been found within 5 isolated baclerial strains, which coiislitiiles a ratio
of 1/5. Among 13 investigated Streplomyces strains, 2 strains arc probably
found to contain restriction enzymes (a ratio of about 1/6).
- The above restriction enzyme is determined to be Hac III. an
enzyme cleaves X DNA lo give blunt ends,
- The extracting buffer of this bacterial strain has a wide pll range.
Imm 5.5 !o 8.0 and is inhibited al a NaCl conccntralion of 0.3M.
- When purifying through ion-exchange column DEAR-( cllulose.
line ill is eluted at 0 2M NaCI.
Mae II! is purified by affinity column Scphanw CL-6B Heparin. Il

is I hen scparaícd from I h is column iiy 0.Ị5M-0.2M Nil Cl. I'll is chi’iiR (crises
like ion exchange spccies.
H ae 111 is elu ted b etw een peak 1 and 2 after running thmiiL’h lilt'
Sc ph aery I s.200 fiel filtration column.
- Ilae III is also eluted at 0.15-Ơ.2M NaCl by a second alTinity
Sepharosc CL-6B Heparin column.
- After Ivvo-step chromatography including Sc ph a rose s. 2 no gel
lillralion and Scphamsc CL-6B Heparin column. Mac in is highly purified
willi a molccular weight olaboul 90 kDa.
- Read Min conditions of I lac III are NEB2 rt’iiclinn bill let, Mj: 1 inn
rtiu! ÍI lemperaturc of 37°c.
- Rcstriclion enzymes are also present in some Strrptomyccs siiains.
These enzymes of strains No. I 8 could be Sac II (enzyme cuts ). I)NA In
• give cohcsivc cuds) and that of strains No.20 could be Xho I (cn/ymc
clea ve s Ằ D N A lo g iv e co licsiv e en ds t o o )
Co-ordinnfor of Project
- 1 -
MỞ ĐẦU
Từ đầu những năm 70, việc phát hiện ra các eii7,ym giới hạn (rong CÍÍC
cơ the prokaryot cu khá năng phiìn cất phân tử AON lại Iiliữim trình lự (lật-
'liệu (lã mó ciáu cho thời kỳ phát triển nhanh chóns, cùa công nghê ADN l;íi lo
hợp - một kiiâu !hen chốt írong công nghệ sinh học. Với kỹ tliuịU này ngươi la
t ỏ tlìé licn hanh các thao lác trên các sinh vạt ở mức độ gcn nhu xác (lịnh trình
lư, ghóp, nòi va chuyên gen
Trong cóng nghệ ADN tái tổ hợp, sô loại RE tìm đưực cìmg 1(111 Ihì càníĩ
giúp chó còng việc trờ nên dễ (.lang và chú động hơn. Mặt khác. viỌc Iiop lục
nghiên cứu và phái hiện enzym giới hạn mới sẽ lầm giám bớt Iihưnn h;m chẽ
và cho plicp đạl tới độ chính xác cao plụic vụ clio các nghiên cứu ly lliuyrl
iTmg nlurcác ứng dụng trong lĩnh vực sinh học phân lử Ví! cõng ntilú' sinh linr
Thực ra, việc lliu ihập nhiêu loại cn/.ym giới hạn khác nhau tiluun mục (líc li l;i

ilium “con này cat ÀDN ở bât cứ vị trí nào người thí nghiệm menu muôn,
i uv (lòn nay tlã có hơn 400 loại R1Z được iinh sạch và Ir(V lliiinh lliiMng I'ltfim
Imng số híinti nghìn loại được phái hiện, nhưng chínlì bới nhung lý tỉ«> liên mà
MÍIÌIY lìíiy MíM.iòi !;i Víĩn tiếp lục lìm kiẽm các RE lừ Iiliicu Million kluít nh;nj.
I IICO Đỏ Đình Hồ, các cnzyni này có mặt ớ h;'m hẽi t ;ic loiii vi khuiMi.
n.ìv chính là (licit kiện fhuân lợi Irong neliiên cứu vổ RE cu 11 í: nhu tmiiìi kil l
lúMiti ( ling câp mộ! lượng lớn sinh khôi làm nauyèn liệu cho cone Iiíiliệ s;In
MiiH Rf;, đ;ii Irìi. Nước (a nam trong vìrng khí hậu nliicl IỈI moi 11 u<
thuân lợi cho sự phát Iriển đa dạng của vi khuẩn. Do vậy, sẽ có nhiên luía hẹn
trong việc tìm kiếm các RE từ nguồn nguyên liệu phong phú này ò' Việt Níim.
Mục tiêu đề ra của đề tài là:
- Điều tra sự có mặt của RE ờ một sô chủng vi sinh vật phân l;ìp Ỉ1 Việi
Nam.
'illrun (Jò phương pháp tách chiết và mội sỏ' diều kiện pliiin ứng cua
cii/ym giới hạn của mội chùng vi sinh vật.
- Bước (lầu linh sạch cn/ym giới hạn trong điểu kiện hiện có cua
phòng thí nghiệm góp phần vào nhũng nghiên cứu cơ bán về cnzym gi'fi lum.
Cóng trình này ilưực thực liiện lại Bộ môn Hoá sinh - Klìoa Sinh học -
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Há nòi tỉr 7/1W7 (tòn
7/1 í-m.
-2-
V NỘI DUNG
1.1
NCỈUYẼN LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NCỈHĨÍ N cứu
1.1.1 NGUYÊN LIỆU
Đôi tượng: Chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đê điều Ita CM/Yin uitíi h;m
(lược pliiìn lập lu Bộ mòn Vi Sinh học. Trim£2 làm Vi sinh vật học úng climti.
Khoa Sinlĩ lioc- Trường đại học Khoa học tự nliièn Đại hoc Ụuỏc gi;< Fill nói.
Gk: nòi vi sinh vật để ti lử hoạt lính lizozym do phòng sinh hoc pliiìn
lử Viện Vệ sitih dịch tễ cung cấp

IT I} Nuói cấy trên môi trường dịch thể
o m
\5
TV 2
ĐCD 10 Nnỏi cày trôn môi (rường đĩa Ihạch
GB 4
MBA 3
CD I
CU 2
I loá ciiíll:
\ I nviìi pi (Vi han chiiàn: Sai II. Ilnul III, ỉ <<)Ị{\, Htinil/ I, \h(iị,
ì Ị a t: í!l CI.UI harm BioLiibs (Mỹ)
I- ! j /07\ m cua hãng SỈÍ.ÌMA ( M ỹ)
+ ADN chuẩn: ADN Ằ, ỘX J 74, AND 77 cùa hãng Biol nhs
+ Acrylamit, Bis-acrylamit, Tris-HCI, Tris baz<T. Elidinm Bromil.
TEMED, EDTA, 2-Mercaploetanol, Trixton X-IOO. Scphiicrvỉ
S-2UƠ, Heparin Sepharoza CL6B cua hĩing PhíiniKtúa Clhụy
Điển)
+ Pepton, cao nấm men, DEAE-Xenliilo/a, BSA cua liãmi SÌÍIIIKÌ
(Mỹ).
- Tliicl bị nuíy:
-r Ly Uìm lạnh: Sorvall RC - 5ÍB Refrigerated supersỊK-ed
Col'll ilugc (Mỹ).
+ Máy siêu Am: Soiliprep 150 (Anh)
Máy soi: Hoeleĩ - Macro Vue UVis - 20 (Mỹ)
I- Máy quang phổ: Shimatlzu Spectropholomclcr I IV \ IS ( NliẠI)
f Bộ chạy diện di nằm nhỏ và lớn Bid - Rad (Mỹ)
+ 13ọ chạy diện di dứng: Hocícr - Pharmacia (Tluiỵ Điên).
Các hoá châl và dụng cụ thí nghiệm khác ờ pliòim llií iiLĩliRin UM fỉ<>
môn 11c)á sinh liọc-Trườne đại học Khoa hoc lự nhiên - Đại học Ọiioc gi;i I III

nội ticII đạt yèu cầu dùng Irong nghiên CỨLI
1.1.2. PHƯƠNG PHÁI’ NGHIÊN cửll
1.1.2.1. NlíOỉ CÂY XẠ KHUẨN
Chủng vi sinh vật nghiên cứu dược nuôi tiên mói mrớng (lia ihíicl) hpl
có lliiinh phiìn !ihư sau.
KJIPO, lg
NaCI ! £
M g S O :. 7Ỉ U ) Ig
-4-
CaCO, : 2g
(NH4),S04 2g
Tinh bột l()g
Agar : lOg
Khuẩn lạc sau khi mọc trên dĩa thạch dược chuyên sang mini c;ìy moi
trườiìg dịch ihể LB có thành plìần như sau:
Pcplon JOg
Cao nàm I11C11 5íi
Na( 1 l()g
II/) I.OOOml
Các môi Inrờng được khửliìmg ờ 1 atm trong 30 phút. Chiiĩự \<\ klmim
(lưực nuôi cày (V 37nc.
-5-
1.1.2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP THƯ NHẬN CHẾ PH AM EN7AM
1.1.2.2.1. Tách chiết enzym ri sinh vật từ môi trường nuôi cày
Các lè bào vi sinh vật được (ách ra khỏi dung dịch nuôi Cíìy hang c;kli
ly tâm 50(K) v/p trong 10 phút ớ 4°c. Loại bò dịch, thu lây cạn k' bao. sinh
khối vi sinh vại lũ:II chua sử dụng (lược cát giữ trong 111 kinh ờ 4' c. ktra le bào
bằng tiệm plúi tè bào SB ( lOmM Tris-HCI: O.lmM EDTA; HhnM
mercíiploekinol; 0,2°v Trixlon X-100; Imỉvl NaN,; y < dyxcrol; 5()niM N;i(1:
pỉỉ 7.4Ớ25"C).

Uinm sit’ll Am tic phá vỡ lê bào ờ (í'c, 8 Amp, 111(1! clui kỳ chíiy siòu ;ÌI!I
là 15 giíìv. Thơi gian siêu ôm kliône quá 5 phút (lé b;i() vệ lie nil lính cn/vin
I ,y liìni dịch lố hào dã vờ cùa vi sinh vật với tôc (lọ 1 7.000 \/p Irnni! .ÍU phui (V
4nc. I lui tfịch chiết rút Ihô.
ì.1.2.2.2. Thứ hoại tính phá màng cùa lizozytn
Môi trường nuôi cấy: Vi sinh vậl được nuôi cíìy trong mòi Mirứrm
Luria Broth (LB)
Phá tế bào vi khuẩn bằng siêu Am:
Sau khi nuôi cấy tế bàơ vi khuẩn, ly tâm thu nhíìn tc Ixio. Chuyên
lê hào vào clung dịch dệm siêu âm. Lấy 5 ml <JỊch lê bỉìP, siêu ÍÌI11 ơ 0" ( '. mõi
chu kỳ 10 giây. Sau 5 chu kỳ, thử độ trong trong các Iriii phá li' him. Kill (lọ
lio ng không tăng lcn nữa hoặc tăng lên không dáng kể thì ngứnu lỉii ( lli(<i
gian sicu ảm không quá 10 phúl)
Phá lê bao vi kliuần hầne lizozym: Lizozym được pha với c;íc 1101112
<íó (),!. 0,2 và 0,3 mg/ml với đệm Tris - HO ]() niM, pH 8.0. Líì\ IfK> pl dịch
nuôi câv vi kiitiiín trcn môi trường lỏng và trên dĩa thạch, cho tliòm xon Ịil
(lộm Iris MC I 10 m M, pH 8,0 và 200 ụl dung dịch lizo/ym cùa (ứng loiii. lỉ
(V nhiệt (lọ lạnh Imne 2 giờ.
L\ lâm lấv cl it'll lẽ b ào vi khuân ớ 1 0 .00(1 g í 14 .300 \ niiíi/plnii)
trong Ị 5 phúl ừ í)"c.
Phương pháp xác định độ phá vỡ tẽ bào vi khimn bứi ÍÍ7(V\ IU
I Xác định dọ dục trước và sau khi có ti/o/.ym
Lây 100 J.il dịch tế bao, cho lliêm 800 Ị.|| (lẹm Tris 11( I I (> 111M,
p lỉ 8,0 và 200 f.(l dung dịch lizozym 1,5 mg/ntl, Đo O D If 1)1 fife sóng lim
Inrớc và san khi cho lizozym. IJ ớ Iiliiệi dô iạnh troníi 1.0 . 1, \ 2.0 , r \ x \ ;i 1.0
giờ.
I X;íc định (lô plìú vỡ (ế Into lnrớc v;'i s;m ỉ.lii 1’lin li /o / \m
('liuiìn hị lè bao nhi.r ờ pliíin xác dịnli till due. PỈKi loíim: Ic him <1
» lác iK'iig (lộ l() I0 4 và i()\ Láy 9C)0 |.tl IUÍÓC cat. dm thêm I0 fil (I|! It H'' Kin
(a), nlui UííĩtIII dịch a biMiiĩ cách liVy 990 III nước c;ìt ini chd llicm Id Ịil <lit li a

(b), tièp lục- [ilia ioãng. I;t> niffic c;ii did them K> ụ I dịch b 'c■) I.;'|\ > pi
(lịch c < I()r'> t'A\- (toil lên (tia thạch. II Ờ 37 Ocm so iưỢĩìii \v K|'V
-6-
- Phản ứng của enzym giới hạn có sự tham gia cùa lizozym
Lííy 5 ống nghiệm, cho 25 fil đệm phản ứng TR (lOmM Tris HO;
10 niM MgCl?; lOmM 2- mercaptoelanol; 50mM NaCl; pM 7,5, tho sau khi
đã khử trùng), 2 ul AND (Pha loãng 500 rnicrơgam/microlií), I fil eii/ym Iiiới
hạn (Hindllf, Bíiiii HI, Eco Rỉ), 3 111 lizozym vào các ÔIÌÍZ có nong (tô ctiôi
cù ng là '),/!. 0 ,2 , 0,1 5 và 0,1 m g/m ỉ và óna. đối chứní! không có |ị/i'/vtn. 1 1 ớ
17!lc trong I mờ. Sau (.10 cho vào mỗi ong 10 |.il duiìg (lịch Iigưnu pli;in ứng
(50fỉr glixerin, 50 m M E D T A . pH 8.0 . 0 .02 % biomopheno! blue).
- Pli ;ín ứng với cn/ym giới hạn dịch chiết thô (phá king siêu Hin) C(' \ ;t
0,01 TTig/tnl vói đ ệm Tris - H C 1 10 m M , p H 8 ,0 .
+ Clruẩn bị dung dịch lizozim: Duniỉ dịch có nồng (In 0 .3. ('.2,
0,15 và 0,1 mg/ml với đệm Tris-HCI lOmM, pH 8,0.
+ Phan ứng: Dìing 5 ỏn g ngliiộm đánh ilAu từ I đêu 5 . ('bí' H) |i!
đệm NB vào óng 1, 30 |il vào ông 2.3,4 và 5. Cho 5 fil dịch chiêl tim villi OIIỊI
!, trộn đcu. LAy 15 f.i! dịch từ ô n g 1 ch o sang ót UI 2 , tròn (leu. là'. 15 |il (lịch 1
lừ ốiiịì 2 cho sang óng 3, tiên hành tiếp lục (lẽn OTIÍI .“v ()MLI > h('» (li I 5 |il (lịch.
Nịuí vậy, mồi óng nghiệm có 30 ^tl dmig dịch có nong rlò clịcli chic! !liõ iirưng
ứng 1/9, 1/27, 1/81, 1/243, 1/729. Cho vào mỏi ống: 2 |ii AND }. h(‘ặc AND
77, } 111 điihg dịch lizozym lừng loại mồng độ, ỏng (lõi chiniLT không có
li/o/vm, ủ ở 37nc (rong 1 giờ. Cho liếp 10 Ị.il (lung dịch ngưng phán trim .
- Điện <Ji nên gc! agaroza.
G el Hiiaroza 0,7 % (lav 3 - 4 m m . C ho vào m ỗi giénti ỉ:‘> fil (lung
(lịch cua thui 011(2, Iighiệĩn, đối chứns là mẫu AND /. cắt hói ỈIÍIKÌ III. (liên áp
Ị()(ìV . Khi kết ỉhúc điện di, bi’ui gcl clirực nhuộm với clidium liromii (10
mgẠil). Cik’ hănc AND dược phái hiện và chạp hằng ;inh pnlamid.
l.ỉ.2.2.3. Phưong pháp xác định hàm lượng protein
Đo độ hấ|> thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm v;'i 280 lìm \h lính Ilico

cồng Ihức:
Hàm lirợng protein = 1,55 X OD280 - 0,77 X OD1fll, ímg/ml)
l . 1.2.2.4, Sắc ký lọc gel qua cột Sephacryl S-200
Gel ở dạng trương sẩn được nhồi lén cột có kích thước (1,0x60cm)
Gìn bang và lừa chiết cột bằng đệm NB (10 niM Na?fÍPOị-NaB^PO,: 0,1 111M
l:DTA; lOmỉvỉ 2 - mercaploeUmol; 3% íiiyxerol; 50 mM NaCỈ; pll 7.1). '11)11
mỏi phân (loạn 2 ml với lốc đọ cháy 15ml/h. Đo đô luìp thụ (V buứí/ sóne 2X0
nil, và hoạt tính phím cál ÀD N của enzym ở các pliâii đoạn.
1 . ỉ .2.2.5. Sắc ký trao dổi ion qua cột D EAE -Xeiihiloza
DEAR - Xcnluloza dạng bột khô được Ilgam (rong MCI 0.5M Irong 30
phút roi tlưực rứa bằng I1UÓC cất (lến pH 4,0. Tiếp dcn xử lý hang c;ícli ngAm
Imng NaOH 0,5M trong 30 phút và cuối cùng rứa bíuig mróv cất (lên pH tiling
lính. Nhựa trao dổi sau khi xử lý được nhồi lèn cột có kích thước I X 10 cm.
CAn bằng CÓI hằng đệm TB (lOmỉvl Tris -HCI; 0. linM i'UT.A; ỈOmM ?.
mercaploelanol; 5% glyxerol; 50mM NaCl; pH 7,4). Chế phẩm CI1/VH) CÂM
tách cliiêl dirợc cUra lên cột. Phẩn protein không hâp phụ (iượe nr;t IvìMịỉ (lộm
IB với lốc (lọ chây 15m]/li. Phẩn protein hâp phụ dược lưa duel Ivuifi file
nồng (lô NaCI pha trong đệm TÍ3 tăng dần từ 0.1 M 0.6M. 'l ie'll liìmli lim pliitn
đoạn, mỏi phàn đoạn 2nil để phân tích protein và hoại lính phán cỉil ADN cun
rnv.ym. Cột dược chạy trong đi CII kiện lạnh để đảm háo hoại lính cua t;n/ym
ỉ .1.2.2.6. Sac / < V ái lực qua cột Heparin Sepharoza CL - 6B
Heparin Sc[i|iiU(va dạns bột khù (ỉuơc ngíìrn trong đ ặn T B ( lOniM Ills MCI;
O .lm M [;.Ỉ)TA; tOiĩiM 2 - m craip locla n ol; 5 r c gly x cm l: 5 ()inM NíiCI; pi I / Ị)
-8-
sau dỏ nhồi lên cột có kích thước (0,5x3cm). Điều chính tốc độ chíiy I 5ml/li
lứa vài làn (2()0ml/g bột khô) dể đẩy tạp chất. Chế phẩm cnzvm cíin !;ícli chièI
được đưa lên cột. Phần protein không hấp phụ dược rửa chiết hán<2. gradient
nồng độ NaCỈ pha trong đệm TB từ 0,05 M - 1 M NaCI. Tiến hành tlui phân
(loạn, mỗi pliAn đoạn lml để phân tích protein và hoạt lính phân cắt AON cua
enzym. Cột dược chạy trong điều kiện 4 - 6nc để đảm hảo hoạt tính cu;i cn/ym

1.1.2.3. XẮC BỊNH HOẠT TÍNH PHẢN CÁ l AIiN CÙA ENZYM
GIỚI HẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN (ỉIX
AGAROZA
1.1.2.3.1. Thực hiện phản ứng
Pha loãng dịch ehiêl rú! thô V<Vi các riổng độ kliííc nhau trong (Imig (lie’ll
rlỌm phán ứng NEB 2 ( lOmM Tris MCI; lOmM MgCI?; 50ml NaCI; ImM I)1T
pH 7,(J ờ 25"C). Từ mõi dung dịch đó lấy 30 |il cho vào 2 III ADN ) c !iu;ìn
(500 |Lig/ml). l ien hành ủ hỗn hợp phản ứng ở 37nc trong ni(>t pin’. I )(riìịi pli;in
ứng bang cách sue Tilljệt ở 65nc trong 3 phút.
rù' dung dịch phân ứng lày ra 15 Ịil, thêm vào 2|il thuòc ĩilmọm (ỉ 11J) ĩ A
5()inM và bmmophenol xanh 0,02% pha trong glyxerol 5f)rÝ ). Ch Am điện (li
etc phát hiện các băng ADN được ắtí ra nhờ RE trong dịch chiết
1.1.2 ì.2. Chuẩn bị gel agaroza rà chạy điện di
Đệm THE 5X được chuẩn bị bằng cách cán 54g Tris-lwơ \à 2 7 . ;i\i!
boric, Iliêm 20iiil BDTA 0,5 M rồi thin nước cAl liến llít.
Từ 1 BE 5X pha loãng thành TBE I X để đổ gel ilgaroza và cliav (liên (li. (1
(ỉcl agaro/.a O.R^Í' dược chuẩn bị bằng cách (lun sõi 0.24 e ;tn;iio/a
(mng 3()ml 1 HÍI IX. Đổ dung (lie'll agctro/a nguội đen khoáng o n e 1 hì do’ IO11
khuôn °cl (lã cài sim lược. Sau khi gci dóng, cho gcl vìm máy điên (li. (lo I RI-;
-9-
IX v;'in máy sao cho gc! ngập Irong đệm khoảng Imm rồi lút ỉưựr ra. I5|il
(lịch trộn mẫu dược cho lên mỗi giếng.
Chạy diện di ở hiệu điện thê ổn định 40V. Khi vệl chài màu eliiiv <1;In
hết bíin gcỉ thi ngắt dòng. Nhuộm tỉc! bằng dung dịclt etidium hroinii 2rr. I ,;ìy
ụcl ra (lem sui dưới đèn lủ ngoại để quan sát sự phân bõ CUÍI cát' brill” ADN
LI.2.3.3. Xác dịỉiỊi dộ tinh sạch của chẽ phâm enzyni bàng phương
phá p diện di trên geì SD S - Ịĩolyacrvlamit /heo ỉ.ncminli
(ỉ 970).
- ChìKĨìì bị (ỉim% (lịch (ỉé chạy điên di
,\

Dung clịcl) goc 30% : cân 29.2 £ iicrylam iỊ hoà lan YỨi I M ) lliành ino till YÌ\
I lú'111 viu» O.K g bis-aciylamil.
li. I'lis - I K ’I I.5 M, pH R.8: Gìn I<s,l7g 'ĩ 1 is -b;i7ơ. O.().|o Slxs linii f;in Iioim
11,0 và chính VC pH 8,8 hằng HCI. sau đó dần ỈM) (lèn lOOml
c . Iris - IICI 0 .5 M , p íl 0 ,8 : CAn 6 ,0 6 g T ris-ba/ơ , 0 .0 íg S DS lioìt Inn limiL!
H,() và cliínli (lốn pH 6,8 hằng Hơ, sau dỏ dần n ,() (í<?n lOOml.
I). Amoni pcisulplial [()%: Cân 0. Ig amoni pcrsulplnil pha Irong Iml Iỉ,()
ỉ’. Dmụi dịch (ìận điện cực: Cân .V) g Tris -baz.(t Vít 14,4 2 lilyxin. ( ho Iliún
!.<>L’ S D .S m i <1011 H 2O đ ế n lOOOml.
! . Dệii! cò |>i! '1.8: Oìỉi Jg Tiis -ba/ơ hoà lan 11CMÌ!’ íỉ,n. chính \|'‘ píl
bfmii 11(1 cho H X ) đôn 5(>ml.
( ì. Chài ( 111 Ihị iikilì: Cân 2mg iuomnphcnol xanh ỈIOỈI Utn trong 0.5 mỉ (têm [
0.3 ml ỉ Iị( ) vỉì I nil glvxcrol.
II. Thuốc nhuộm: Câti 250 g CIìB G 250 hoù lan trone 100 ml 111'II hop ill inn
dịch CH,OM: CH,COOH: ỈU M h e n ly le 4 5 :9:46 vẽ the uVh.
- 1 0 -
- il -
ỉ. Pha dung dịch tẩy: Là hỏn hợp dung dịch CH,OM: Cfl;COOH: 11,0 theo
tỷ lộ 4:1:5 về thể tích.
- Chuẩn bị mẫu
Chất đổ pha mầu là hỗn hợp dung dịch 2 - mcrcaptoclanol: SDS M)rf :
chill chí thị mìui pha tlico lỷ lệ 1:1: 2 về thổ lích.
Mẫu được trộn với chất pha mẫu theo tỷ lệ 10:1 về thê tích
- Đô gel chạy diện di
Cliuắn bị gel po ly ac iyla m il lli(X) tý lệ ghi ở bang sau:
Itíiiiịỉ 2. Thành phán các dung dịch (lệin
0
fi.au
o.nn
(ìcl lácli i 2.5% sau khi frộn đểu được cho nhanh vào kliuon kính có

kích ill ước 0, 1 >'X,()x 10,()cm. Tiièm n;rớc cất lèn lĩén mài gcl c!c míif ucl kill'll]”
I 'Ị oxy hoíí và hồ na phang. Đê gel (lỏng khoảng 30 pill'll 111! ỉnạị bo I < rp mine
phía trê:ì, cài ỉuơc và đổ tiếp lóp gcl lách 4,5% lên phía Ircn. Đê ịicl trùng hợp
giờ impịĩ mi'o’c, '.ail ciỏ íliay íiước hằng đệm điện c ực E. Dùng C’\ linh bơm
30f.ll 1 nAu \’à< 1 mui giếng.
Tier hanh cliịiv íliện di trong tiệm (liện cực với hiệu diện the IOOV. cường (lo
(lòĩig (.liệu 3mA/ giếng. Sau khi vệt châl màu chạy liêl hán gcl, l;ìy gcl ra
nhuộm với dung dịch H. lẩy màu bằng dung dịch I và chụp ánh kc\ quá thí
m nghiệm.
Uung dịch
Loai 1
A B c
ĩ i2o
TRMED
(ỉcl cỏ l.s%
0,3
- 0.5 1.2
0,003
íicl liírli 12.5%
2.5 1.5 - 2.0
O.OÍM
-12-
2. KẾT OUẢ VÀ THẢO LUẬN
2.1 . ĐIỀU TRA Sự CÓ MẶT CỦA ENZYM GIỚI HAN Ở MỘT sò
CHỦNG VI SINH VẬT PHẢN LẬP Ở VIỆT NAM
Nhăm tìm kiếm cấc chủng vi sinh vật chứa enzym giới hạn. chúng tỏi
tiến hành điều tra sơ bộ mộl sỏ chúng vi khuán và xạ khuấn phàn lập ớ Việt
Nam.
2.1.1. Nuối cấy vi sinh vặt
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 20 chúng vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh

học và Trung tâm Vi sinh vật học cung cấp. Các chủng này được nuỏi cây trẽn
đĩa thạch trong môi trường Isp 4 đế thu lav khuẩn lạc. Một trong những hình
ánh vi khuấn được nuối cấv trên đĩa thạch trons môi trường Isp 4 được thế
hiện ở hình 1
Hình 1. Khuán lạc cua chủng vi
khuấn 5 nuôi cấy trẽn môi trườn,2
thạch Isp 4
Sau khi o.íc khuẩn lạc đã mọc trên dĩa thạch (ỉiìnli I). ch line loi thu l.ìv
vi sinh vật và chuvển vàn nuôi cấy trong môi trường dịch the LR. rác lê h;'io \ i
sinh vật nuôi Irong môi Irường dịch thể LB dược sử dụng làm nguồn (. ung cíìp
enzym. Với phưtíng pháp này, cần phải tăng sinh khối tố bàn trong íl nhíli lii
1000 111I môi trường LB. Các bình nuôi cấy giữ ở 37(’c và phải (lược lắc hên
lục. Tuỳ thuộc lừng chủng mà thời gian nuôi cấy trong môi trường khác nhan.
Có chung chỉ nuôi trong 24 giờ. có những chủng khác phái nuôi (.íìy Irnnp Vi
giờ ctên 48 giờ mới iliu dủ sinh khối dể thí nghiêm. Ch lí 11ÍI loi Itm chung b;ìnn
cách ly tAni và cho tan lại trong 5 ml đệm phá lố bìio. Cuối cùng chi dimg .10
(li ilịcli thô dã pha loãng 1/81 lán (lê xác địíih enzyni giới hạn. v<Vj clumg
không tìm thíVv enzym giới hạn, việc phím (ích neừng lại linn cl ui 11,11 loi liêc
còng sức, thời gian và nguyên liệu. Do vậy. ch? có những chung (Itinnt: 1 inh
cua bước clíiu Iiglìicn cứu này đirợc chọn lọc và nuôi cííy lrong môi Huong dieh
lliể (lê tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo. Đê khác phục vAn tic TIMS'.
cluing lỏi chi nuỏi chủng liên môi trường thạch và tlui sinh klini tnri' liẽp
Rước llií nghiệm này dơn gian hơn so với phương pháp Irơííc NÌ rhune loi
kliòuị! pliái ly tâm nhiều lân đè' Ihu sinh khởi. Mặl khúc, đìa tliíich ilưựi/ II
tiMỉiii III ổn nliiệl bao cìíím 37°c, vi khuẩn được tăng diện (ích tiếp xúc VỚI
không khí nên phát trie’ll lot hơn và đục biệt (rong một thời giiMi Iiuắn (24 giờ)
cluing lòi có llu' iliu dược sinh khối dê xác định en/yin
2 .1 .2. Điều li íỉ sụ có mặt củíi enzym giới hạn
T r o n g lrường hợp c ó en zy m giới hạn trong clmntz vi sinh \'ẠI n u hiũ i t iru
1,1 có Ihe philn tích dể xác định enzyin đó. Ly lâm dịch lliê LH 5000 \/p Irons:

10 pluíl ớ 4°c (lê thu Iày siiili khỏi le bào. l ỉoà các lê bao Irong tiệm MrII ;ìni
ỉ lỉ (hc«> lí lệ ỉu lố bào: 5ml đệm. Có lliê pliá vỡ (ế bìic b;ìng akli Iitiliicn lr
bìio với bột bioxit nhôm hoặc bi tluiỷ tinh. Nhưng cách loi nhàt III HunII
- 14 -
phương pluíp siêu Am. Một vài chung vi sinh vạt phái bo sung 100 ỊiỊi/ml
lvzo/ym nước khi sicu âm 15 - 30 pluìt. Trong nghiên cứu này. (Iimií! lõi sicu
Am phá vỡ 10 hào ớ 8 Ainp trong 3 phút ờ 0"c. Quá Irìnli sicu fill) chun 1 iè11
hành không liên tục, cứ khoảng 15 gifty lại dứng lại mội khn;in<2 tlioi ìinn
liĩơiiịí ứng dê (làm háo khùng cổ sự 5ăng nhiệt (lộ dáng kè lione quá trình súHt
Am làm ảnh hướng đến hoạt lính cùa enzym. Dịch phá lố hào ihrợc ly I;ÌI11
17.000 v/p Irong 30 phiil ở 4°c. 1 ^oại bỏ kct tủa llui l;ìy phẩn 11 ƯỚC H(ii (lè (tit'll
Ira sự có mặt cùa RF£. Thông qua kha năng cắl CIIH cluíng đối với AI >N } (long
(hời (lựa vào (liện di đổ các ctư.viĩi giới hạn chuán có thể xác cĩ ị nil (liKír (hung
IIÌIO có RE hay RH tìm (Urợc la đã biết hoặc chua từiif! pliííl hiện. Hiinii 1 !;i k('l
(]iia C IIÍI quá )rình khán sát với các cluing vi sinh vậl (In dùng.
lỉíin^ í. Kêl qiui kháo SI)
sinh vẠl Irone lự nhiên
sự t ó mật cua
cn/yni giới liíiii
o mol so clmtig \
SI 1
( bung
vi sinh vật
Nuuỏn gôc
ADN tlimg
dể phàn (ích
Ki'1 (|Míi
Ị)h;tn tích
1 Vi kfmfin I Nước thai
ADN )

KIioiil’ có v;i(/!i
2
Vi Minim 2
Tmim cống
3
Vi kí UI an 3
- -
? v;i' I) IIP'
4
Vi khuàn 4
1 \ l i 1111 í
s
Vi khuân >
-
( v> \ : 11' 11 t<'
6
Xa kiuiíui Q3
1 rong đât
ADN ;•
Khi'IIL’ ' <' ' h
7
Xa khuân Ọ4
X
Xạ klm;m 3
- ( ’(' 2 \ •11 1) 111ft
<)
X.1 klHÙM 4

- 15-
STI

Chủng
vi sinh vật
Nguồn gốc
ADN dìing
dể phân lích
Ket quà
phím tích
10
Xạ khuẩn Q8
- -
Không cỏ vạch
1 1 Xạ khuẩn Q10
- -
Có hai vạc h
12
Xạ khuẩn Q12
-
-
13 Xạ khuẩn 5
-
Có 2 vạch mờ
14 Xạ khuẩn 6
-
15 Xạ khuẩn 9
- -
16
Xạ khuíỉn 1 1
-
17 Xa khuẩn 12
- -

18 Xạ khuẩn 15
-
19
Xạ khuẩn 18
- -
20
Xạ khuẩn 20
■
-

Chi'mg tôi nhân tháy rằng ớ chủng vi khuẩn 5 XIIAt hiện nil Milieu bring
ADN lương đối rõ nét. Như vậy ở chủng vi khuẩn nàv có RE và ờ dịch chiết
thò enzyin hoại độnq khá mạnh ớ độ pha loãng 1/81. Còn (1 nlmníi chung xạ
klnmn Ọ3. (>l. Ọ8 và vi khuẩn 1. 2 ADN Ằ dã bị Cíil nát. c II the (!" mklcíi/a
hoại dọng niiỊiili. tao thành vệl sáng mờ Irên gcl điên (li. Đói v<Vi nhúng (/hung
vi klr.nín và XH khuan còn lại xuất hiện ! dên 2 băng vứi kích tlutcVc kho;inụ lir
700 800 bp. Có Ihổ rằng các criilonucleaza không tlăc hiệu lao ra ĩihihic bring
ADM giới him không rõ hoặc những đoạn ADN Ằ bão lliu clura hi
cmlonuclcaza uit hét. Trong (lịch chiết lỉió cỏ rât nhicu yêu tô' có thố Iigfm t an
viộc t illing 111i 11 li sự có măt cua RE như cúc ctitloiuiclc;i7íi khoiìg (l;ii liiộii. CIU1
exonuclcaza iiíiy do những Rp, hoại động không bến. Ọua két qiiíi niiy tilling
- 16-
lổi nhận thấy rằng, muốn phát hiện cnzym giới hạn cần phái lìm Cỉkli loại (lừ
các cndnnulcaza không đặc hiệu có mặt trong mọi tố hào. Các eiulnmiclcaza
khổng dặc hiệu tạo ra những băng giới hạn không rõ vfi làm cho việc xác (lịnh
trở nén khó khăn hơn. Khi những ảnh hưởng này bị loại bỏ thì hoạt tính cua
RE sẽ dược biểu hiện. Vì vậy dịch chiết thô cần phải sử lý qua các cột sác ky
dể cho phép tách RE ra khỏi các yếu tố ảnh hưởng. Với 20 mẫu dịch chiết thò
lừ vi sinh vạt, sau khi làm phán ứng chúng tôi chỉ lìm được mộ! chu n g vi
khuẩn 5 có hoại tính RE rõ ràng, chiếm tỉ lệ 1/20. Số liệu này thíìp liơn so với

kết qua mà lác giả Lê Thị Kim Tuyến tlưa ra khi tiến hành dicu la Rĩ; cua
2000 vi sinh vật là I/5-1/6. Nguyền Thị Vân Anh (1993) cíing (liều Ii;i 17
chủng vi sinh vệt và đã tìm được một chúng xạ khuẩn có RE A va II và pliál
hiện sự có mặl cua hai RE khác trong hai chúng vi khuẩn. Sự khác nhau nin
LÕ lẽ là do số lượng mầu điều tra của chúng lôi còn ít. Ràl có thê tí lè niiy
không chỉ dứng ờ con sổ 1/6. Nếu tiến hanh điều tra diện rộng 1 Tên IAI c;i các
nguồn vi sinh vật lliì có Ihể còn Cíio hơn nữa. Như vậy, các nghiên cứu đã
chứng 1Ỏ rã nu số lượng các vi sinh vật phân lập ở Việ! Nam có chứa RR không
nhiii là ÍI. và sẽ là nguồn cung cấp RE phong phủ cho những nghiên UIII và ứng
dụng RE sau này. Chúng tôi chọn chủng vi khuẩn 5 làm dối tưựng nghiên cứu
cho các thí nghiệm liếp theo.
2.1.3. Nghiên cứu sủ (lụng li/o/im phá màng tê l>ào vi khuẩn
2.1.3.ì. Xác dịnh nóng độ liz.oziin thích hợp
2.ì 3 .1 .Ị. Dòì với các enzim chuẩn
Để tìm hiếu anh hướng của lizozim lên các en/.im giới hạn cluiiiii. cluing
lòi (in hò lií thí nghiệm clùim lỉmd ỈÍI cắt ADN )- trtinii sự có mặt cua li/n/im
ờ CÌÍC Iiổng dọ khúc nhíUi đùng dể pluí màng tè hào vi kluiấn.
-17-
Qua kết quả cho thấy, nếu nồng độ lizozim 0,10 - 0.15 mg/ml có trong
hỗn hợp cắt của Hind III không ảnh hưởng đến kết quá. Nhưns ờ nồng độ
lizozim 0,2 và 0,3 mg/ml thì đã cắt nhỏ ADN Ằ. (hình 2 )
1 2 3 4 5
Hình 2. Phổ điện di ADN X cắt bởi enzim giới hạn Hind III có lizozim
1 -
ADN Ã + Hind III +Hzozitn 0,3 mghnì
2 -
ADN Ả + Hind /// +lizozim 0,2 mghiìl
3 -
ADN À + Hind III +iizozim 0,15 mg/ml
4 -

ADN Ả + Hind III +li:o:ini 0,1 nigìniỉ
5 -
ADN Ả + Hind III +kliõiiịỉ có iizozim
2.1.3.1.2. Đôi với ơniim í>iứi hạiỉ dược tách chiết thó bài te hào hitniỊ siâu âm
có và klìôiií’ có sự tham ụia của lizozim
Sau khi tìm hiếu anh hướng của nồng độ lizozim lén sự cắt ADN Ã.
chúng tôi đã thí nghiệm tiếp tục sự ánh hướng cua lizozim lên cnzim giới hạn
thổ của một sô' chủng vi sinh vệt được tách chict bằng cách phíí vở lê h;in hừi
siêu Am.
Đối với enzim giới hạn thô cua chủng TT13 phá vỡ tế bào bàn í! siêu ;ìm
+ Có tliêm lizozim nồng độ 0,3 mg/ml.
Khi hỗn hợp phản ứng có thêm lizozim nồng độ 0,3 mg/ml, (àl Cii ADN
Ằ bị cắt nát không có băng điện di, điều này chứng tỏ lizozim dã ánh hướng
dến sự cắt ADN Ằ và ADN T7 bởi enzim giới hạn của chùng TT1 3, có Ihể tlã
ức chế sự lioạt (lộng của enzim giới hạn, có thể đã thuỷ phân cnzim giới hạn.
+ Có Ihèm lizozim nồng độ 0,15 mg/ml
- Với chúĩitỉ Í T 13
Sau khi thử phán ứng cắt ADN bởi enzim giứi liạii (liõ cua cluing TI 13
C(j ihôm lÌ7,()7.iin nồng độ 0,3 nig/m không có kết quà. Chúng tỏi tliir phàn ứng
với hỏn hợp cỏ lizozim 0,15 mg/ml và kết quả cho thây enzim gicvi h;m thô c ua
chủng 1TI3 có lizozim 0,ỉ5 mg/inl trong hỗn hợp dã không anh Inrứng (lèn sự
cắt /\DN /\ và ADN T7 bời enzim giới hạn thô của chùng TI ! 3 (hình 3)
- 18-
-19-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hình 3. Phổ điện di ADN được cắt bới enzim giới hạn thô lách từ chung
TT13 có lizozim 0,15 mg/ml tham gia.
ỉ -5- ADN À + enzim giới hạn thô
6, //- Đổi chứtii> khõuy có ADN
7-10- ADN T7 + enzim ịịiới hạn thủ

12- ADN Ả + Hind ///
- Với chúng OTB.
Khi sứ dụng enzim giới hạn thô của tế bào chủng OTB phá vỡ bãng siêu
âm và khi phán ứng có sự thêm lizozim nồng đô 0,15 mg/ml cho thấy ớ nổnơ
độ này không ánh hướng đến enzim giới hạn của chủns OTB đến sự cát ADN
Ả và ADN T7 (hình 4).
-20-
12 3 4 5 6 78 9 10 11 12
Hình 4. Phổ điện cii ADN được cắt bới enzim giới hạn thỏ cua chung OTB có
Iizozim 0,15 mg/inl
I - 4: AD N Ả + enzim iỊÌỚi hạn thô
ỉ , II: Đôi chúng khôn W có ADN
6 - 10: AD N T7 + enzim ý ới hạn thô
12: Mau chuẩn
2.1.4. Xác định độ phá vở tế bào bâng lizozim với nóng độ 0,15
nig/ml
Đê tìm hiểu phá màng tế bào VI khuẩn hằng lizozim. chúng tói dựa vào
sự thay đổi chỉ s ô OD và đêm Nỏ lượng lẽ bào .