Nghiên cứu sản xuất ENZYM PFU ADN POLYMERASE bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRUỒNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TựN H IÊN
B Á O CÁO TỔNG K Ế T
ĐỂ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
CẤP TRỌNG ĐIỂM ĐẠI HỌC Q ư ố c GIA
MÃ SỐ: QGTĐ.03.03
Tên đề tài:
NGHIÊN c ứ ư SẢN XUẤT ENZYM PFU ADN POLYMERASE
BẰNG CÔNG NGHỆ ADN TÁI Tổ HỢP
C h ủ t r ì đ ề Ế à i: P G S .T S . P h a n T u í Íi i X g l ũ a
K h o a S i n h h o e
T r e r ò n g Đ ạ i h ọ c K h o a h ọ c T ự n l i ỉ ê n
! OAI H OC Q íJÔ> c L u i MQ,
I r r?Ufv|'^. 7IIV- ’ U ' • ,
r^ .V.T '-Oív.; V'
£>T / ‘> i i
HÀ NỘI - 2005
M ồ i e á n t ờ n
Hoàn thành đề tài này, chúng tôi xin chân thành cám ơn Đại học
Quốc Gia Hà Nội đã cấp kinh phí, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Ban Khoa học-Công nghệ, Phòng Tài Vụ của Đại học
Quốc Gia Hà Nội, Phòng Khoa học-Công nghệ, Ban Chủ nhiệm Khoa
Sinh học đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện đề tài.
Chúng tôi cũng xin cám ơn GS. Frank Jenney ỏ Đại học Georgia
(Hoa Kỳ) đã tặng ADN hệ gen của vi khuẩn Pyrococcus furiosus, TS.
Dương Văn Hợp và tập thể Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc
Gia Hà Nộĩ đã giúp đd trong việc xác định trình tự ADN của một số mẫu
nghiên cứu.
Ngoài ra, trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi cũng đã nhận
được sự giúp đỡ của nhiều cán bộ khoa học và đồng nghiệp khác trong
và ngoài Khoa. Nhân dịp này, chúng tôi xin chân thành cám ơn tất cả sự

giúp đỡ quí báu đó.
BÁO CÁO TÓM t Ắt
1. Tên đề tài
Nghiên cứu sản xuất enzym pfu ADN polymerase bằng côns nghệ
ADN tái tổ hợp,
Mã số: QGTĐ.03.03
2. C hủ trì đề tài: PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
3. Các cán bộ tham gia thực hiện:
PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, TS. Nguyễn Thị Vân Anh, ThS. Ngô Thu Hường,
ThS. Nguyễn Quang Huy. CN. Nguyễn Thị Hồng Loan, CN. Nguyễn Thị Thanh
Hương, CN. Nguyễn Anh Bảo, ThS. Tạ Bích Thuận, CN. Lê Hà Mi, CN. Nguyễn
Quốc Trung, CN. Trần Thị Thanh, CN. Khuất Thị Nga.
4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
4.1. Mục tiêu
Nghiên cứu phương pháp tách gen, biểu hiện gen của Pfu ADN polymerase
từ genome của vi khuẩn Pyrococcus furiosus và xây dựng qui trình sản xuất Pfu
ADN polymerase tái tổ hợp nhầm tiến đến cung cấp chủ động cho các phòng thí
nghiệm nghiên cứu về sinh học phân tử, công nghệ sinh học trong nước chế phẩm
Pfu ADN polymerase chất lượng cao với giá thành rẻ hơn so với giá nhập n°oại.
4.2. Nội dung nghiên cứu
• Xây dựng phương pháp đánh giá hoạt tính tổng hợp ADN bởi ADN
polymerase.
• Thiết kế các hệ thống prim er để nhân bản sen pfu từ genome của Pvrococcus
furiosus bằng kỹ thuật PCR.
• Nhân dòng gen pfu vào hệ thống vector thích hợp, biến nạp vào tron2 vi khuẩn
E. coli và kiểm tra sản phẩm nhàn dòng bằng phương pháp thích hợp (PCR,
phàn cắt bằng enzym giới hạn và phương pháp xác định trình tự các
nucleotid).
• Nghiên cứu hệ thống vector biểu hiện Pfu ADN polymerase ở vi khuẩn E.
coli.

• Nghiên cứu các điểu kiện nuôi cấy, cảm ứng sinh tổna hợp enzym VỚI hiệu
suất cao và xây dựng qui trình tinh sạch chế phẩm (bằng các phương pháp sắc
ký trao đổi ion, sắc ký ái lực ).
1
• Xác định các tính chất của chế phẩm Pfu ADN polym erase thu được, như độ
bền vói nhiệt, ảnh hưởng của một số hợp chất khác nhau, khả năng nhân bản
đoạn gen lớn.
5. Các kết quả đạt được
• Đã xây dựng được phương pháp đánh giá hoạt tính tổng hợp ADN bởi ADN
polymerase.
• Đã thiết kế được các cặp primer thích hợp, nhân bản thành công gen mã hoá
của pfu ADN polymerase bằng PCR, nhân dòng thành công gen m ã hoá cho
Pfu ADN polymerase trong vector pCR2.1, biến nạp vào tế bào E. coìi DH 5a
và kiểm tra sự có mật của gen bằng kỹ thuật PCR, lập bản đồ phàn cắt bằng
enzym giới hạn.
• Đã thiết kế thành công gen pfu vào trong hệ thống vector pET28a, hệ thống
khi được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) mang plasmid pLysS, được
cảm ứng bởi IPTG đã biểu hiện enzym Pfư ADN polymerase có hoạt tính.
• Đã xác định được thời gian cảm ứng thích hợp đối với việc tổng hợp Pfu ADN
polymerase và xây dựng được qui trình tinh sạch Pfu ADN polymerase tái tổ
hợp với một qui trình ba bước: xử lý dịch chiết tế bào ở 75°c trong 15 phút,
sắc ký ái lực qua cột Ni-Agarose-NTA và cột Heparin-Sepharose. Protein thu
được có độ tinh sạch cao, cho một bâng protein với khối lượng phàn tử 92 kDa
trên SDS-PAGE có hoạt tính tổng hợp ADN như chế phẩm Pfit ADN
polymerase thương mại. Đã sử dụng qui trình thiết lặp sản xuất được 40.000
đơn vị Pfu ADN polymerase.
• Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của nhiệt độ, một số hợp chất khác nhau lén
hoạt độ của Pfu ADN polymerase và phát hiện thấy Pfu ADN polymerase tái
tổ hợp là một enzym rất bền với nhiệt, không bị ức chê bởi azid natri, fluo.
monocaprin, heptyl paraben, nhưng bị ức chế bởi EDTA và kẽm sunphat ờ

nồng độ thấp. Các phát hiện này là cơ sở tốt cho việc sử dụng và bảo quản chế
phẩm enzym.
• Đã tìm hiểu khả nãng tổng hợp đoạn gen có kích thước tương đối lớn bời Pfu
ADN polymerase phối hợp cùng Taq ADN polym erase và phát hiện thấy Pfíi
khi phối hợp với Taq ADN polymerase theo tỷ lệ tương ứns 1:4 cho phép nhân
bản đoạn gen dài tới 7,4 kb.
• Đã gửi chế phẩm Pfu ADN polvmerase thu được đến 2 phòne thí nghiệm
chuyên về Sinh học phân tử (Trung tâm Kiêm định Quốc gia sinh phẩm V học,
Bộ Y tế và Bộ môn Vi sinh, Viện 103, Học viên Quản Y) dùng thử và được
đánh giá là chế phẩm có chất lượng tốt, hoàn toàn tương đương với chế phẩm
Pfu ADN polymerase nhập từ các hãng nổi tiếng của nước ngoài.
• Đã có 4 bài báo đãng/nhận đăng trên tạp chí chuyên ngành, có một bài báo
khác đang chuẩn bị gửi đăng.
• Theo hướng nghiên cứu của đề tài, đã đào tạo thành công 1 Thạc sỹ và 3 cử
nhân với kết quả bảo vệ xuất sắc, trong đó có 1 Cử nhân thuộc hệ đào tạo Cử
nhàn khoa học tài năng, 2 sinh viên được nhận giải thưởng (giải Ba và giải
khuyến khích) của Bộ Giáo dục và Đào tạo về công trình nghiên cứu khoa học.
• Có một qui trình công nghệ sản xuất Pfu ADN polymerase tái tổ hợp tham gia
Hội chợ Công nghệ và thiết bị Techmart 2005 tại Thành phố Hồ Chí Minh.
• Ngoài ra, còn có 1 nghiên cứu sinh đang được hướng dẫn tiếp tục nghiên cứu
theo hướng phát triển của đề tài này.
6. Tình hình kinh phí:
Kính phí được cấp: 300.000.000đ
Kinh phí đã sử dụng: 300.000.000đ
KHOA QUẢN LÝ
Chủ nhiệm Khoa
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI
PGS.TS. Nguyễn Xuân Quýnh
PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
C ơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên
PR O JEC T SUM M ARY
1. The title of project
Study on production of Pfu DN A polym erase by recom binant D N A
technology.
Code num ber: Q G TD .03.03.
2. Project C oordinator: A ssoc.Prof.D r. Phan T uan N ghia
3. Project m em bers: A ssoc.Prof.D r. N guyen Thi Q uy, Dr. N guyen Thi Van A nh.
M Sc.Nguyen Q uang H uy, MSc. N go Thu H uong, N guyen Thi H ong Loan, N guyen
Thi T hanh Huong, N guyen Anh Bao, M Sc.T a Bich Thuan, Le H a M i, N guyen
Quoc Trung, T ran Thi Thanh and K huat Thi Nga.
4. The objectives and research contents of the project
a. The objectives
To isolate, clone and express the gene encoding for Pfu DNA polym earase
from Pyrococcus fu rio su s genom e and set up a procedure for purification o f the
recom binant enzym e in order to provide the V ietnam laboratories involved in
m olecular biology research with a high quality Pfit DN A polym erase product but
its price should be low er than the im ported com m ercial Pfu DN A polvm erase
enzym es.
b. The research contents
• Establishing an assay m ethod for assessm ent of DNA polym erase activity.
• D esigning prim ers for isolation of pfu gene from Pvrococcus furio su s
genom e by PCR technique.
• C lonins pfu gene into a proper vector system , transfom into E. coil cells and
check the presence of the gene by relevant m ethods (PCR, restriction
enzym e digestion m ap, D N A sequencing).
• D esigning an expression vector in E. coli for the pfu sene.
• Set up a procedure for purification o f the recom b inant Pfu DNA polvm erase
by colum n chrom atography m ethods (ion exchange. affinity
chrom atography).

IV
• C haracterizing the purified recom binant Pfu DN A polvm erase:
therm ostability, effects o f several com pounds on the enzym e DN A
synthesizing activity, the proccessivity etc.
5. M ain resu lts
• A method o f prim er extension for assessing D N A polym erase activity was
set up.
• A proper prim er pair for am plification of pfu gene was designed, the p fu gene
was sucessfully am plified by PCR technique and cloned into pCR2.1 vector
and transfom ed into E. coli D H 5 a cells. The presence of the pfu gene in the
vector (plasmid) was confirm ed by PCR, restriction digestion m ap and DNA
sequencing techniques.
• A n expression vector svstem for pfu gene using pET28a vector was
successfully designed and the recom binant vector pET28pfu was
transform ed into E, coli B L21(DE3) carrying pLysS and w hen induced by
IPTG the cells overexpressed Pfu AD N polym erase w ith D N A -synthesizing
activity.
• The time for induction of Pfit D N A polym erase synthesis was determ ined,
and a procedure for purification o f the enzym e was set up, which consisted
of 3 steps: i) heat treatm ent of the cell extract at 75"C for 15 m in, followed
by li) chrom atography on N i-A garose and iii) Heaprin-Sepharose columns.
The obtained protein show ed to have a high purity with a single band of 92
kD a on SDS-PAGE and D N A -synthesizing activity in PCR as hish as som e
w ellknow n com m ercial
Pfu DN A polym erase enzym es. U sing the set-up
procedure, 40,000 units o f Pfu D N A polym erase was produced
• The therm ostability and effects o f several com pounds such as ED TA. Z n S 0 4.
NaF, m onocaprin, heptyl paranben on the activity of the enzym e were
investigated. It was found from the studv that the recom binant Pfu DN A
polvm erase was highly therm ostable and not inhibited bv sodium azide,

fluoride, m onocaprin, heptyl paraben, but it was inhibited by Z n S 0 4, EDTA
at low concentrations.
• The Pfu DNA polym erase, w hen m ixed with T ag DNA polym erase in a ratio
o f 1:4 could am plify D N A fragm ents up to 7.4 kb.
• The obtained recom binant D N A polym erase was sent to two m olecular
biology laboratories for trial use and the feedbacks confirm ed that our Pfu
DNA polym erase product was working as well as the com m ercial ones from
w ell-know n com panies.
• Four papers have been published or accepted for publication and one more is
under preparation for subm itting.
• U nder the research direction of the project, one m aster student defended her
thesis with highest results, 3 undergraduate students also finished excellently
their graduation theses, of those one belonged to H onors B achelor Tranining
Program . Two students won prizes in scientific research achievem ents of
M inistry of Education and T raining and the technology for recom binant
Pfu
DN A polym erase production was sent to participate in the 2005 T echm art in
Ho Chi M inh City.
Faculty o f Biology Project C oordinator
A ssoc.Dr.N guyen X uan Q uynh A ssoc. Prof.Dr. Phan Tuan N ghía
Project im plem entin g O rganization
H anoi U niversity o f Science
vi
CÁC CHỮ VIẾT t Ắt
APS Ammonium persulphate
bp Cặp base (base pair)
CBB Coomassie Brilliant Blue
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate
dH20 Nước loại ion

DMSO Dimethyl sulfoxide
E. coll Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
EtBr Ethidium bromide
IPTG Isopropyl-ị3-D-thiogalactopyranoside
kb kilo base
kDa kilo dalton
KLPT Khối lượng phân tử
OD Mật độ quang học (optical density)
PAGE Đệin di gel polyarylamid (polyarylamide gel electrophoresis)
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase
(Polymerase chain reaction)
PCNA Kháng nguyên nhân tế bào đang phân hoá
(proliferating cell nuclear antigen)
pLysS plasmid plysS mã hóa cho T7 lysozvm
PMSF Phenyl methyl sulphonyl fluoride
SDS Sodium dodecylsulphate
X-gal 5-bromo-4 chloro-3-indolyl-P-D galactopvranoside
TBE Tris-base- Boric acid- EDTA
TEMED N, N, N ’,N’- Tetramethyl-ethylenediamme
MỤC IẠỊC
* *
BẶT VẤN ĐỂ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QIIAN TÀI LIỆU 2
ì . 1. ĐẠI CƯƠNG VỂ ADN POLYMERASE 2
1.1.1. Các ADN poíymerase ỏ sinh VỘI nhân sơ 4
1.1.2. Các ADN polymerase ỏ sinh vật nhân chuẩn 5
1.2. CÁC ADN POLYMERASE BỂN NHIỆT 8
1.2.1. TơợADN polymerase 8
1.2.2. 77/ADN polymerase {VentADN polymerase)

10
1.2.3. /%/ADN polymerase 10
1.2.4. Tth ADN polymerase
11
1.2.5. ĩmo ADN polymerase 12
1.3. NHÂN DÒNG VÀ BlỂU HIÊN ADN POLYMERASE 12
1.4. ỨNG DỤNG CÙA C ÁC ADN POLYMERASE 13
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHIÍƠNG P H Á P M .IIIÍA c ứ u

15
2.1. NGUYÊN LIỆU 15
2.1.1. Hóa chất 15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 15
2.2.1. Phàn ứng chuỗi trùng họp polymerase (PCR)

15
2.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1

17
2.2.3. Biến nạp plasmid vào tế bào £ coll 17
2.2.4. Tách ADN plasmid từ vi khudn £ coli 18
2.2.5. Tách ADN từ gel điện di agarose 18
2.2.6. Xác định trình tự nucleotid của gen 18
2.2.7. Điện di ADN trẽn gel agarose 18
2.2.8. Điện di protein trên gel polyacrylamid 19
2.2.9. Biểu hiện gen mã hóa Pfu ADN polymerase trong vi khuan BL21 mang pLysS
sử dụng vector pET28a
.
19

2.2.10. Sắc kí qua cột ái lực Nickel-Agarose-NTA 19
2.2.11. Sắc kí qua cột Heparin-Sepharose-4B
20
2.2.12. Kiểm tra hoạt độ tổng hợp ADN của Pfu ADN polymerase 20
CHI/ƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 22
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GiÁ HOAT ĐÔ ADN POLYMERASE BÊN NHIỆT

22
3.2. NHÂN DÒNG GEN M Ã HÓA PFU ADN POLYMERASE TỪ ADN HỆ GEN CỦA
PYROCO CCU S FURIOSUS

23
3.2.1. Thiết kế primer và nhân bản gen p/i/bằng PCR

23
3.2.2. Gắn sân phẩm PCR (gen pfd) vào vector PCR2.1 và biến nạp vào tế bào £
co// 24
3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của gen pfu trong các khuẩn lạ c


25
3.2.4. Xác định trình tự gen mã hóa Pfu ADN polymerase
28
3.3. THIẾT KẾ VECTOR Biểu HIỆN GEN M Ã HÓ A ADN POLYMERASE

32
3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pfu và biến nạp vào £ coli.

32
3.3.2. Biểu hiện gen pfu trong vi khuđn £ co// BL21(DE3)pLysS 36

3.3.3. Tinh sạch PfuADN polymerase qua cột Ni-Agarose-NTA 39
3.3.4. Tinh sạch Pfu ADN polymerase qua cột Heparin-Sepharose 4B

41
3.4. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẮT CỦA PFU ADN POLYMERASE TÁI Tổ HỢP

43
3.4.1. Ảnh hưỏng của một số hợp chất khác nhau lên hoạt độ tổng hợp ADN của
Pfu ADN polymerase 43
3.4.2. Độ bến của chế phdm Pfu ADN polymerase
46
3.4.3. Một số tính chất khác của PfuADN polymerase 48
3.5. THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM PFU ADN POLYMERASE TÁI Tổ HƠP Ở MỘT SỐ c ơ SỞ
NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ 50
3.ó. MỘT SỐ KẾT QUÀ KHÁC (ĐÀO TAO, CÕNG B Ố ) 51
liẾ T LUẬN 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
Nghiên cửu sán xuãt enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ họp
Đề tài cấp trong điểm, ĐHQGHN, M ã số: QGTĐ.03.03
B Ặ T V Ấ> BỂ
ADN polymerase là nhóm enzym xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi
polydeoxyribonucleotid (ADN), vì vậy có vai trò rất quan trọng trong trao đổi chất
của ADN.
Nghiên cứu về ADN polymerase là một trong những cơ sở căn bản nhất để
hiểu được nguyên liệu di truyền (ADN) của các cơ thể sống được bảo tổn qua các
thế hệ cũng như được biểu hiện thành các tính trạng của cơ thể như thế nào. Hiểu
biết về các quá trình này cũng là cơ sở để phát triển các công nghệ sinh học. đặc biệt
là công nghệ sinh học hiện đại và các công nghệ liên quan.
Sự phát triển của các nghiên cứu về ADN polymerase đã dẫn đến sự ra đời
của kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) mà thực chất chính là kỹ thuật nhân

bản gen in vitro. Kể từ khi được phát minh (Saiki et al., 1985) cho đến nay PCR là
kỹ thuật được dùng phổ biến nhất và không thể thiếu trong các nghiên cứu về sinh
học phân tử.
Do tính chất lặp lại nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt
là sự biến tính ADN ở trên 90°c nên PCR đòi hỏi phải có các enzym ADN
polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá trình nhân bản ADN được thực
hiện dễ dàng và đặc hiệu.
Chính yêu cầu đó mà rất nhiểu ADN polym erase bền nhiệt đã được phát hiện,
sản xuất để sử dụng cho PCR. Trong số này phải kể đến Taq, Tma, Vent, Pfu, Pow
ADN polymerase. Các enzym này đều có tính chất chung là khả nãng thực hiện
phản ứng tổng hợp ADN từ 70°c trở lên và chịu được nhiệt độ trên 90°c trong một
vài giờ hoặc hơn thế. Tuy vậy, các ADN polymerase bền nhiệt thường khác nhau về
độ chính xác và khả năng kéo dài chuỗi trong nhân bản gen, do đó tuỳ thuộc mục
đích của nghiên cứu mà loại ADN polymerase nào thường được lựa chọn.
Pfu ADN polymerase (Pfit) là enzym bền nhiệt lần đầu tiên được tách ra từ vi
khuẩn cổ ưa nhiệt Pyrococcus furiosus (Lundberg et a i, 1991). Gen mã hoá của
enzym sau đó đã được nhân dòng và biểu hiện trong nhiều hệ thống vector khác
nhau (Lu & Erickson, 1997; Dabrowski & Kur, 1998) để tạo ra enzvm tái tổ hợp. Do
tính bền nhiệt và độ chính xác cao trong tổna hợp ADN nên enzvm được dùns phổ
biến trong PCR để nhân bản các gen phục vụ mục đích nhân dòna.
Mậc dầu vậy, ở Việt Nam, cho đến nay còn rất ít côna trình nshiên cứu về
ADN polymerase bền nhiệt, đặc biệt chưa có Cỏn2 trinh nào nahiên cứu sàn xuất các
enzym này bằng con đường tái tổ hợp. Đề tài này nhàm sản xuất chế phẩm enzym
Pfil
ADN polymerase chất lượng cao với giá thành hạ để 2Óp phần phục vu cho các
nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước.
Chít trì đề tải :PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học. Trường Dại học Khoa học Tự N lu en Ị
Nghiên cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đề tài cấp trong điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03_______________
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ ADN POLYMERASE
ADN polymerase là nhóm enzym xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi
polydeoxyribonucleotid từ các cơ chất là ADN sợi đơn làm khuôn có sắn với một
đoạn mồi, các deoxyribonucleosid tnphosphat (dNTPs) và trong môi trường có ion
Mg2+. Mồi ờ đây là một đoạn oligonucleotid dài từ 5 đến vài chục nucleotid có bản
chất ADN hoặc ARN. Trong điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, ADN polymerase
kéo dài mồi theo hướng 5'—>3’ bằng cách nối các nucleotid qua liên kết
phosphodiester theo trình tự bổ sung với sợi làm khuôn tạo nên chuỗi ADN mạch
kép. Ngoài hoạt tính kéo dài chuỗi oligonucleoúd hay còn được aọi là hoạt tính
ADN polymerase, một số ADN polymerase còn có hoạt tính của nuclease VỚI vai trò
sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp ADN được thực hiện chính xác. Trên
thực tế để đám bảo tính chuẩn xác cho quá trình sao chép ADN tế bào phải sử dụng
không chỉ một loại ADN polymerase (Bemad et a i, 1987; Komberg & Baker, 1991;
Hubscher et al., 2002).
Cho đến nay, rất nhiều loại ADN polymerase (ADN pol) khác nhau ớ cả sinh
vật nhán sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kv về tính chất,
cấu trúc cũng như chức năng. Ở sinh vặt nhân sơ điển hình là E. coli có tới 5 ADN
pol khác nhau và được ký hiệu là ADN pol I, II, III, IV và V. ơ sinh vật nhãn chuẩn
các ADN pol được phát hiện sớm nhất là ADN pol a , p, ỗ, £ và y. Trona những năm
gần đây, một loạt các ADN pol mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đó
là các ADN pol sao chép tổn thương (lession replicating enzymes) như ADN pol C.,
ADN pol T|, ADN pol I, ADN pol K, Revl và một nhóm các ADN pol khác được aọi
là ADN pol 9, ADN pol X, ADN pol ]a, ADN pol ơ, ADN pol <í> thực hiện các chức
năng khác. Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các ADN pol khác nhau đã
khẳng định rằng một loại ADN pol có thể không chi có một chức nãn2 và quá trình
tổng họp ADN trong các cơ thể có thể cần đến khôns chỉ một ADN pol, mà té báo
có thể sử dụng đồng thời một số ADN poỉ khác nhau cùng thực hiện một chức nãns
(Hubscher et aì., 2002).
Phần lớn các ADN pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptiđ chứa các
tiểu đơn vị chức năng khác nhau, trong đó không thể thiếu tiểu đơn vị polymer hoá.

Các tiểu đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ hoat tính đọc
Chù trì dẽ tải.PGS.TS.PIian Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đụi học Khoa học Tư Nhiên ■>
Nghiên cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bẵng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đề tài cấp trong điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03
sửa 3 ’-5’ exonucỉease, 5’-3’ exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mổi ARN
(primase) hay tương tác với yếu tố sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhãn tẽ bào
đang phân hóa (proliferating cell nuclear antigen - PCNA) với mục đích cuối cùng là
làm cho quá trình tổng hợp ADN diễn ra nhanh chóng và chính xác (Hubscher et al.,
2002).
Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các ADN
pol được chia thành 5 họ khác nhau là: A, B, c , X và Y. Mặc dù các ADN pol ỏ các
họ khác nhau có sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chún2 cũng có một vài đặc điểm
chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao sổm 3
vùng khác biệt: “lòng bàn tay” (palm), “ngón tay cái” (thumb) và “các ngón tav”
(fingers).
Trên cơ sở trình tự của ADN poỉ a , người ta đã phát hiện có 6 trinh tự (I-VI)
mang tính bảo thủ cao trên các ADN pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ
và virus với trật tự trên chuỗi polypeptid là IV-II-VI-III-I-V, còn khoàns cách giữa
các trình tự bảo thủ là khác nhau ở các loài khác nhau. Trình tự I nằm ở vùng “lòng
bàn tay” gần với vùng “ngón tay cái” và chứa một trong các gốc aspartic báo thủ tạo
thành trung tám xúc tác của tất cả các ADN pol họ B đã biết (với m otif YGDTDS).
Axit aspartic khác thuộc trình tự II có dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp (3 cũri2
thuộc vùng “lòng bàn tay”. Thuộc vùng này còn có SLYP-II mang tính báo thủ cao,
giữ vai trò quan trọng cho quá trinh liên kết dNTP. Mặc dù các motif này là tuyệt
đối bảo thủ ở các dưới họ ADN pol a và ADN pol ô nhưng ở ADN pol £ lại có sự
khác nhau đáng kể, motif trình tự I của ADN pol E là ELDTDG còn trình tư II là
DxxAMYPN. Các gốc khác có vai trò trong quá trinh liên kết dNTP num à trình tự
III và chúng cuộn gấp thành xoắn a nằm ở dưới vùng “các ngón tav” . Trình tư IV
nằm ở đầu N thuộc vùng có hoạt tính 3’-5’ exonuclease. Hai trình tự báo thủ khác V
và VI tương ứng nằm ở các dưới vùng “ngón tay cái” và “các nsón tay” (Joyce &

Steitz, 1994; Hubscher et al., 2002),
Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cấu trúc của các vùng giữa các ADN pol
sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhàn sơ và virus chứng tỏ các ADN pol này xuất phát
từ một gen tổ tiên chung. Cấu trúc của chúna đã được tối ưu hoá qua quá trinh tiến
hoá để thích hợp với các chức nãng chuyên hoá mà mỗi ADN pol thực hiện tron" tế
bào. Các vùng báo thủ nhất chịu trách nhiệm cho các chức năna xúc tác cơ ban và
cần thiết, trái lại các phần khác nhau giữa các ADN pol tiến hóa một cách độc lập đế
thực hiện các vai trò chuyên biệt (Lin et a i. 1990: Hubscher et a i, 2002).
Chù trì đề tài:PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa. Khoa Sinh học, Trường Đựĩ học Khoa học Tự Xlucii 3
Nghiên cứu sán xuãt enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đế tài cấp trong điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03
______________
Dưới đày là các đặc điểm chi tiết hơn về cấu trúc và chức nang của một sô
ADN pol chính đã được nghiên cứu ở sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn.
1.1.ì. Các ADN polymerase ở sinh vật nhân sơ
ADN polymerase lần đầu tiên được phát hiện là ở E. colỉ vào nãm 1955 và
được ký hiệu là ADN pol I (Komberg & Baker, 1991). Đây là enzym có một chuỗi
polypeptid vói khối lượng phân tử (KLPT) 103 kDa. Dưới tác dụng của protease,
ADN pol I bị phân cắt thành một mảnh nhỏ 36 kDa có hoạt tính 5 ’-3’ exonuclease
và một mảnh lớn 67 kDa được gọi là mảnh K lenow có hoạt tính polymerase và 3’-5’
exonuclease. Khi đi sâu nghiên cứu về chức nãng của ADN pol I, người ta thấy rằng
hoạt tính 3’-5’ exonuclease của enzym này có vai trò trong việc loại bỏ nucleotid bị
đưa nhầm vào chuỗi mới nhờ đó làm tăng độ chính xác hay tính trung thực của quá
trình tổng hợp, còn hoạt tính 5’-3’ exonuclease có vai trò trong việc loại bỏ đoạn
mổi ARN ban đầu của quá trình tổng hợp (Eckert & Kunkel, 1990; Turner er aỉ.,
1997). Nhờ có 3 loại hoạt tính trong cùng một phân tử nên ADN pol I của E. coli
được sử dụng phổ biến cho việc tạo mẫu dò ADN bằng kỹ thuật "dịch điểm dứt"
(nick translation). Việc phát hiện ra ADN pol I và cơ chế tác dụng của nó là tiền đề
cho việc tổng hợp thành cống ADN in vitro vào những năm cuối của thập kỷ 50, thế
kỷ hai mươi và là cơ sở cho sự ra đời của kỹ thuật nhân bản ADN (gen) in vitro hav

kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sau này. Tiếp sau các nshién cứu vé
ADN pol I, bốn ADN pol khác ở E. coli là ADN pol II, III, IV và V đã từng bước
được phát hiện và nghiên cứu. Các nghiên cứu về sau cho thấy nhiều sinh vật nhân
sơ cũng có các ADN pol tương tự như của E. coỉi.
Mặc dù có số phân tử trong một tế bào rất thấp (khoáno 10 phân tử) nhưns
ADN pol III được chứng minh là có vai trò chính trong quá trinh sao chép (Adam et
ư/., 1992) và ỉà enzym có cấu trúc phức tạp hơn nhiều so với ADN pol I. ADN pol
III là một dimer không đối xứng, có 10 tiểu đơn vị khác nhau a, £, 9, T, 7, õ, ô', / , (p,
(3 với KLPT gần 900 kDa. Tiểu đơn vị a m ans hoạt tính polymerase. Nsoài hoạt tính
tổng hợp ADN, ADN pol III còn có hoat tính 3’-5’ exonuclease nằm ở tiểu đơn VỊ Í-;
nên tỷ lệ lỗi trong sao chép ở E, coli là rất thấp, khoảng 10'10. ADN pol III còn la
enzym có tốc độ tons hợp chuỗi nhanh nhất khoảng 1000 nucleotid/siãỵ và cũng lu
enzym có khả nãng tổng hơp đoạn ADN dài nhất (Elliot & Elliot, 1997).
ADN pol II được phát hiện vào năm 1970. là enzvm thuóc họ B với một chuỗi
polypepúd có KLPT 120 kDa và được coi là enzym có chức năns sửa chữa chuyên
Chù trì đề tài:PGS.TS.PIian Tuấn Nghĩa. Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tư Nhicn 4
Nghiên cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tô hợp
Đê tài cấp trong điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03
hoá cao do hoạt tính 3’-5’ exonuclease. Tuy nhiên, enzym này không có hoạt tính
5’-3’ exonuclease. ADN pol II được mã hóa bởi gen poỉB (dinA) và được cảm ứng
sinh tổng hợp khi có sự sai hỏng ADN do tia tử ngoại (Pham et a i, 2001; Goodman,
2002).
Các enzym ADN pol IV và V được phát hiện gần đây thuộc họ Y, là họ ADN
pol sao chép tổn thương. ADN pol V tạo ra sự kết hợp nhầm G bổ sung với T thay VI
là A ở vị trí tổn thương. ADN pol IV cho phép kéo dài một cách hiệu quả các mồi
trong phức hợp khuôn mồi nhưng không có sự bắt cặp hoàn toàn nahiêm ngặt theo
nguyên tắc bổ sung, dẫn đến đột biến dịch khung, vì vậy nó được coi như là enzvm
tạo các đột biến thích nghi. Các thể đột biến kép về cả ADN pol II và ADN pol V có
độ mẫn cảm với u v cao hơn các tế bào chỉ thiếu ADN pol V. ADN poỉ II được cảm
ứng tổng hợp sau khoảng 1 phút khi tiếp xúc với

u v trong khi thời gian đối với
ADN pol V là 45 phút (Goodman, 2002).
1.1.2. Các ADN polymerase ỏ sinh vật nhân chuẩn
ADN pol a là ADN polymerase được phát hiện đầu tiên vào năm 1957 và
được coi là enzym chính trong quá trinh sao chép ADN ở sinh vật nhãn chuẩn. ADN
pol a gồm 4 chuỗi polypeptid khác nhau. Có 3 vùng ở phần tiểu đơn vị xúc tác p 180
của ADN pol a ở người: vùng đẩu N (axit amin 1-329) không cần thiết cho hoạt tính
xúc tác và cấu trúc lên phức hệ tetramer; vùng trung tâm (axit amin 330-1279) chứa
tất cả các trình tự bảo thủ chịu trách nhiệm cho quá trinh liên kết ADN, liên kết
dNTPs, và sự chuyển phospho; vùng đầu c (axit amin 1235-1465) không cần thiết
cho xúc tác nhưng cần cho quá trình tương tác với các tiểu đơn vị khác. ADN poỉ a
là ADN pol duy nhất mà 2 trong 3 tiểu đơn vị nhỏ của nó có hoạt tính ADN primase.
Gen mã hoá cho cả hai tiểu đơn vị mang hoạt tính primase từ nấm men bánh mì và
một số loài khác đã được nhàn dòng. So sánh tiểu đơn vị primase 49 kDa của nấm
men và chuột cho thấy chúng có tính bảo thủ cao về trình tự axit amin nửa đầu N
của chuỗi polypeptid và vùng liên kết với kim loại (Wang, 1991). Chuỗi polvpeptid
có KLPT trung bình (70 kDa) khôn? có hoạt tính xúc tác nhưng có vai trò liên kết
phức hệ ADN polymerase/ADN primase (Miller et a i, 1988). ADN pol a khôn<z có
khả năng sửa lỗi do không có hoạt tính exonuclease nên khống phải là thành phàn
duy nhất tham gia vào quá trình sao chép.
ADN pol 5 là một enzym có cấu trúc phức tạp, 2ồm các tiểu đơn vị khác nhau
ở các loài khác nhau. ADN pol 5 có 5 tiểu đơn vị (p 125, p55. p54. p40 và p22) ơ
Chù trì đé tài:PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên 5
Nghiên cứu sán xuảt enzym pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03_______________
Schizosaccharomyces pombe, có 4 tiểu đơn vị (pl25, p66, p50, pl 2) ờ động vật có
vú và có 3 đơn vị (pl25, p58 và p55) ở Saccharomyces cerevisiae, ADN pol ỗ tồn tại
trong các tế bào sinh vật nhân chuẩn dưới dạng các phức hệ có khối lượng phãn từ
cao và các tiểu đơn vị nhỏ đóng vai trò quan trọng cho sự tồn tại của nó.
ADN pol s bao gồm 4 tiểu đơn vị p2 6l, p59, p l7 và p l2 ở người; p256, p80.

p23 và p22 ở 5. cerevisiae. Trong cả 2 trường hợp hai tiểu đơn vị nhỏ tươn2 tác với
hai tiểu đơn vị lớn hơn tạo thành một phức hệ heterotetramer. ADN pol E cần thiết
cho sao chép ADN. Phần đầu N của ADN pol e của nấm men gồm các trinh tự bảo
thủ chứa tất cả các gốc xúc tác quan trọng.
ADN pol Ỵ có vai trò trong sao chép ADN ty thể nhưng được mã hoá bởi
ADN trong nhân (Insdorf & Bogenhagen, 1989; Hubscher et a i, 2002) và là một
protein heterodimer bao gồm một tiểu đơn vị lớn chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc
tác và một tiểu đơn vị nhỏ phụ trợ. Tiểu đơn vị lớn của ADN pol y ở người đã được
nhân dòng với 1239 axit amin, KLPT 139,5 kDa. Trình tự axit amin của ADN pol V
ở người giống tương ứng 42%, 43%, 49% và 78% với s. pombe, s. cerevìsiae, D.
melanogaster, và nửa đầu c của G. gallus. Tiểu đơn vị lớn (p 140) mang hoạt tính
ADN polymerase và cả hoạt tính 5 ’-3 ’ và 3’-5’ exonuclease. ADN pol 7 cũnạ có thê
xúc tác để loại bỏ nhóm 5 ’ deoxyribose phosphat. Tiểu đơn vị p55 kích thích cả hoạt
tính polymerase và exonuclease của pl40 và chứa các vùng riêng biệt cần thiết cho
sự liên kết VỚI p 140 và với ADN.
ADN pol p là một ADN polvmerase có KLPT thấp, chỉ tìm thấy ờ độns vật
có xương sống, không thấy ở nấm men hay các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp í W an”.
1991). ADN pol p ở người và các loài gặm nhấm là một chuỗi polypeptid đơn 39
kDa, chứa 335 gốc axit amin, với 2 vùng: vùng đầu N với kích thước 8 kDa có hoạt
tính 5 ’-deoxyribose phosphatase và liên kết ADN sợi đơn, vùng lớn hơn 31 kDa có
hoạt tính polymerase. ADN pol p còn được coi là một enzym sửa chữa ADN theo cơ
chế cắt bỏ base (base excision repair - BER). ADN pol [3 có vai trò trono tiếp hợp và
tái tổ hợp trong giảm phân.
Cùng với đặc điểm về cấu trúc và chức năng, hai tính chất quan trọna của các
ADN pol là mức độ kéo dài chuỗi (processivity) và độ trung thực hay độ chính xác
(fidelity) trong quá trình gắn các nucleotid vào mach đang tổng hợp cũng đà được
nghiên cứu.
Chủ trì dề lài.PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa. Khoa Sinh học, Trường Đai học Khoa học Tự Shicn 6
Độ kéo dài chuỗi của ADN pol a phụ thuộc vào nhiều yếu tô' như điều kiện
thí nghiệm, độ tinh sạch enzym, tính toàn vẹn của chuỗi polypepúd mang hoạt tính

xúc tác và các thành phần tiểu đơn vị của enzym. Mặc dù vậy độ kéo dài chuỗi vẫn
được sử dụng như một thông số để xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính
của ADN pol. ADN pol (3 là ADN pol nhỏ nhất ở tế bào nhân chuẩn, nhạv cảm với
aphidicolin, sulfhydryl, muối và butylphenyl-dGTP; không nhạy cảm với ddNTPs.
Độ kéo dài chuỗi của ADN pol (3 phụ thuộc vào sự có mặt của ion kim loại trong
phản ứng, khi có Mn2+ hoạt tính của enzym cao hơn khoảng 5 lần so với khi có mặt
của Mg2+. ADN pol 7 không nhạy cảm với aphidicolin nhưng nhạy cảm với N-
ethylmaleimide và bị ức chế bởi ddTTP. ADN pol y có độ kéo dài chuỗi cao tron2
quá trình tổng hợp ADN.
ADN pol ỗ và £ khác với các ADN pol khác ở chỗ có hoạt tính đọc sửa 3 ’-5’
exonuclease. Cả hai đều nhạy cảm với aphidicolin và không nhạy cảm với
butylphenyl-dGTP. Trong khi ADN pol ô bị kích thích bởi dimethyl sulfoxide
(DMSO) thì ADN pol E bị kim hãm bởi chất này. Hai enzym này khá khác nhau về
độ kéo dài chuỗi; ADN pol 8 có độ kéo dài chuỗi thấp với các khuôn sợi đơn dài
nhưng khi có mặt của PCNA, ADN pol ô có thể tổng hợp ADN hiệu quả hơn, vì vậy
PCNA được coi là một protein phụ trợ cho ADN pol ô. Ngược lại ADN pol 8 có độ
kéo dài chuỗi cao với khuôn này khi không có PCNA và hàm lượng M s2+ thấp.
Độ chính xác trong quá trình tổng hợp ADN của các ADN pol cũng là một
tính chất được quan tâm nghiên cứu đối với các ADN pol. Khôn? một enzvm nào
trong số 5 enzym chính của sinh vật nhân chuẩn có hoạt tính endonuclease cũns như
5 ’-3’ exonuclease. Các ADN pol y, 5 và s có hoạt tính 3 ’-5’ exonuclease. Mặc dù.
ADN pol a thiếu hoạt tính 3’- 5 ’ exonuclease nhưng tỷ lệ tổng hợp lỗi của enzym là
rất thấp. Hai yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của ADN pol a là tính nguyên vẹn
của phức hệ 4 tiểu đơn vị và sự có mặt của hoạt tính đọc sửa exonuclease. Hoat tính
đọc sửa ở tiểu đơn vị xúc tác lớn của ADN pol ct từ phôi ruồi dấm D. melơnogaster
đã được phát hiện khi tiểu đơn vị này được tách khỏi tiểu đơn vị 70 kDa. Nhờ có
hoạt tính exonuclease này mà độ chính xác trong quá trình tổng hợp ADN tăng sấp
100 lấn (W ang, 1991).
Ngoài chức nâng xúc tác, các ADN pol a, 5 , £ và 7 còn có các chức năns
khác như tham gia vào điều hoà chu trinh tế bào; duv trì telomer. sửa chữa ADN

theo một số cơ chế khác nhau (Goodman, 2002; Hubscher et a i, 2002) nhờ đo quá
Nghien cưu san xuãt enzym pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã sô: QGTĐ.03.03
____________________
Chù trì dè'rủi:PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa. Khoa Sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự Nhién 7
trình sao chép ADN được thực hiện theo một cơ chế chính xác cao. Tuy nhiên trong
quá trình tổng hợp, ADN có những vùng tổn thương có thể ngăn cản bộ máy sao
chép. Các ADN pol sao chép tổn thương (lession replicating pols) ị, rị, I, K, Revl có
thể khấc phục sự phong toả sao chép này. Nhiệm vụ của các ADN pol này là xác
định dạng tổn thương ADN và con đường tổng hợp ADN qua vùng tổn thươns.
Các ADN pol mới khác được phát hiện gần đây là 9, Ả, U, ơ, í£ và terminal
deoxynucleotidyl transferase có thể có những vai trò khác nhau trong quá trình sao
chép qua vùng tổn thương (Hubscher et al., 2002).
1.2. CÁC ADN POLYMERASE BEN NHIỆT
Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra
sự quan tâm đạc biệt của các nhà nghiên cứu đến các ADN pol bền nhiệt. Hàng loạt
ADN pol bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử
dụng cho PCR cũng như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử. Hầu hết các
ADN pol này đều hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt. Chúng có khả năng
xúc tác cho quá trình tổng hợp ADN ở nhiệt độ thậm chí trên 70°c, cần thiết cho sự
nhân bản đặc hiệu các đoạn ADN, cũng như chịu được nhiệt độ thậm chí trên 90°c,
thích hợp cho việc biến tính ADN (tách các chuỗi ADN thành các sợi đơn). ADN
pol bền nhiệt sử dụng rộng rãi nhất cho PCR và cũng được nghiên cứu kỹ nhất là
Taq ADN polymerase tách được từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermus aquaticus. Các
ADN pol bền nhiệt khác cũng trở thành những sản phẩm thương mại mà điển hình là
các ADN pol từ Thermus thermophilus (Tth), Thermotoga maritime! ợ ma),
Thermococcus lừoralis ('TU) và Pyrococcus furiosus (Pfil) V.V (Newton & Graham,
1994; Innis et a i, 1995).
1.2.1. /ơợADN polymerase
Taq ADN polymerase là ADN pol bền nhiệt tách được từ Thermits ac/uaticus.

cho đến nay, đâv là ADN pol được sử dụng phổ biến nhất trong PCR. Taq ADN
polymerase là một protein có 832 axit amin với KLPT 94 kDa. VI có trình tự tươns
đồng với ADN polymerase I ở E. coli nên Taq ADN polymerase được xếp vào ho A
(Eckert & Kunkel, 1990; Lawyer et ai., 1991; 1993).
Taq ADN polvmerase có tốc độ tổng hợp tối ưu 35-100 nucleotid/aiâv ờ 70-
80°c (nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzvm). Độ bền nhiệt của enzvm tính bàna
thời gian enzym mất một nửa hoạt độ xúc tác (T|/2) ở 95°c là 45 - 90 phút va ỡ
Ngtĩien cưu san xuảt enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tỏ hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGĨĐ.03.03
____________________
Chủ trì đề rài:PCS.TS.Phan Tuấn Nghĩa. Khoa Sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên 8
97,5°c là 9 phút. Xác suất đưa sai một nucleotid vào chuỗi khi tổng hợp ADN của
enzym là khoảng từ 3.10^ - 3.10'6, xác suất này còn phụ thuộc vào các điều kiện
phản ứng. Trong một phản ứng PCR chuẩn, sự khuyếch đại ADN bởi
Taq ADN pol
thích hợp nhất trong đệm Tris-HCl (10 mM), pH 8,3 có chứa 50 mM NaCl hoặc KC1
và 1,5 mM M gG 2(Innis et a i, 1995).
Taq ADN polymerase có hoạt tính 5 ’-3’ exonuclease để loại bỏ các nucleotid
phía 5 ’ của chuỗi đang tổng hợp, tuy nhiên enzym này không có hoạt tính đọc sửa
3’-5’ exonuclease. Ngoài hoạt tính tổng hợp chuỗi polynucleotid, 5 ’-3’ exonuclease.
Taq ADN polymerase còn có hoạt tính 3’-terminal transferase. Cự thể, enzym có thể
gắn nucleotid mang base nitơ adenin (A) vào đầu 3’-OH của chuỗi polvnuđeotiđ đã
được tổng hợp. Dựa vào hoạt tính này mà các nhà công nghệ gen có thể dễ dàna đưa
các đoạn gen được nhân bản bằng kỹ thuật PCR sử dụng Taq ADN polymerase vào
các vector nhân dòng dạng mạch hở có mang đầu T ở vị trí 3’ (Clark, 1988; Holland
et al., 1991).
Taq ADN pol đã được nhân dòng và một dạng biến đổi khác cũng đã được
biểu hiện ở E, coli (AmpliTaqR). AmpliTaqR có hoạt tính giống Taq ADN pol. Vỉ
AmpliTaqR là enzym tái tổ hợp nên độ tinh sạch và khả năng tái sản xuất enzym nàv
cao hơn so với Taq ADN pol.

Một dạng biến đổi của AmpliTaqR ADN pol tái tổ hợp là mánh Stoffel khi bỏ
867 bp của gen taq, tạo thành protein 544 axit amin với KLPT 61,3 kDa. Dạns này
không có hoạt tính 5 ’-3’ exonuclease. Mảnh Stoffel có độ bền nhiệt cao gấp 2 lan so
với Taq ADN pol và có hoạt tính tối ưu trên một phạm vi rộng nồng độ ion Mg:+,
tuy nhiên Stoffel của Taq ADN pol lại không hoạt động ở nhiệt độ cao hơn 80"c.
Điều này là bởi vì có sự khác nhau trong khả năng gắn với ADN ở nhiệt độ cao.
Mảnh Stoffel được sừ dụng cho quá trình khuvếch đại các khuôn siàu GC hay chứa
cấu trúc bậc hai phức tạp vì độ bền nhiệt cao sẽ cho phép sử dụng nhiệt độ biến tính
cao. Thiếu hoạt tính 5 ’-3’ exonuclease, mảnh Stoffel cho phép khuvếch đại các
khuôn vòng như ADN plasmid hiệu quả hơn. Mảnh Stoffel có hoạt tính tối ưu với
Mg2+ ở một phạm vi nồng độ khá rộng nên tiết kiệm đươc thời gian tối ưu hóa các
điểu kiện PCR. Điều này đạc biệt có lợi khi thực hiện PCR có từ 2 cặp mồi trở lẽn
(multiplex PCR) tức là có hai hoặc nhiều hơn hai trình tự đích được nhàn đổns thời
trong cùng phản ứng. Giông như Taq ADN poỉ, AmpliTaqR và mánh Stoffel ADN
poỉ cũng thường gắn thêm gốc A ở đầu 3’của các sản phám phản ứng.
ivgnien cưu san xuai enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tò hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGĨĐ.03.03
____________________
Chủ trì dé tài:PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học. Trường Dại học Khoa học Tự Xhiẽn 9
Nghiên cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Để tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03
______________
1.2.2. 77/ADN polymerase ( VenfADN polymerase)
TU ADN pol được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermococcus
litoralis được tìm thấy ở đáy đại dương với nhiệt độ khoảng 98°c. Tli ADN pol là
một ADN pol thuộc họ B, có trình tự giống với ADN pol a của người và ADN pol II
của E. coli hơn là ADN polymerase I của E. coỉi (Braithwaite &Ito, 1993). Enzym
này là một protein có KLPT 90-93 kDa, hoạt động tối thích ở 75 - 80°c và là một
enzym bển nhiệt hiếm có với T 1/2 là 8 giờ ở 95°c và gần 2 giờ ở 100°c. Enzvm kéo
dài mồi với tốc độ 67 nucleotid/giây. Xác suất đưa nucleotid sai vào là từ 3-5.10"5

(Cariello et al., 1991). Gen mã hóa enzym này cũng đã được nhãn dòng và biểu hiện
ở E. coli.
Một dẫn xuất thiếu hoạt tính exonuclease Vent (exo')™ và một dạna khác có
tính bền nhiệt cao hơn DeepVent™ cũng có sẵn trên thị trường. Vent™ ADN
polymerase bền nhiệt hơn so với Taq ADN polymerase và có khả năng kéo dài mồi
để thu được các sản phẩm có độ dài 8-13 kb. Vent™ ADN pol có hoạt tính 3’-5’
exonuclease đảm bảo độ chính xác cao hơn 5-15 lần so với Tơq ADN polymerase.
Vent™ ADN polymerase cũng tạo ra trên 90% các đoạn ADN đầu bằng nhờ đó làm
đơn giản hóa quá trình nhân dòng trực tiếp các sản phẩm PCR.
1.2.3. /%/ADN polymerase
Enzym này được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pvrococcus furiosus (Pfu)
chiếm ưu thế trong các chất lắng đọng của biển nóng ở Italia, sinh trưởng tối ưu ở
100°C. Pfu ADN polymerase thuộc họ B, là một protein có 775 axit amin với KLPT
khoảng 91 kDa. Trinh tự axit amin của Pfu ADN polvmerase tươn2 đổng với ADN
pol a (Slater et aỉ., 1998). ADN polymerase này cực kỳ bền nhiệt, vẫn siữ được hơn
95% hoạt độ ban đầu ở 95°c trong một giờ. Hoạt tính đọc sửa 3’-5’ exonuclease của
Pfu ADN polymerase làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp ADN. Xác suất
gắn sai một nucleotid của Pfil ADN polymerase khoảns 2.10'6. Độ chính xác trong
quá trình tổng hợp ADN của pfu ADN polvmerase cao hơn nhiều so với Taq ADN
polymerase và được xem là một trong số ít enzym có tốc độ tổna hợp ít lỏi nhất
trong tất cả các ADN polymerase bền nhiệt đã được nahiên cứu (Lundbers et
ứ/.,1991; Slater et al. 1998). Chính vì vậy, Pfu ADN polymerase được sử dụns phổ
biến để khuyếch đại các sản phẩm dùng cho mục đích nhân dòrì2 : biếu hiện hav
nghiên cứu các đột biến. Pfu ADN polymerase cũn2 có thể phối hợp cùns với Tuc/
ADN polymerase để khuyếch đại các đoạn ADN có kích thước lớn VỚI đô chính xác
Clui trì đẽ tải:PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Xhiữn 10
lớn hơn nhiều so với khi sử dụng Taq pol đơn lẻ. Tuy nhiên, cũng như Vent pol khi
thiết lập phản ứng cần bổ sung enzym vào sau cùng để tránh sự phàn hủy mồi và
khuôn bởi hoạt tính 3’-5’ exonuclease.
Pfu ADN polymerase của Stratagene có sẵn trên thị trường và là một dạng

đột biến của Pfu ADN polymerase làm cho thiếu hoạt tính exonuclease, được kí hiệu
là Pfu ex o \ Hoạt tính đặc hiệu ADN polymerase của dạng exo" cao hơn 10 lần so với
dạng Pfu exo+ nhưng Pfu exo" không có hoạt tính đọc sửa 3’-5’ exonuclease. Pfu
exo’ kết hợp [a-35S]dATP hiệu quả hơn 10 lần so với Taq ADN polymerase và vì vậy
cũng được ứng dụng trong các phản ứng đọc trình tự.
1.2.4. Tth ADN polymerase
Có 5 ADN polymerase đã được tách ra từ Thermus thermophilus Ợ th) trong
đó 2 dạng có hiệu quả đối với PCR. Tth ADN polymerase tái tổ hợp là một
polymerase bền nhiệt được biểu hiện trong E. coli trên cơ sở một gen ADN
polymerase của T. thermophilus được biến đổi và là một protein chứa 834 axit amin
với KLPT 94 kDa. Enzym này giống Taq ADN polymerase tới 88% về trình tự axit
amin. Tth ADN polymerase cũng bền với nhiệt như Taq ADN pol, hoạt độns tối
thích ở 75-80°C. Tuy nhiên giá trị T 1/2 của enzym này ở 95°c là 20 phút và ở 97,5°c
là 2 phút. Dưới những diều kiện dư thừa enzym ở 70°c, Tth ADN polvmerase kéo
dài mồi với tốc độ trúng bình 60 nucleotid/giây. Trong điều kiện PCR chuẩn, sự
khuyếch đại ADN bởi Tth ADN polymerase là tối thích trong đệm Tris-HCỈ (10
mM), pH 8,3 có chứa 100 mM KC1 và 2,0 mM MgClj. Giống như Taq ADN
polymerase, Tth ADN polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease và khônơ có hoạt
tính 3’-5’exonuclease. Khi có mặt của M n2+và ở nhiệt độ khoảns 70°c, enzvm này
có thể được sử dụng để sao chép ngược ARN một cách hiệu quả. Phản ứng PCR tiếp
theo có thể được thực hiện trong cùng một ống nhờ sử dụng hoạt tính ADN
polymerase đơn giản bằng cách bắt giữ M n2+ và bổ sung Mg:+. Vì thế sử dụns Tỉlì
ADN polymerase cho khuyếch đại cADN từ ARN bằng PCR có lợi thế so với cách
tổng hợp thông thường cần reverse transciptase (RT) để tổng hợp cADN sau đó đòi
hỏi ADN polymerase bền nhiệt cho giai đoạn PCR tiếp theo (Myers & Gelfand,
1991).
Độ bền nhiệt của hoạt tính RT của Tth ADN polymerase có ưu thế cho quá
trình khuyếch đại ADN từ các khuôn ARN chứa trình tự giàu GC hay có cấu trúc
Nghiên cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái lò hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã sô: QGTĐ.03.03

___________________
Chù trì đề tài PGSTS.Phun Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Tricờng Đại học Khoa học Tư Nhiẻn 1 1
Nghiên cứu sản xuất enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN lái tổ hợp
Đề tài cấp trong điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03_______________
bậc hai vì cần nhiệt độ cao để biến tính ARN khuôn. Tth ADN polymerase cũng
được sừ dụng để phát hiện và phân tích sự biểu hiện của gen ở mức ARN.
1.2.5. T/77ƠÂDN polymerase
Tma ADN polymerase là một protein có 893 axit amin với KLPT 103 kDa.
được tách ra từ khuẩn Gram (-) Thermotoga maritima siêu ưa nhiệt, sống ky khí ờ
suối nước nóng, sinh trưởng ở nhiệt độ trên 90°c. Taq ADN polymerase và Tma
ADN polymerase chỉ giống nhau 44% về trình tự axit amin. Tma ADN polymerase
giống ADN polymerase I ở E. coli ở chỗ có cả hoạt tính 3 ’-5’ và 5 ’-3’exonuclease.
Khi Tma ADN polymerase bị cắt đi một phần đầu thì tạo thành dạng enzym
thiếu hoạt tính 5’-3’ exonuclease, giống như mảnh Klenow và Stoffel. Enzym này
được tạo ra bởi sự dịch mã bắt đầu tại codon Met-,X4, kết quả tạo thành protein 70
kDa với 610 axit amin. Protein này vẫn còn hoạt tính polymerase cũng như hoạt tính
3’-5’ exonuclease. Enzym có độ bển nhiệt tương tự như T aq ADN polymerase, hoạt
động tối thích ở nhiệt độ 70 - 80°c, thậm chí giá trị T 1/2 của enzym cao hơn đáng kể
so với Taq ADN polymerase, giá trị này là 40 - 50 phút ở 97,5°c. Các nghiên cứu
bước đầu cho thấy độ chính trong PCR của enzym gần như 100% nhờ có hoạt tính
đọc sửa. Trong điều kiện PCR chuẩn, khuyếch đại ADN bởi M et2í<4 - Tmơ ADN
polymerase tối thích trong đệm Tris-HCl (10 mM), pH 8,8 có 10 mM KC1 và 2 mM
MgCl2 (Innis et a i, 1991).
1.3. NHÂN DÒNG VÀ BIÊU HIỆN ADN POLYMERASE
Các ADN polymerase đặc biệt là các ADN polymerase bền nhiệt đóng vai trò
quan trọng trong phản ứng PCR nên việc tìm kiếm các enzym này từ các sinh vật mà
chủ yếu là vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận
chế phẩm enzym trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn siản vì các vi khuẩn
này thường yêu cầu môi trường sinh trường đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và
enzym quan tâm chỉ được sàn xuất ở một lượng rất thấp (Kim et al 2002). Sàn xuất

các enzym này bằng công nghệ ADN tái tổ hợp hay kỹ nahệ gen là giải pháp ưu việt
nhất. Cùng với nhiểu protein khác, trên 50 gen mã hoá cho ADN polymerase đã
được nhãn dòng và đọc trình tự từ các sinh vật khác nhau và nhiều gen tron2 số
chúng đã được biểu hiện thành công (Dabrowski & Kur, 1998).
Taq ADN polymerase bền nhiệt đã được phát hiện và tinh sạch từ chùna vi
khuẩn ưa nhiệt Thermits aquaticus. Lawyer và tập thể đã dung hợp thành công aen
mã hoá Taq ADN polymerase của Thermus aquatỉcus với protein thực khuẩn the
Chù trì đẽ tài:PGSTS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đụi liọc Khoa hoc Tự Nhiên ] 2
Nghiên cứu sán xuât enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã sô': QGTĐ.03.03_______________
A.gtll cùng hệ thống promoter của operon lac và biểu hiện thành công aen này ở E.
coli (Lawyer, et al, 1989; 1993). Tuy vậy, Taq ADN polym erase không có hoạt tính
3’-5’ exonuclease nên không thể loại bỏ các nucleotid bị đưa nhầm vào chuỗi mới
được tổng hợp. Đó là nhược điểm của Taq pol và là lý do cần thiết cho việc tìm kiếm
các ADN polymerase ưa nhiệt ưu việt hơn như Tỉi, Pfư, Pwo ADN polymerase.
Marthur et al. (1991) đã nhân dòng gen mã hoá Pfu ADN polymerase từ
Pyrococcus furiosus. Graslund et al. (1997) và tập thể tạo phức hợp ADN
polymerase và protein G của Streptococcus có ái lực với albumin huyết thanh do đó
có thể tách được phức hợp bằng cột sắc ký ái lực và sau đó thu ADN polymerase
tinh sạch. Dabrowski và Kur (1998) dựa trên trình tự nucleotid của Pfu ADN
polymerase với kích thước 775 axitamin đã thiết kế cặp mồi Dell-LIC, Del2-LIC
nhân dòng thành công gen Ịvow mã hoá cho ADN polymerase từ p. woesei và tạo
ADN polymerase tái tổ hợp có gắn polyhistidin ở đầu N cho phép tách ADN
polymerase bằng sắc ký ái lực qua cột Ni-TED-Sepharose.
ở Việt Nam, áp dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, một số protein đã dược
nhàn dòng và biểu hiện thành cống trong vi khuẩn E. coli hoặc nấm men. Ví dụ như
trichobakin bất hoạt riboxom từ cây bầu bí (Đinh Duy Kháng et a i, 2000), a-
amylase từ Pseudoalteromonas halopỉanctis (Đỗ Thị Huyền et al., 2001). protein
bất hoạt riboxom của mướp đắng {Nguyễn Văn Đạt et a i , 2001), độc tố diệt sâu hại
CRYIA từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Lê Thị Thu Hiền eí a i. 2002), ADN

helicase (PDH45) cùa đậu Hà Lan Pisum sativum (Phạm Xuân Hội et al 2003).
Tuy nhiên cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về nhãn don" vù biếu
hiện các ADN polymerase bền nhiệt.
1.4. ỨNG DỤNG CỦA CÁC ADN POLYMERASE
Chức năng chủ yếu của các ADN pol là tổng hợp chuỗi polynucleotid và sưa
lỗi bằng cách loại bỏ các nucleotid không bổ sung VỚI sợi khuôn, đảm báo cho quá
trình tự nhân đôi của ADN được diễn ra một cách chính xác. Phần lớn các ADN pol
dùng ADN để làm khuôn cho sự tổng hợp. Tuy vậy, cũns có ADN pol đặc biệt có
khả năng phiên mã ngược sử dụng khuôn là ARN để tổng hợp ADN (Tth ADN
polymerase), Ngoài ra, cũns phải kể đến một hoạt tính terminal transferase của một
số ADN pol cho phép gắn nưcleotid vào đẩu phãn tử ADN có sẩn. Nhờ nhữns tính
chất này mà các ADN pol được ứng dụng rộn2 rãi trong sinh học phân tử.
Chít trì dể tài.PGS.TS.Phan Tnấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tư Slìiàn 1 3
Úng dụng phổ biến nhất của ADN chính là dùng trong việc xác định trình tự
nucleotid các gen. Bằng việc dựa trên ADN khuôn để tổng hợp các đoạn sợi ADN
mới chỉ khác nhau một nucleotid mà người ta có thể dễ dàng giải được trình tự của
ADN. Điều này chỉ đảm bảo chính xác khi ADN pol dùng để tổng hợp các đoạn
ADN mới tuân thủ nguyên tắc bổ sung một cách nghiêm ngặt.
Nhân bản các gen hay ADN bằng kỹ thuật PCR là ứng dụng phổ biến thứ hai
cùa các ADN pol. Cho đến nay, kỹ thuật PCR trở thành một phương pháp thườns
ngày và không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hay kỹ nahệ
gen. Điều này cũng nói lên rằng, các ADN pol, mà cụ thể là các ADN pol bền nhiệt
luôn luôn được cần đến.
Ngoài ra với một số ADN có hoạt tính đọc sửa và hoạt tính 5 ’-3’ exonuclease
như ADN pol I của E. coỉi thì được dùng trong kỹ thuật đánh dấu điểm đứt (nick
translation) để tạo mẫu dò có gắn đồng vị độ phóng xạ. Các mẫu dò tạo ra được sử
dụng cho các phép lai Southern (lai ADN-ADN), lai Northern (lai ARN-ADN) hay
South-Western (ADN-protein), là những kỹ thuật rất cơ bản của sinh học phàn tử.
Mặc dầu ADN pol, đặc biệt là các ADN pol bền nhiệt có ứng duns rộn" rãi
trong các nghiên cứu của sinh học phân tử và công nghệ sinh học, nhưng ớ Việt

Nam, việc nghiên cứu sản xuất nhóm enzym này bang công nghệ ADN tái tổ hơp
vẫn còn là vấn đề hoàn toàn mới mẻ, trong khi các chế phẩm ADN pol nhập nụoại
có giá thành rất cao. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi nhằm tạo ra một chế pham
ADN pol tái tổ hợp bền nhiệt, chất lượng cao với giá thành hạ phục vụ cho các
nghiên cứu về sinh học phân tử và công nghệ sinh học ở trong nước.
ivgnien cưu san xuat enzym Pfu ADN polymerase bằng công nghệ ADN tái tổ hợp
Đề tài cấp trọng điểm, ĐHQGHN, Mã số: QGTĐ.03.03____________________
Chủ trì dè rài:PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên 1 4