Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh Cao Bằng bằng nuôi cấy mô , tế bào thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
------------------------------




Nguyễn Minh Quế






ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ
MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ
TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2009


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
------------------------------





Nguyễn Minh Quế

ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ
MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ
TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ TÂM











Thái Nguyên, năm 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN
Để có được kết quả này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành
đến cô giáo - TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực
vật, phòng Di truyền - Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm, Đại học
Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN
và khoa Sau đại học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện
giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của gia đình và các bạn bè đồng
nghiệp.
Mặc dù có nhiều cố gắng, song không tránh khỏi những sai sót. Tôi rất
mong sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các quý thầy cô và các bạn.
Thái Nguyên, ngày 25 tháng 08 năm 2009
Tác giả











Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số liệu
trong công trình này là hoàn toàn trung thực, chính xác. Tôi xin chịu trách
nhiệm hoàn toàn về những kết quả này.

Tác giả


Nguyễn Minh Quế















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm hình thái và hệ thống phân loại dẻ
1.2. Vai trò của cây dẻ
1.3. Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân
giống và bảo tồn nguồn gen một số cây trồng
1.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong đánh giá mối quan hệ di truyền
của một số loài thực vật
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số mẫu
dẻ bằng kỹ thuật RAPD
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền giữa một số mẫu dẻ bằng
kỹ thuật RAPD
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu lá dẻ
3.1.2. Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR - RAPD
3.1.3. Mối quan hệ di truyền của các mẫu dẻ nghiên cứu
3.2. Kết quả của nhân giống vô tính dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng
kỹ thuật in vitro
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của cồn 70
o
và javen 65% đến
khử trùng hạt
1
3
3
7

7

12

16
16
16
16
19
19
22

26
26

26
27
31
34

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng
nhân chồi của dẻ Trùng Khánh trong ống nghiệm
3.2.3. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ
3.2.4. Kết quả đƣa cây ra ngoài môi trƣờng tự nhiên
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC
35

42
44
48
50
51
56



















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản môi trƣờng WPM
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotid của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên
cứu
Bảng 3.1. Hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA của 5 mẫu dẻ nghiên cứu
Bảng 3.2. Đa hình về phân đoạn DNA đƣợc nhân bản của 10 mồi ngẫu
nhiên
Bảng 3.3. Hàm lƣợng thông tin tính đa hình (PIC) của 5 mẫu dẻ
Bảng 3.4. Giá trị tƣơng quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tƣơng
đồng .
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng giữa các mẫu dẻ nghiên cứu
Bảng 3.6. Kết quả khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của tổ hợp kinetin và BAP đến sự phát sinh chồi
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo cụm
chồi
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ dẻ
Bảng 3.11. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên
17
19

26
27

28
32

32
34
36

39
41

43
45








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Các mẫu lá dẻ đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu dẻ trên gel agarose
0,8%
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi
TN03 và DTN2
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 5 mẫu dẻ với mồi
DTN1 và OPM5
Hình 3.4. Biểu đồ hình cây các mẫu dẻ nghiên cứu theo hệ số của
Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA
Hình 3.5. Các giai đoạn trong tạo nguyên liệu khởi đầu
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của BAP đến sự tạo chồi
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của BAP + kinetin đến sự tạo chồi
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi dẻ
Hình 3.9. Cây dẻ ra rễ
Hình 3.10. Cây dẻ con trồng ngoài môi trƣờng tự nhiên với các giá thể

khác nhau
Hình 3.11. Cây dẻ trồng ngoài môi trƣờng tự nhiên sau 20 tuần
16
26

29

30

33

35
37
40
42
44
46

47








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 1 -

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, rất
thuận lợi cho sự phát triển của thực vật nên rừng chiếm một diện tích lớn.
Rừng cung cấp nguồn lâm sản, góp phần cân bằng môi trường sinh thái và
điều hoà khí hậu. Từ đầu thế kỉ XX, rừng bị tàn phá nặng nề một phần do
chiến tranh và một phần do tập quán du canh, di cư, đốt nương, làm rẫy, chặt
phá rừng bừa bãi. Nguồn tài nguyên rừng bị cạn kiệt gây ô nhiễm môi trường
làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người và các sinh vật sống
trên trái đất. Trong những năm gần đây, Đảng và nhà nước đã có nhiều chính
sách khuyến khích trồng cây gây rừng, phủ xanh đất trống đồi núi trọc và xoá
đói giảm nghèo.
Dẻ là một trong những loại cây rừng được khuyến khích trồng vì cây dẻ
có giá trị kinh tế cao [14]. Các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, hạt đều có thể sử
dụng [4]. Cây dẻ sống thích hợp trên điều kiện đất đồi núi khô hạn và nghèo
dinh dưỡng [3]. Cách trồng dẻ hiện nay chủ yếu bằng phương pháp cắt cành
hoặc cây con bầu đất trong khi hệ số nhân chồi thấp nên lâu cho thu hoạch và
hiệu quả chưa cao. Họ dẻ ở Việt Nam không lớn lắm nên việc nhận biết
không mấy khó khăn. Tuy nhiên, việc phân biệt các chi trong họ lại khó còn
việc định loại các loài trong các chi lớn lại càng khó khăn hơn [4].
Từ những năm 80 của thế kỷ XX trở lại đây, hàng loạt kỹ thuật sinh
học phân tử như: PCR, AFLP, RAPD, RFLP, SSR... đã và đang được ứng
dụng vào các lĩnh vực: Phân tích và đánh giá hệ gen của thực vật nhằm xác
định những thay đổi của dòng được chọn lọc ở mức độ phân tử; sử dụng các
chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian
chọn tạo giống; đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài; phân lập và chuyển
gen có giá trị kinh tế để nâng cao chất lượng và khả năng chống chịu với các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 2 -

điều kiện bất lợi cuả môi trường... Thành công của sinh học phân tử hiện đại
đã góp phần nâng cao năng suất và chất lượng các giống cây trồng [5], [12].
Để đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và góp phần vào
việc bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng, chúng tôi chọn đề
tài: "Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu
bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô - tế bào thực vật".
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân tích mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật sinh
học phân tử.
- Nghiên cứu môi trường và quy trình nhân giống in vitro dẻ Trùng
Khánh - Cao Bằng nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ bằng kỹ thuật RAPD.
3.2. Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ
thuật nuôi cấy in vitro.
- Khử trùng mẫu: Thăm dò nồng độ cồn, javen và thời gian thích hợp
để khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh.
- Nhân chồi: Tìm hiểu môi trường tạo chồi thông qua nghiên cứu ảnh
hưởng riêng rẽ và tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin và nhóm auxin.
- Tạo cây hoàn chỉnh: Tìm hiểu môi trường tạo rễ thông qua nghiên cứu
ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin.
- Đưa cây ra môi trường tự nhiên: Nghiên cứu giá thể và điều kiện thích
hợp để đưa cây dẻ con tạo được qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm ra trồng
ngoài môi trường.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- 3 -


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm hình thái và hệ thống phân loại dẻ
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Các cây trong họ dẻ thường chỉ gặp một dạng sống (habitus) là cây thân
gỗ thường xanh, ít rụng lá trong mùa khô. Tuy nhiên, kích thước của chúng có
thể rất thay đổi, tồn tại ở cả 3 dạng: cây bụi (loài Lithocarpus chicocarpa,
Lithocapus eucalyptifolius, Quercus arbutifolia), cây gỗ trung bình và cây gỗ
lớn (ở các loài thuộc chi Lithocarpus, Quercus) với chiều cao dao động từ 5m
- 50m và đường kính từ 1m - 1,3m [4].
Thân cây thường mọc thẳng đứng, phân nhiều cành, đôi khi có bạnh gỗ
(các loài thuộc chi Lithocarpus campylolepis, Quercus quangtriensis, v.v.).
Tuy hầu hết các loài trong họ dẻ là những cây cao, nhưng đôi khi gặp cả
những dạng “cây lùn” có chiều cao khoảng 8m - 12m, đường kính thân
khoảng 40cm - 50cm (ví dụ: Castanopsis scortechinii, Lithocarpus
pachycarpus, Quercus thorelii, v.v). Vỏ cây thường là vỏ dày và ăn sâu vào
lớp dác gỗ ngoài. Cành con có lỗ vỏ bì (bì khổng, bì khẩu - lenticular) cũng là
đặc điểm đặc trưng ở các loài thuộc họ dẻ [4], [27].
Chồi đỉnh là một cấu trúc phức tạp gồm nhiều lá bắc dạng vảy chụm
với nhau ở đỉnh cành. Trong họ dẻ, chồi đỉnh có thể mọc phân tán hoặc kết
cụm. Lá trong họ dẻ là lá đơn, phiến lá nguyên; phần lớn có lá kèm, mọc
cách, xếp xoắn lại hoặc xếp thành 2 dãy đều đặn trên cành nhưng đôi khi
chụm lại ở gần đầu cành con. Gân lá dạng lông chim. Gân chính đôi khi xếp
nổi rõ trên cả 2 mặt. Gân bên thường chỉ nổi rõ ở mặt dưới, cong ở mép hoặc
song song. Lá kèm thường khá lớn và mau rụng, có dạng hình trứng, hình
lưỡi, mũi mác, đính bởi gốc chung nhưng đôi khi có hình khiên với cuống ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- 4 -


giữa phiến. Vị trí đính của lá kèm thường ở ngoài cuống lá, nhưng cũng có
khi xen với cuống [4].
Hoa ở họ dẻ phần lớn là hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm
hình xim. Các hoa thường chụm thành bó lưỡng phân trên một trục riêng dài
hay ngắn và tạo thành cụm hoa dạng bông đuôi sóc. Cụm hoa là đơn tính,
lưỡng tính hay hỗn hợp. Hoa không có cánh và thụ phấn nhờ gió hoặc sâu bọ
thứ sinh. Quả dẻ thuộc loại quả đặc biệt và thường được gọi là kiểu “quả đấu”
(trước đây gọi là “quả kiên”) [4], [27].
1.1.2. Hệ thống phân loại
1.1.2.1. Họ dẻ (Fagaceae)
Theo Heywood (1993), họ dẻ (Fagaceae) có 8 chi với khoảng 900 -
1000 loài và được chia thành 3 phân họ là: subfam.FAGOIDEAE (gồm chi
Fagus và Nothofagus), Subfam.CASTANEOIDEAE (gồm chi Castanea,
castanopsis, Lythocarpus và Chrysolepsis) và subfam.QUERCOIDEAE (gồm
chi Trigonobalanus và Quercus). Trong đó, ở Việt Nam có 6 chi (Castanea,
Castanopsis, Fagus, Lithocarpus, Quercus và Trigonobalamus) với khoảng
210 loài, được xếp vào 3 phân họ. Có 3 chi lớn là: Castanopsis (trên 50 loài),
Lithocarpus (khoảng 110 loài) và Quercus (trên 40 loài). Các chi khác chỉ có
từ 1 đến 2 loài [4], [8]. Họ dẻ phân bố phổ biến ở vùng cận nhiệt đới và ôn
đới của cả 2 bán cầu [27].
Đặc điểm quan trọng nhất để phân biệt các chi trong họ là cấu tạo của
cụm hoa và đặc biệt là cấu tạo của đấu với những đặc điểm cấu trúc bên ngoài
vỏ đấu. Trong trường hợp gặp những dạng đấu trung gian, rất khó xác định
chính xác chúng thuộc Lithocarpus hay Quercus hoặc thậm chí cả
Castanopsis. Đó là các loại đấu có các vảy (hay gai) rất nhỏ (đôi khi không
nhìn rõ). Chúng tạo nên ở bề mặt ngoài của những vòng (hay quầng) đồng
tâm. Thêm nữa, đấu lại bao gần kín các hạch [4].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 5 -


1.1.2. Chi dẻ Castanea Mill, 1754 (dẻ, dẻ Trùng Khánh)
Chi này gồm dẻ Phansipan (Castanea phansipanensis A.camus) và dẻ
Trùng Khánh (Castaneae mollissima Blume) hợp thành.
Cây gỗ trung bình đến cây gỗ lớn. Chồi đỉnh phân tán, các vảy xếp lợp.
Lá không có điểm tuyến, xếp xoắn đều đặn và không chụm lại ở đỉnh cành.
Mép lá có răng cưa ở nửa ngọn. Lá kèm ngoài cuống, đính bởi gốc. Cụm hoa
lưỡng tính (hoa cái ở phần dưới, hoa đực ở đỉnh ngọn), dạng bông (đuôi sóc),
ở trên 1 trục dài, gồm các xim rút ngắn, các xim mọc thẳng đứng. Xim đực
gồm 3 - 7 hoa, hoa đực có 6 mảnh bao hoa, thường có nhị lép, nhị 10 - 12, bao
phấn nhỏ, rất ngắn (cỡ 0,25mm - 0,35mm), đính lưng và lắc lư, trung đới
không nhọn đầu. Mầm đấu (Cupule primordial) hình thành trước lúc hoa nở.
Hoa cái mẫu 6, bao gồm 6 mảnh khá phát triển, có 10 - 12 nhuỵ lép, bầu 3 (6)
ô, vòi nhuỵ 3 (6), hình nón hay trụ, núm nhuỵ ở đỉnh, hình chấm nhỏ. Đấu
bao kín quả, có gai nhọn, chứa (1) 2 (3) hạch, khi chín thường tách thành 4
đến nhiều mảnh. Hạch tròn cạnh góc trên mặt cắt ngang [4].
Dẻ Trùng Khánh được trồng nhiều ở Sơn La, Lai Châu, Lạng Sơn và
chủ yếu ở Trùng Khánh - Cao Bằng. Ở Trung Quốc cũng có loại dẻ này phân
bố chủ yếu ở Vân Nam và Quảng Tây [3].
Dẻ Trùng Khánh thuộc loại cây gỗ lớn, cao từ 20m - 25m, đường kính
tới 100cm. Cây ưa sáng, phát triển trên đất hoang hoá vùng đá vôi chua, ở độ
cao 500m - 2000m. Ra hoa tháng 2 - 3 hàng năm, cho thu hoạch quả vào
tháng 10 - 12 hàng năm [3].
Trong chi có 12 loài phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc. Ở Việt Nam
có 2 loài, trong đó có 1 loài nhập trồng [4].
1.1.3. Chi dẻ Castanopsis (D.don) Spach, 1841, nom. Cons. (dẻ gai, cà ổi,
kha thụ)

Là chi lớn gồm 120 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới
Châu Á. Ở Việt Nam có trên 50 loài [3]. Dẻ gai Bắc Giang thuộc chi này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 6 -


Cây gỗ trung bình đến gỗ to, phần lớn lá thường xanh. Chồi đỉnh phân
tán (không kết cụm), hình trứng hay hình bầu dục; các vảy xếp lợp hoặc đôi
khi có xu hướng xếp thành 2 dãy. Vỏ cây dai, dễ bóc, có nhiều xơ sợi dài và
đan chéo; tia vỏ nhỏ, cao 10mm - 40mm, lấn sâu vào dác gỗ < 1mm. Lá
không có điểm tuyến, xếp xoắn đều đặn và không kết chụm lại ở đỉnh cành;
mép nguyên hoặc đôi khi có răng cưa nhỏ ở nửa ngọn. Lá kèm ngoài cuống,
đính bởi gốc. Cụm hoa gồm những xim lưỡng phân dày đặc hoặc gồm 1 hoa
duy nhất, đơn tính (chỉ mang 1 thứ hoa), ít khi lưỡng tính (hoa cái ở phần
dưới, hoa đực ở phần ngọn) hay hỗn hợp, dạng bông (gié, đuôi sóc) ở trên 1
trục dài, gồm các xim rất ngắn. Gié đực luôn luôn mọc thẳng đứng. Hoa đực
có bao hoa hình chuông xẻ (5) 6 (7) thuỳ, có nhuỵ lép; nhị (10) 12 (15); bao
phấn rất ngắn (cỡ 0,25mm - 0,35mm), đính lưng và lắc lư; trung đới không
nhọn đầu. Đấu có gai, mầm đấu hình thành trước lúc hoa nở, đơn độc, có các
đường nối dọc rõ, với 2 - 4 (8) điểm phát triển riêng biệt, bao quanh 1 - 3 (7)
hoa cái. Hoa cái có bao hoa hình chuông, xẻ (5) 6 (7) thuỳ, có 10 - 12 nhị lép;
bầu 3 (6) ô (không bị bẹt); vòi nhuỵ 3 - 5, hình nón hay hình trụ; núm nhuỵ ở
đỉnh, hình chấm nhỏ. Đấu có cuống ngắn hoặc không có cuống, có gai hay gai
nhỏ hoặc đôi khi có vảy, hay có khi đấu gần như nhẵn, hoàn toàn bao kín 1 - 3
(7) hạch, khi chín nẻ van hoặc thường tách không đều thành nhiều mảnh.
Hạch tròn, cạnh góc trên mặt cắt ngang. Lá mầm phẳng, lồi. Sự nảy mầm
dưới đất [4], [27].
Castanopsis boisii Hickel & Camus, 1922 (dẻ gai Yên Thế, dẻ gai
Bắc Giang)
Là cây gỗ trung bình, cao khoảng 5m - 20m. Cây ưa sáng, thường mọc

thành quần thụ, phát triển nhanh trên đất cát pha, ra hoa tháng 10 - 12, mang quả
tháng 8 - 10 (VFT). Phân bố chủ yếu ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Giang, Quảng
Ninh [3], [27].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 7 -


1.2. Vai trò của cây dẻ
Dẻ có gỗ tốt, có thể dùng trong xây dựng, làm nhà, làm nông cụ, đóng
thuyền, làm bao bì. Hạt dẻ có chứa nhiều tanin, nhiều loại ăn ngon [3].
Dẻ Trùng Khánh có gỗ khá nặng, có thể dùng trong xây dựng, lá có thể
để nuôi tằm. Hoa đực khô dùng làm thuốc sát trùng. Ăn hạt dẻ chữa thận hư,
gối lưng yếu liệt, đi đứng khó khăn. Hạt dẻ nướng ăn hoặc tán bột uống chữa
trong lạnh, đi tả như xối; hạt dẻ hầm chữa trẻ lở miệng; vỏ đen của hạt dẻ sắc
uống chữa nôn ói, ỉa ra máu; vỏ gai của quả sắc uống chữa gân cốt đau nhức,
giã đắp đơn sưng, tràng nhạc; hoa sắc uống chữa tràng nhạc, sa đì (viêm tinh
hoàn) [3].
Hạt dẻ là loại quả có hương vị thơm ngon, bùi ngậy, ăn hạt dẻ có tác
dụng chống oxy hoá trong máu, có lợi cho tim mạch [38].
Theo số liệu phân tích của viện rau quả năm 1999, trong hạt dẻ Trùng
Khánh có tỉ lệ các thành phần như sau: glucose 3,3% - 5,4%; gluxit 43,36% -
46,67%; lipit 1,16% - 2%; protein 3,12% - 3,62% [38].
1.3. Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân giống
và bảo tồn nguồn gen một số cây trồng
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những
năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân
giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây
sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…
[5].
Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp

dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty
giống cây trồng khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi
cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường
này hàng năm vào khoảng 15% [5].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 8 -


Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy
in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối
tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa,
cây cảnh, cây dược liệu…
Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do
nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng
phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng
loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo
ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt.
Pơmu (Fokienia hodginsii (Dun) A. Henry & H.H. Thomas) được xếp
vào loại cây gỗ quý hiếm ở Việt Nam. Gỗ pơmu bền, đẹp, thơm được dùng
nhiều trong xây dựng và làm đồ thủ công mỹ nghệ. Hiện nay, pơmu đang bị
khai thác mạnh nên số lượng giảm nhanh. Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh
(2007) sử dụng chồi đỉnh lấy từ cây 1 - 1,5 tuổi nuôi cấy trên môi trường
WPM, 1/2 WPM, 1/2 MS bổ sung BAP, IAA, NAA, IBA, kinetin, Rib và
nước dừa. Kết quả cho thấy, môi trường WPM là khoáng cơ bản thích hợp
nhất cho nuôi cấy chồi đỉnh; tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất ở môi trường WPM
bổ sung kết hợp BAP 0,1mg/l + IBA 0,3mg/l. Khi bổ sung một số chất hữu cơ
như: ngô, dịch chiết nấm men, glutamine vào môi trường nuôi cấy đã nhận
thấy rằng môi trường có nghiệm thức WPM + BAP 0,1mg/l + dịch chiết nấm
men 1g/l có khả năng nhân chồi cao nhất. Nghiên cứu khả năng vươn thân và
ra rễ đã nhận thấy cây pơmu vươn thân tốt nhất trong môi trường WPM +

IBA 0,3mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l, rễ nhiều và dài nhất trên môi trường
WPM + IBA 5mg/l sau 45 ngày nuôi cấy [2].
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là loài cây quý hiếm được dùng
trong dược liệu. Hiện nay, thông đỏ đang đứng trước nguy cơ bị cạn kiệt.
Phục hồi lại rừng thông đỏ theo phương pháp truyền thống chủ yếu là giâm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 9 -


cành và cây con bầu đất. Tuy nhiên, cây thông đỏ sinh trưởng chậm nên hiệu
quả các phương pháp này chưa cao để phục vụ khai thác và sử dụng cho công
nghiệp trong thời gian dài. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định,
Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi
cấy. Chồi non sau khi được vô trùng bằng hypochlorite natrium được nuôi cấy
trên môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP. Nghiên cứu ảnh
hưởng của chất chống hoá nâu, ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuôi cấy, tuổi mẫu
đến sự phát sinh chồi in vitro, đến tỉ lệ ngã nghiêng chồi thông in vitro, ảnh
hưởng của điều kiện nuôi cấy thông khí và cường độ chiếu sáng đến sinh
trưởng chồi thông đỏ in vitro cho thấy: AgNO
3
có hiệu quả trong việc hạn chế
sự tiết nhựa đỏ vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát sinh chồi; chồi
thông đỏ phát sinh cao nhất từ ngọn chính, tuổi mẫu 18 tháng. Môi trường bổ
sung BAP 5mg/l + kinetin 1mg/l + AgNO
3
150mg/l thích hợp cho nuôi cấy
phát sinh chồi. Điều kiện chiếu sáng thích hợp là 11,4 - 22,8 µmol/m
2
/s và

đậy bằng nắp giấy. Cây thông đỏ ra rễ tốt nhất sau 75 ngày nuôi cấy trên môi
trường WPM có bổ sung NAA 1mg/l kết hợp Rhizopon 50mg/l [10].
Được xếp vào loại gỗ quý hiếm thuộc nhóm 1, nhưng hiện nay, trai
Nam Bộ là loại cây đang bị đe doạ rất nguy cấp và có nguy cơ tuyệt chủng tự
nhiên cao. Vi nhân giống cây trai Nam Bộ được tác giả Khưu Hoàng Minh,
Trần Văn Minh (2007) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý
đang bị tuyệt diệt và tạo giống cây sạch bệnh phục vụ công tác tái sinh rừng.
Mẫu trai thực sinh được vô trùng tốt nhất khi sử dụng kết hợp hypochlorit -
Ca 25% trong 20 - 32 phút với HgCl
2
0,05% trong 15 phút. Môi trường
khoáng cơ bản thích hợp với cây trai Nam Bộ là WPM. Khả năng tạo cụm
chồi tốt nhất ở môi trường bổ sung BAP 1mg/l và môi trường bổ sung BAP
0,5mg/l là thích hợp nhất với nhân cụm chồi; khả năng vươn thân tốt nhất ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 10 -


môi trường có bổ sung nước dừa 10%; cây ra rễ tốt nhất trên môi trường có bổ
sung IBA 0,3mg/l [23].
Trần văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), nhân nhanh loài gỗ quý giá
ty (Tectona Grandis Linn.F.) với nguyên liệu ban đầu là chồi đỉnh cây giá ty
nhập nội, môi trường nuôi cấy chồi đỉnh là MS và WPM, chồi non được sử
dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. Các tác giả cũng đã xây dựng
thành công quy trình nhân giống in vitro và đưa cây con ra ngoài môi trường
tự nhiên [25].
Nhằm phục vụ công tác chuyển gen, nhóm tác giả Bùi Văn Thắng, Hà
Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007) đã xây dựng hoàn chỉnh
hệ thống tái sinh cây xoan ta (Melia azedarach L.). Hệ thống tái sinh cây
xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua cảm ứng cụm chồi từ mảnh lá mầm với tỉ

lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 98% và 7,3 chồi/mảnh cấy khi nuôi trên môi
trường MS có bổ sung vitamin B5 + BAP 6,65µM+ kinetin 0,46µM +
surcrose3%. Kéo dài chồi dạt 97% với chiều cao trung bình là 28,7mm khi
cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung vitamin B5 + IBA 0,88µM +
surcrose 2% nuôi trong 4 ngày. Sau đó, cây xoan ta được cấy sang môi trường
MS + surcrose 1% không có chất điều hoà sinh trưởng. Cây mô chuyển từ
điều kiện in vitro ra trồng trong nhà lưới, sinh trưởng, phát triển bình thường
[32].
Trên một số cây giống cây trồng rừng có năng suất và chất lượng cao
khác chúng ta cũng đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro
[19].
Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh
lục đỏ. Nhiều cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do bị khai thác mạnh
phục vụ cho việc sản xuất trên quy mô công nghiệp. Để bảo tồn nguồn gen
những cây thuốc quý này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 11 -


giả nghiên cứu hoàn thiện như: nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper
methysticum G. Forster) có hoạt tính sinh học cao (Đinh Đoàn Long và cs
(2004)) [18]. Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Pack Kee Youep đã nuôi
cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamnenis Ha et Grush v.) trên
môi trường MS cơ bản. Kết quả mô sẹo hình thành sau 4 tuần nuôi cấy với
nồng độ tối ưu là 2,4-D 1mg/l. Nuôi cấy mô sẹo trên môi trường có bổ sung
IBA và NAA thấy rằng số rễ con hình thành trên môi trường bổ sung IBA lớn
hơn rất nhiều trên môi trường bổ sung NAA (tỉ lệ tạo rễ ở môi trường bổ sung
IBA là 89% còn trên môi trường bổ sung NAA là 76%). Nồng độ đường tối
ưu cho sự sinh trưởng rễ bất định sâm Ngọc Linh là 50g/l với trọng lượng khô
đạt 1,75g [31]. Với công trình dòng hoá cây thanh hao (Artemisia annua L.)

in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống
trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi
phát triển về cả chiều cao và số lượng. Khi bổ sung BAP, NAA và 2,4-D
riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và
2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ. Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/l và NAA
0,5mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có
tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi
cấy tăng sinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA
0,5mg/l. Qua nghiên cứu cũng thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma trong
điều kiện có chiếu sáng trên môi trường bán rắn và lỏng [38].
Có thế mạnh là nằm trong khu vực thuận lợi cho nhiều loại hoa phát
triển đặc biệt là các loại hoa vùng nhiệt đới, việc nghiên cứu hoàn thiện quy
trình nhân giống các loại hoa nhằm sản xuất trên quy mô công nghiệp và phục
vụ xuất khẩu được nhiều tác giả quan tâm. Trong lĩnh vực này, chúng ta đã
thu được một số thành tựu đáng kể như: Nghiên cứu phương thức nhân nhanh
một số giống hoa cúc chùm Hà Lan (Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 12 -


Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999)) [1]; tái sinh in vitro cây cúc (Dandrenthema
morifolium L.) và bước đầu chuyển gen ipt làm chậm sự lão hoá (Nguyễn
Hữu Hổ, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh
(2007)) [15]…
1.4. Ứng dụng của kĩ thuật RAPD trong đánh giá mối quan hệ di truyền
của một số loài thực vật
RAPD (Random Amplyfied Polymorphysm DNA) là kỹ thuật mới được
ứng dụng trong những năm gần đây ở Việt Nam. RAPD có nhiều ưu điểm nổi
bật như: có khả năng phát hiện hiện tượng đa hình DNA trên một phạm vi
rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, ít tốn kém, không cần biết trước trình tự

gen của đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng DNA không cần độ tinh sạch
cao… [40]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD là kỹ thuật đem lại hiệu quả
cao trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và sự đa dạng di truyền,
nghiên cứu nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền của thực vật. Vì vậy, kỹ
thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để
đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy.
Việt Nam là một nước nông nghiệp với sản lượng xuất khẩu lương
thực, thực phẩm cao trên thế giới nên cây lương thực, thực phẩm được nhiều
tác giả quan tâm nghên cứu. Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền
của một số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu và Nguyễn
Thị Hoa Lan (2003) đã phân tích đa dạng di truyền giữa 12 giống lạc là L02,
L03, L05, L08, L12, L15, L16, LVT, Sen Nghệ An, Đỏ Bắc Giang, Phú Thọ.
Phân tích hệ gen 12 giống lạc với 5 mồi phản ứng ngẫu nhiên nhận được 32
phân đoạn DNA, trong đó có 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9%, 4 mồi cho
kết quả đa hình là RA31, RA36 , RA46 và RA142. Kết quả phân tích RAPD
đã cho thấy DNA của 12 giống lạc có cấu trúc khác nhau giữa các giống lạc
có sự sai khác di truyền với hệ số từ 0,03 - 0,13 [21].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 13 -


Lúa là cây lương thực chủ yếu ở Việt Nam. Trong những năm gần đây,
sản lượng lúa xuất khẩu của Việt Nam luôn đứng thứ 2 trên thế giới. Nhằm
chọn, tạo ra những giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt đáp ứng thị hiếu
khách hàng, hàng loạt các nghiên cứu về cây lúa đã được các tác giả tiến
hành. Nguyễn Đức Thành, Phạm Duy Toản, Nguyễn Hoàng Anh (2000) đã
ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD và STS trong nghiên cứu đa dạng di truyền
và chọn giống ở lúa [30]. Lúa cạn là cây lương thực giữ vị trí quan trọng
trong đời sống người dân miền núi, góp phần cung cấp lương thực tại chỗ cho
những vùng khó khăn. Cây lúa cạn có chất lượng gạo tốt, thơm, dẻo, khả năng

kháng được sâu bệnh cao, có thể gieo trồng được ở những nơi không chủ
động được nước tưới. Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng về kiểu gen và
kiểu hình chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương miền núi, Chu Hoàng
Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh
(2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 tỉnh Sơn La, Bắc Kạn, Cao
Bằng và đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền giữa
các giống lúa cạn là 7,69 - 34% và hệ số đa dạng di truyền của hệ gen lúa cạn
Hg = 52,37% [22]. Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống
lúa cạn, Lò Thị Mai Thu, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh,
Nguyễn Thị Bình (2008) tiếp tục đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ
phân tử DNA bằng kỹ thuật RAPD, xác định mối quan hệ di truyền giữa các
giống lúa cạn, tạo cơ sở cho việc tuyển chọn giống lúa cạn chịu hạn làm vật
liệu chọn giống, góp phần vào bảo tồn và phát triển nguồn gen cây lúa cạn
miền núi. Kết quả đã nhân bản được 182 phân đoạn DNA từ hệ gen của 7
giống lúa cạn. Năm mồi sử dụng cho nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình,
tính đa hình cao được thể hiện ở các mồi M4, M7, M13 (trong đó mồi M13 có
100% phân đoạn đa hình). Trên cơ sở đó, các tác giả đã chia các giống lúa cạn
nghiên cứu thành 2 nhóm chính: nhóm thứ nhất gồm 3 giống (LC, CB2, SL1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 14 -


và nhóm thứ 2 gồm 4 giống (CB1, HG, SL2, LCh) với hệ số khác nhau là
26%. Hai giống HG và SL1 có khả năng chịu hạn tốt nhất, đồng thời cũng có
hệ số tương đồng di truyền cao nhất (97%) được xếp vào cùng một nhóm
[34].
Cây ăn quả cũng là một trong những thế mạnh của nông nghiệp Việt
Nam. Tuy nhiên, chất lượng các giống cây khác nhau cũng như chất lượng
của cùng một loại cây ở các vùng sinh thái khác nhau lại có sự khác biệt. Vì
vậy, nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các giống cây trong cùng vùng

sinh thái và giữa các giống cây khác nhau trong cùng một loài nhằm tìm ra
loại cây và điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của chúng là vấn đề quan
trọng. Trong lĩnh vực này, chúng ta đã đạt được một số kết quả như: Nghiên
cứu tính đa dạng di truyền của các giống nhãn trồng ở Việt Nam của tác giả
Nguyễn Văn Thiết, Lê Thị Lan Oanh (2001) [33]; sử dụng kĩ thuật RAPD và
AFLP để nghiên cứu quan hệ di truyền của 2 giống vải thiều và vải chua của
Nguyễn Thị Dung và cs (2005) [9], sử dụng dấu chuẩn RAPD để nhận dạng 1
số giống chuối trồng ở Việt Nam (Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh,
Nguyễn Thị Dung (1998)) [34], đánh giá đa dạng nguồn gen xoài Việt Nam
(Mangifera) bằng kĩ thuật RAPD (Nguyễn Ngọc Huệ, Trần Danh Sửu, Trịnh
Hồng Kiên (2005)) [16].
Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và DNA lục lạp) trong nghiên cứu đa
dạng di truyền và xây dựng vườn giống cây cóc hành, Nguyễn Việt Cường,
Phạm Đức Tuấn (2007) đã tiến hành nghiên cứu 40 dòng cây trội cóc hành
(Azadirachta excalsa) được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn ở 6
xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh Ninh Thuận. Mồi sử dụng cho
nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên gồm OPC10, OPC18, OPC14, OPC20,
OPB17, OPC13 và 2 mồi lục lạp gồm rnH - trnK và atpB - rbcL. Kết quả, các
dòng cóc hành được nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền thấp mặc dù các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 15 -


cây trội được chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng cách về không gian
khá xa. Có 6 cặp cóc hành có hệ số tương đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981
là cặp X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37. Các
dòng cóc hành có quan hệ di truyền gần gũi cần loại khi xây dựng vườn giống
là X11, X22, X35, X37, X43, X43, X50. Đây là kết quả nghiên cứu bước đầu
về đa dạng di truyền (mới sử dụng 6 mồi RAPD và 2 mồi lục lạp) [7].
Dẻ là cây trồng rừng chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc như Cao

Bằng, Bắc Giang, Lào Cai, Sơn La… Hiện đã có một số công trình nghiên
cứu về cây dẻ trên các phương diện khác nhau như: nghiên cứu thực trạng và
giải pháp chủ yếu nhằm phát triển sản xuất hạt dẻ ở tỉnh Cao Bằng của Ngô
Xuân Hoàng (2008) [14], nghiên cứu cơ sở phân loại họ dẻ - Fagaceae
Durmort ở Việt Nam của Nguyễn Tiến Bân [4]. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện
nay chưa có công trình nào nghiên cứu về việc nhân giống in vitro cây dẻ
Trùng Khánh - Cao Bằng và mối quan hệ di truyền giữa các giống dẻ bằng kỹ
thuật sinh học phân tử.












Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 16 -


Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Ba mẫu hạt dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng thu hoạch tại các địa điểm
khác nhau của huyện Trùng Khánh - Cao Bằng vào tháng 9 - 10 năm 2008.

Hạt dẻ thu tại Vân Nam - Trung Quốc tháng 11/2008
Hạt dẻ gai thu tại Yên Thế - Bắc Giang tháng 11/2008
A B



1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Hình 2.1. Các mẫu lá dẻ được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử thu
được từ 5 mẫu hạt dẻ
A: Mặt trước lá B: Mặt sau lá
1. Dẻ Trung Quốc 2, 3, 4. Ba mẫu dẻ Trùng Khánh 5. Dẻ Bắc Giang
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô
Các dụng cụ và hoá chất cần thiết để thực hiện quá trình nuôi cấy do
phòng Công nghệ tế bào, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái
Nguyên cung cấp.
* Dụng cụ
Buồng cấy vô trùng (Bioiogical safety Cabinets)
Nồi hấp khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy - Nhật Bản
Cân điện tử của Đức
Máy đo pH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- 17 -


Tủ sấy
Bình tam giác có kích thước từ 250ml - 500ml, pipet loại 1ml, dụng cụ
nuôi cấy...
* Hoá chất
Hoá chất pha môi trường WPM gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng,

kích thích sinh trưởng, đường sucrose, thạch agar, nước dừa.v.v.
Thành phần hoá chất của môi trường WPM dành cho cây thân gỗ được
trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản môi trường WPM (Lioyd và Mc Cown, 1980)
STT Thành phần Nồng độ
(mg/l)
STT Thành phần Nồng độ
(mg/l)
WPM1
11 CoCl
2
.6H
2
O 8,6
1 KH
2
PO
4
170 12 CuSO
4
.5H
2
O 0,25
2 K
2
SO
4
990 13 Na
2
MoO

4
.2H
2
O 0,25
3 MgSO
4
.7H
2
O 370
WPM 4
4 NH
4
NO
3
400 14 FeSO
4
.7H
2
O 27,8
WPM 2
15 Na
2
EDTA 37,3
5 CaCl
2
96
WPM 5
6 Ca(NO
3
)

2
.4H
2
O 550 16 Glicin 2,0
WPM 3
17 Thiamine HCl 1,0
7 H
3
BO
3
6,2 18 Pyridoxin HCl 0,5
8 KI 6,2 19 Nicotic acid 0,5
9 MnSO
4
.4H
2
O 22,3 20 Mio - inositol 100
10 ZnSO
4
.7H
2
O 8,6 21 Agar 8,5 g/l
22 Sucrose 20-30 g/l
* Phƣơng pháp pha chất kích thích sinh trƣởng
Chất kích thích sinh trưởng thường pha với một lượng ít vì các chất này
khi ở dạng dung dịch khó bảo quản. Trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã sử