Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật tt115200

Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng
nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật

Lê Thị Thanh

Trường đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội
Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 01 14
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tường Vân, PGS.TS. Võ Thị Thương Lan
Năm bảo vệ: 2013


Abstract. Thiết kế thành công các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3. Đồng thời
các đoạn gen này đã được dòng hóa thành công vào vector tách dòng pBT/T và lưu
trữ trong tế bào vi khuẩn E. coli DH 5α. Thiết kế thành công các vector chuyển gen
pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW-35S-ltb-gp3 bằng kỹ
thuật Gateway qua hai phản ứng BP và LR. Tạo được các chủng Agrobacterium
tumefaciens mang các vector chuyển gen trên. Đã chuyển thành công các gen ltb-
gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Sàng lọc được dòng BY-2 mang gen ltb-gp5 biểu hiện
ra sản phẩm protein.

Keywords. Tế bào thực vật; Vi rút PRRS; Sinh học thực nghiệm; Thiết kế Vector;
Gen

Content

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2007), Báo cáo kết quả thực hiện kế
hoạch 12 tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2007.
2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008), Báo cáo kết quả thực hiện kế
hoạch 12 tháng năm 2008, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2008.
3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Báo cáo kết quả thực hiện kế
hoạch 12 tháng năm 2009, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2009.
4. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2010), Báo cáo kết quả thực hiện kế
hoạch 12 tháng năm 2010, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2010.
5. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2011), Báo cáo kết quả thực hiện kế
hoạch 12 tháng năm 2011, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2011.
6. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2012), Báo cáo kết quả thực hiện kế
hoạch 12 tháng năm 2012, Báo cáo thống kê tháng 12 năm 2012.
7. Bùi Mỹ Duyên (2012), Thiết kế vector biểu hiện một số kháng nguyên của virus
lợn tai xanh (PRRSV) trong tế bào thuốc lá, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh
học, Đại học Mở.
8. Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Ky
̀
, Nguyê
̃
n Văn Long, Tiêu Quang An (2008), “Mô
̣

t
số đă
̣
c điê
̉
m di
̣
ch tê
̃
Hô
̣
i chƣ
́
ng sinh sa
̉
n va
̀
hô hấp (PRRS) ở lợn từ cuối tha
́
ng 3
đến đầu tháng 7/2008 tại một số tỉnh trong cả nƣớc” , Tạp ch Khoa học và Kỹ
thuâ
̣
t Thu
́
y, (5), tr. 14-20.
9. Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hƣơng,Trần Quang Vui,
Phạm Công Hoạt, Nguyễn Bá Hiến (2009), “Phân tích gen M mã hoá protein
màng của virus gây bệnh lợn tai xanh”, Tạp ch Khoa học và Phát triển, (7), tr.
282 – 290.

10. Nguyễn Thị Thanh Huyền, Chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào tế bào
thuốc lá BY-2 nhằm biểu hiện protein HA của vius H5N1, Khóa luận tốt nghiệp
Cử nhân Sinh học, Đại học Mở.
11. Võ Thị Thƣơng Lan (2004), Sinh ho
̣
c phân tư
̉
, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia
Hà Nội.
12. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Công
nghệ gen trong nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông Lâm, Đại học Huế.
13. Lê Quy
̀
nh Liên , Phan Tro
̣
ng Hoa
̀
ng , Đỗ Xuân Đồng , Chu Hoa
̀
ng Ha
̀
, Lê Trần
Bình (2008), “Biểu hiện kháng nguyên glycoprotein của virus dại trên cây thuốc
lá chuyển gen”, Tạp ch CNSH, (6), tr. 445-452.
14. Đinh Đoa
̀
n Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sơ
̉
di truyền ho
̣

c phân tư
̉
va
̀
tế ba
̀
o ,
Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
15. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản
Giáo dục Việt nam.
16. Trịnh Thị Trang Nhung (2010), Biểu hiện và tinh sạch peptide kháng khuẩn
Cecropin, Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
17. Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), “Công nghệ gen thực
vật”, Hội nghị Khoa học và công nghệ 2007,5, tr 345-411.
18. Nguyễn Tƣờng Vân (2011), “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein vỏ
Glycoprotein (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu
tƣơng”, Thuyết minh nhiệm vụ hợp tác quốc tế về KH&CN theo Nghị định thƣ,
tr. 1-25.
Tài liệu tiếng Anh
19. Ansari, I.H., Kwon, B., Osorio, F.A., Pattnaik, A.K. (2006), “Influence of N-
linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing
antibodies”, J. Virol, (80), pp. 3994–4004.
20. Arakawa T, Chong DK, Merritt JL and Langridge WH (1997),
“Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato
plants”, Transgenic Research, (6), pp. 403-413.
21. Arntzen C, Plotkin S, Dodet B (2008), “Plant-derived vaccines and antibodies:
potential and limitations”, Vaccine, (23), pp. 1753–1756.
22. Aziz MA, Singh S, Kumar PA and Bhatnagar R (2002), “Expression of

protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine
against anthrax”, Biochemical and Biophysical Research Communications,
(299), pp. 345-351.
23. Chia MY, Hsiao SH, Chan HT, Do YY, Huang PL, Chang HW, Tsai YC, Lin
CM, Pang VF, Jeng CR (2010), “Immunogenicity of recombinant GP5 protein
of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed in tobacco
plant”, Vet Immunol Immunopathol, 135, pp. 234-242.
24. Dalsgaard K, Uttenthal A. Jones TD, Xu F. Merryweather A, Hamilton WDO,
Langcveld JPM, Boshuizen RS, Karnstrup S. Lomonossoff GP, Porta C, Vela
C, Casa] JI, Meloen RH, Rodgers PB (1997), “Plant-derived vaccine protects
target animals against a viral disease”, Nat Biotechnol, 15, pp. 248-252.
25. Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001), “Medical molecular farming:
production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants”,
Trends Plant Sci, 6, pp. 219-226.
26. Diaz I, Darwich L, Pappaterra G, Pujols J, Mateu E (2006), “Different
European-type vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome
virus have different immunological properties and confer different protection to
pigs”, Virology, 351, pp. 249–259.
27. Dus Santos MI, Wigdorovitz A, Trono K, Rios RD, Franzone PM, Gil F,
Moreno J, Carrillo C, Escnihano IM, Borca MV (2002), “A novel methodology
to develop a toot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in
transgenic plants”, Vaccine, 20, pp. 1141-1147.
28. Feng Y, Zhao T, Tung Nguyen, Inui K, Ma Y, Nguyen Thi Hoa, Nguyen Van
Cam , Liu D , Bui Quang Anh, To Long Thanh , Wang C, Tian K, and Gao GF
(2008), “Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants,
Vietnam and China in 2007”, Emerging Infectious Diseases, 14, pp. 1774-1776.
29. Hou YH, Chen J, Tong GZ, Tian ZJ, Zhou YJ, Li GX, Li X, Peng JM, An TQ,
Yang HC (2008), “A recombinant plasmid co-expressing swine ubiquitin and
the GP5 encoding-gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
induces protective immunity in piglets”, Vaccine, 26, pp. 1438–1449.

30. Invitrogen (2010), Gateway® Technology, Version E, Catalog nos. 12535-019
and 12535-027.
31. Jani D, Meena LS, Rizwan UHQM, Singh Y, Sharma AK and Tyagi AK
(2002), “Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants”,
Transgenic Res, 1, pp. 447-454.
32. Jiang W, Jiang P, Li Y, Tang J, Wang X, Ma S (2006a), “Recombinant
adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and
respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune
responses in mice”, Vet. Immunol, 113, pp. 169–180.
33. Jiang W, Jiang P, Wang X, Li Y, Wang X, Du Y (2007), “Influence of porcine
reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein N-linked
glycans on immune responses in mice”, Virus Genes, 35, pp. 663–671.
34. Jiang Y, Xiao S, Fang L, Yu X, Song Y, Niu C, Chen H (2006b), “DNA
vaccines co-expressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and
respiratory syndrome virus (PRRSV) display enhanced immunogenicity”,
Vaccine, 24, pp. 2869–2879.
35. Kim TG, Gruber A and Langridge WHR (2004), “HIV-1 gp 120 V3 cholera
toxin B subunit fusion gene expression in transgenic potato”, Protein
Expression and Purification, 37, pp. 196-202.
36. Lamphear BJ, Jilka JM, Kest L, Welter M, Howard JA, Streatfield Si (2004),
“A corn-based delivery system or animal vaccines: an oral transmissible
gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine”, Virology,
22, pp. 2420-2424.
37. Lauterslager TGM, Florack DEA, Wal TJV, Molthoff JW, Langeveld JPM,
Bosch D, Boersma WJA and Hilgers LAT (2001), “Oral immunisation of
naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LTB”,
Vaccine, 19, pp. 2749-2755.
38. Mason HS, Warzecha H, Mor T and Arntzen CJ. (2002), “Edible plant
vaccines: application for prophylactic and therapeutic molecular medicine”,
Trends in Molecular Medicine, 8, pp. 324-329.

39. Ostrowski M, Galeota JA, Jar AM, Platt KB, Osorio FA, Lopez OJ (2002),
“Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine
reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain”, J. Virol, 76, pp.
4241–4250.
40. Palmer K E, Schnippenkoetter WH, Rybicki EP (1998), “Geminivirus isolation
and DNA extraction”. In Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to
Transgenic Resistance, pp. 41-52. Edited by G. Foster & S. Taylor. Totowa,
NJ:Humana Press.
41. Perlak FJ, Fuchs RL, Dean DA, McPherson SL and Fishhoff DA (1991),
“Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect
control protein genes”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 3324-3328.
42. Plagemann PG (2004), “GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and
respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus”, Virus Res, 102, pp. 225–230.
43. Rebay Lab (2013), Transformation of Bacteria via Electroporation Protocol.
44. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume
1, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
45. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume
2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
46. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume
3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
47. Streatfield SJ and JA Howard (2003), “Plant-based vaccines”, Int. J. Parasitol,
33, pp. 479-493.
48. Thermo sciencetific (2006), CloneJET
TM
PCR Cloning Kit procedure.
49. Thermo sciencetific (2008-2009), Molecular Biology Catalog and Product
Application guide.
50. Thermo Scientific (2006), GeneJET Gel Extraction Kit Procedure.
51. Thermo Scientific (2006), GeneJE
TTM

PCR Purification Kit Procedure.
52. Thermo Scientific (2006), GeneJET™ RNA Purification Kit Procedure.
53. Thermo Scientific (2006), RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
Procedure.
54. Wasin Charerntantanakul (2012), “Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects”,
Virology, 1(1): 23-30
55. Zheng Q, Chen D, Li P, Bi Z, Cao R, Zhou B, Chen P (2007), “Co-expressing
GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified
vaccinia virus ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and
cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome
virus (PRRSV)”, Virus Genes, 35, pp. 585–595.
Trang web
56. />/electroporation.htm
57. www.bio.utk.edu/cellbiol/prot/by2-medium.pdf
58. tocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/DNA/DNA_Extraction_Purification/DNA_
Extraction_from_Plants/
59.
60.
61.
62. />syndrome-prrs