Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl CoA reductase từ cây bạch đàn uro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




LÊ PHƢƠNG DUNG




PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL
ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN
GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA
REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS
UROPHYLLA S.T. BLAKE)



LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC








Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

THAI NGUYEN UNIVERSITY
COLLEGE OF EDUCATION



LE PHUONG DUNG



CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL
ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT
TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA
REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE

Speciality: Genetics
Code: 60.42.70



MASTER’S THESIS SUMMARY



Supervisor: Dr. Nguyen Huu Cuong

Thai Nguyen, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả
nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa có ai công bố trong
một công trình nào khác.


Tác giả

Lê Phƣơng Dung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC


MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................
1.1. Tổng quan về cây bạch đàn .........................................................................
1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam ........................................................
1.3. Tình hình sinh trƣởng của cây bạch đàn ở Việt Nam …………………….
1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .....................................
1.4.1. Lignin ..................................................................................................
1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật .............................................
1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase
(CAD)
1.5. Tổng quan về promoter ...............................................................................
1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. .......................

1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter ....................................................
1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học ...........................
1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark
not defined.
1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................
2.1. Vật liệu nghiên cứu .....................................................................................
2.1.1. Vật liệu: ...............................................................................................
2.1.2. Hoá chất: ..............................................................................................
2.1.3. Máy móc, thiết bị .................................................................................
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.2.1. Phƣơng pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme
CAD trên ngân hàng gen quốc tế .......................................................................
2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter. ....................................
2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ ....................................
2.3.4. Tổng hợp cDNA
2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng
PCR .....
2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng .......................................................................
2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error!
Bookmark not defined.
2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự của gen. ...............................................
2.2.9. Phƣơng pháp Gateway. ........................................................................
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................
3.1. Tách chiết DNA bạch đàn...........................................................................
3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR .................................................................
3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD ..............................
3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp ....................................

3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ................
3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. .....................................
3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp ...................................................................
3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2....

3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của
promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T
Blake..... ............................................................................................................
3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl
alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ...................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19
Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 21
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA ... 22
Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23
Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23
Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ... 24
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR ... 24
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ..26
Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid .. 28
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt ... 29
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR ...29
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ... 31
Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ... 32

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR ... 33
Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR .. 34
Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi ... 35
Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R ...
52
Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp
pBENDER/CCR bằng XhoI ... 64







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin …………………………………... 9
Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật .................................................. 10
Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)..15
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ......................................................... 25
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT ..................................................................................... 26
Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR ........................................... 30
Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTR
TM
/D-TOPO

......................................................... 31
Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER .................................................................... 32

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ....................... 34
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 .................... 35
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 .................... 36
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch.....37
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37
Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................... 39
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .....41
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .... 41
Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter
CAD1 ................................................................................................................ 43
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter
CAD2 ................................................................................................................. 44
Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và
CAD2 ................................................................................................................. 45
Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii ............ 46
Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………….. 48
Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% .............................. 51
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA ................................................................ 51
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR .......................................... 53
Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% .... 54
Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR ..................... 56
Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả
biến E.Coli DH5 ...... 56
Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR .... 58
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR ...
59
Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R
.... 61

Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR .... 61
Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI .. 62
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng
Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu
Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến
quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật,
Viện Công nghệ sinh học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN
cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công
nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động
viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn
này.

Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009
Học viên



Lê Phương Dung


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
cDNA Complementary DNA
DNA Deoxyribonucleic Acid
DEPC Diethyl pyrocarbonate
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid
g/l Gam/lít
IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside
Kb Kilobase
kDa KiloDalton
LB Luria Bertani
mg/l miligam/lít
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
SDS Sodium dodecyl sulphate
TAE Tris - Acetic acide - EDTA
Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase
TE Tris – EDTA
v/p vòng/phút
X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƯỚC
1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng. NXB Nông nghiệp, Hà
Nội, tr. 311- 317.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục, tr101-112.
3. Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng. Trường
công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr. 96 – 100.
4. Nguyễn Dương Tài (1994). Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn
Eucalyptus urophylla S.T. Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ,
Việt Nam. Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp
Việt Nam.
5. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực
vật. NXB Hà Nội, tr 214 – 221.
6. Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã
rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú. Tóm tắt luận án tiến
sĩ sinh học. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24trang.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
7. A. Baghdady, A.-S. Blervacq, L. Jouanin, J. Grima-Pettenati, P. Sivadon, S.
Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in
lignifying cells during primary and secondary xylem formation in
Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 44, pp. 674–683.
8. Aldwin M. Anterola, Norman G. Lewis (2002), Trends in lignin
modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic
manipulations/mutations on lignification and vascular integrity.
Phytochemistry 61 (2002) 221–294.
9. Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway©
technology.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10. Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto
D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol
dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and
expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15.
11. Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in
Lignin Formation in Wood. NABC Report.
12. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4.
13. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima
P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol
dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular
Biology. 4(27): 651-667.
14. Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B.
Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes,
cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2
(CAD2). Molecular Breeding 12: 107–118, 2003.
15. Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction
procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter.
3(9): 262-266.
16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau
A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J.
(2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem,
regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant
Journal. 43(4): 553-567.
17. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003),
Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in
transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C.
(1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of
promoter activity in transgenic Poplar. Plant Physiology. 113: 321-325.

19. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai
C.J. & Chiang V.L. (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes
cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature
Biotechnology. 17: 808-812.
20. Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H.
Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt,
Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic
Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl
CoA reductase (CCR). Transgenic Res (2008) 17:379–392
21. Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L.,
Davin L.B., Kang C., Lewis N.G. (2004), Functional reclassification of
the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in
Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences.
101:1455-1460.
22. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and
Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:
Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.
Plant Physiol 113: 321-325.
23. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J.
(2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii
cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among
woody and herbaceous plant species. Plant molecular biology. 50(3): 497-
509.
24. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M.
Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin,
Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
decrease in lignin content without significant alteration of plant
development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl
CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in

tobacco plants. The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270.
25. pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006). Invitrogen
26. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York.
27. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and
Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase:
Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar.
Plant Physiol 113: 321-325.
28. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa,
Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki
Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA reductase, a key
enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in
defense signaling in rice. PNAS vol. 103 no. 1, pg. 230–235.
28. Whettena R. and Sederoffa R. (1995), Lignin Biosynthesis. The Plant Cell.
7: 1001-1013.
29. Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X. (2004), A Simple Protocol for Isolating
Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and
PCR Analyses. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g.

TÀI LIỆU WEB
30.
31. />c=061.0.
32.
33.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Phụ lục 1. Kết quả phân tích độ tương đồng giữa 26 loài thực vật
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
1 Zea_mays
2 Arabidopsis_thaliana 0.49

3 Lycopersicon_esculentum 0.52 0.38
4 Hordeum_vulgare 0.17 0.42 0.49
5 Triticum_aestivum 0.18 0.43 0.51 0.05
6 Vitis_vinifera 1.00 0.94 0.86 0.91 0.96
7 Solanum_tuberosum 0.46 0.36 0.19 0.45 0.49 0.94
8 Saccharum_officinarum 0.07 0.48 0.53 0.15 0.19 0.98 0.47
9 Populus_trichocarpa 0.39 0.34 0.28 0.36 0.38 0.87 0.27 0.39
10 Prunus_persica 0.41 0.35 0.30 0.39 0.40 0.80 0.24 0.42 0.21
11 Capsicum_annuum 0.43 0.36 0.19 0.40 0.43 0.88 0.09 0.43 0.27 0.25
12 Fragaria_ananassa 0.39 0.34 0.32 0.38 0.41 0.89 0.25 0.41 0.25 0.16 0.25
13 Eucalyptus_globulus 1.34 1.31 1.24 1.25 1.24 1.63 1.28 1.40 1.28 1.33 1.22 1.33
14 Linum_album 0.39 0.36 0.33 0.39 0.41 0.87 0.31 0.41 0.27 0.29 0.30 0.28 1.27
15 Eucalyptus_gunnii 0.37 0.38 0.36 0.35 0.36 0.81 0.32 0.38 0.25 0.25 0.30 0.27 1.41 0.31
16 Eucalyptus_nudicaulis 1.34 1.29 1.24 1.23 1.24 1.61 1.28 1.38 1.25 1.35 1.21 1.34 0.03 1.28 1.41
17 Eucalyptus_chloroclada 1.37 1.32 1.25 1.26 1.25 1.63 1.28 1.40 1.29 1.38 1.21 1.37 0.04 1.31 1.44 0.02
18 Eucalyptus_brassiana 1.34 1.30 1.23 1.23 1.23 1.63 1.28 1.37 1.27 1.34 1.20 1.35 0.03 1.27 1.40 0.01 0.01
19 Eucalyptus_cordata 1.33 1.29 1.23 1.23 1.23 1.60 1.27 1.38 1.27 1.32 1.20 1.31 0.01 1.26 1.40 0.03 0.03 0.02
20 Eucalyptus_vicina 1.35 1.30 1.24 1.24 1.24 1.59 1.27 1.38 1.26 1.35 1.20 1.34 0.03 1.29 1.41 0.01 0.01 0.01 0.03
21 Eucalyptus_saligna 0.39 0.38 0.36 0.36 0.37 0.83 0.32 0.40 0.25 0.25 0.30 0.26 1.36 0.31 0.02 1.36 1.39 1.35 1.35 1.36
22 Eucalyptus_blakelyi 1.36 1.31 1.25 1.25 1.26 1.61 1.28 1.39 1.27 1.37 1.21 1.35 0.04 1.30 1.42 0.01 0.02 0.01 0.03 0.00 1.37
23 Eucalyptus_alba 1.32 1.29 1.23 1.21 1.22 1.67 1.31 1.36 1.27 1.34 1.23 1.32 0.03 1.28 1.40 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 1.35 0.03
24 Eucalyptus_punctata 1.32 1.26 1.22 1.21 1.21 1.57 1.26 1.35 1.24 1.32 1.20 1.30 0.03 1.25 1.38 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 1.33 0.03 0.02
25 Eucalyptus_grandis 1.36 1.29 1.23 1.23 1.25 1.59 1.28 1.39 1.28 1.35 1.21 1.34 0.03 1.27 1.39 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 1.35 0.02 0.02 0.02
26 Eucalyptus_urophylla 0.39 0.38 0.35 0.36 0.37 0.81 0.32 0.39 0.25 0.25 0.30 0.27 1.36 0.31 0.02 1.37 1.39 1.35 1.36 1.37 0.02 1.38 1.35 1.34 1.35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU

1.1. Lý do chọn đề tài
Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau
cellulose. Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và
gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng
hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá
trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin
giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân.
Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh
dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm
bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các
nhân tố gây bệnh [7]. Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó
là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất,...) và là
một loại nhiên liệu hoàn hảo.
Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm
lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất
bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với
điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay [27]. Vậy làm thế nào để điều
chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật
và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong
xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng
lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy.
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin,
quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như
enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol
dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis
thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây

lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân
lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase
(CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme
cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla
S.T. Blake)” làm vật liệu để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen ở thực vật.
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu
Tách dòng, phân tích trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme
cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang
đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn
urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa
cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và trình tự nucleotide
đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA dehydrogenase (CCR) đã công
bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn gen
này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).
- Tách dòng, phân tích trình tự đoạn promoter của gen mã hóa cho
enzyme CAD và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho
enzyme CCR từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây bạch đàn
Chi Bạch đàn Eucalyptus thuộc họ Sim Myrtaceae có hơn 700 loài, hiện
đã được trồng ở hơn 30 nước trên thế giới từ vĩ độ 58
0
Bắc đến 46

0
Nam. Bạch
đàn mọc tự nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới
một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có
thể mọc ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc
hoặc bán sa mạc) [4].
Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m.
Đường kính thường đạt 120-180 cm. Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏ
nâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu
Eucalyptone thơm mùi dầu tràm. Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối,
sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến lá
dày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song với
mép lá. Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi. Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng
đi, để lộ nhị và nhụy. Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng. Nhuỵ có
bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên. Quả khô, khi
chín nứt ở đỉnh. Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ.
Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quan
trọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở các
vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45
o
N và 40
o
B như: Braxin, Trung
Quốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta [4]. Ở Việt Nam
đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc. Hiện nay
có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
+ Bạch đàn urô Eucalyptus urophylla, thích hợp với vùng đất đồi
trung du.

+ Bạch đàn trắng Eucalyptus camaldulensis, thích hợp với vùng
đồng bằng.
+ Bạch đàn trắng Eucalyptus alba, thích hợp với vùng gần biển.
+ Bạch đàn lá nhỏ Eucalyptus tereticornis, thích hợp với vùng đồi Thừa
Thiên Huế.
+ Bạch đàn liễu Eucalyptus exserta, thích hợp với vùng cao miền
Bắc Việt Nam.
+ Bạch đàn chanh Eucalyptus citriodora, thấp, lá có chứa tinh
dầu mùi sả.
+ Bạch đàn lá bầu Eucalyptus globules, thích hợp với vùng cao
nguyên.
+ Bạch đàn to Eucalyptus grandis, thích hợp với vùng đất phù sa.
+ Bạch đàn ướt Eucalyptus saligna, thích hợp với vùng cao nguyên Đà Lạt.
+ Bạch đàn Mai đen Eucalyptus maidenii, thích hợp với vùng cao Lâm Đồng.
Cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake), vật liệu mà chúng
tôi chọn nghiên cứu là loài cây gỗ lớn, sinh trưởng nhanh, chiều cao có thể đạt
tới 20-25m, đường kính có thể đạt tới 100cm. Thân thẳng, vỏ trơn nhẵn với
nhiều vết đốm màu trắng hoặc hồng. Tán hình tháp, phân cành thấp. Cành và
lá non có màu đỏ tía. Lá đơn mọc cách hình ngọn giáo dài, phiến lá dài 16-
19cm, rộng 3,5-4cm, cuống lá mảnh dài 1,5cm, hơi lõm ở mặt trên. Hoa tự
tán, thường gồm 4-7 hoa trong một cụm, cuống hoa rất ngắn. Quả nang nứt ở
đỉnh, nhiều hạt nhỏ. Mùa quả chín từ tháng 4-5.
Bạch đàn urô là cây ưa sáng, mọc nhanh, cho năng suất cao. Cây ưa đất
ẩm sâu, nhưng cũng có thể mọc được trên đất đồi trọc khô, nghèo dinh dưỡng.
Bạch đàn urô sinh trưởng ở độ cao 1200m so với mực nước biển, với nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
trung bình năm khoảng 24-28
0
C và lượng mưa trung bình từ 2000-

3000mm/năm. Trên vùng đất đồi trung du Phú Thọ, bạch đàn urô 4 tuổi có
chiều cao trung bình là 10,34m, đường kính trung bình của thân đạt 9,54cm
và sinh khối gỗ đạt 34.108kg/ha [6].
Cũng như nhiều loài bạch đàn khác, bạch đàn urô cho gỗ cứng làm
nguyên liệu sản xuất giấy, đóng đồ dùng thông thường… Ngoài ra, nó còn
được dùng làm cực truyền điện, các cột trụ lâu dài và cột xây dựng, trong
kết cấu nặng hoặc nhẹ, đồ mỹ nghệ và làm gỗ dán boong tàu. Nó có vai trò
bảo vệ trên các bờ sông và tạo bóng mát. Vì các loài này không có nhu cầu
thổ nhưỡng lớn, nên nó thích hợp cho việc tái sinh rừng ở cả đất bị ngập
nước và đất khô của vùng nhiệt đới thấp.
Với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, hiệu suất
cao và tin sinh học, nhiều nghiên cứu về bộ gen của các loài cây đã được giải
mã thành công, như cây (Arabidopsis thaliana) và đặc biệt trong số này bao
gồm cả những loài cây quan trọng trong nông nghiệp như lúa (Oryza sativa)
và trong lâm nghiệp như cây dương (Populus trichocarpa). Thông tin về bộ
gen của những loài cây này đã trở thành những công cụ rất có giá trị trong các
nghiên cứu về chức năng và sự tương tác giữa các gen, những nghiên cứu về
tiến hoá và sự phân bố gen trong các quần thể thực vật. Thực vật hạt kín được
cho là có nhiều điểm tương đồng về bộ gene, các quá trình trao đổi chất với
các loài cây mô hình, chính vì vậy mà những nghiên cứu trên các loài cây này
là những thông tin và công cụ quan trọng cho các loài cây thuộc họ khác, ví
dụ chi Bạch đàn (Eucalyptus) của họ Sim (Myrtaceae) [10].
Những nghiên cứu về gen trên cây bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh
về cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen. Đặc điểm của
bộ gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra
bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng
và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các

locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và
hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính
trạng mong muốn.
1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam
Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, tuy nhiên đến
đầu những năm 1960 mới được phát triển mở rộng và sau đó được xem như là
một trong những loài cây chủ lực để phủ xanh đất trống đồi trọc và trồng cây
phân tán. Tính đến tháng 12/1999, cả nước đã trồng được 349.043 ha rừng
bạch đàn. Trong đó: rừng trồng bạch đàn thuần loài là 249.324 ha và rừng
trồng hỗn giao với các loài cây khác là 69.719 ha. Ở vùng Đông Bắc có diện
tích trồng bạch đàn lớn nhất (88.341ha), tiếp theo là duyên hải Nam Trung Bộ
(77.538 ha), Bắc Trung Bộ (67.910 ha), đồng bằng sông Cửu Long (58.643
ha), ít nhất là ở vùng Tây Nguyên (10.556 ha). Theo số liệu thống kê của Ban
chỉ đạo kiểm kê rừng Trung ương (2001), thì diện tích rừng trồng các loài
bạch đàn hiện nay lớn nhất so với các loài cây khác, đạt 349.043 ha và chiếm
24.03% so với tổng diện tích rừng trồng của cả nước (1.452.470 ha).
Vào những năm 1970, diện tích rừng trồng bạch đàn mới chỉ chiếm
khoảng 10% so với tổng diện tích rừng trồng của toàn quốc. Giai đoạn 1986-
1992 diện tích rừng trồng bạch đàn cũng chỉ chiếm khoảng 11.75%. Nhưng
đến hết năm 1999, diện tích rừng trồng bạch đàn đã tăng lên 24.03%. Từ năm
2000 đến 2003 tuy chưa tập hợp được số liệu kiểm kê cho từng loài cây, song
kết quả điều tra khảo sát cục bộ ở một số địa phương đến tháng 9 năm 2003
cho thấy diện tích trồng bạch đàn tăng khá nhanh trong giai đoạn vừa qua. Cụ
thể ở Công ty Lâm nghiệp Đông Bắc đã trồng được 4.400 ha, chủ yếu là bạch
đàn uro (E. urophylla). Thực hiện dự án 661 từ 1999 đến 2003, tỉnh Phú Thọ
đã trồng được 6.900 ha, trong đó phần lớn diện tích là bạch đàn uro và một số
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
loài keo. Lâm trường sông Hậu (Cần Thơ) đã trồng được 5 triệu cây bạch đàn
(Eucalyptus – W5) phân tán trên các bờ kênh, tương đương với trên 3000 ha

(mật độ trồng quy đổi là 1660 cây/ha).
Như vậy, có thể thấy rừng trồng bạch đàn đã chiếm một tỷ lệ khá lớn
trong diện tích rừng trồng của cả nước, đồng thời diện tích trồng bạch đàn đã
tăng khá nhanh trong giai đoạn từ 1993-1999 và tiếp tục phát triển với tốc độ
nhanh từ năm 2000 trở lại đây. Điều đó cho thấy vai trò của cây bạch đàn rất
quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng ở nước ta trong những năm qua, đồng
thời loài cây này cũng là nguồn nguyên liệu chủ yếu phục vụ ngành công
nghiệp giấy sợi và ván nhân tạo, đóng góp không nhỏ vào sự phát triển của
nền kinh tế quốc dân.
1.3. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật
1.3.1. Lignin
Lignin được tìm thấy trong hầu hết những cây có mạch, chúng nằm xen
kẽ giữa các tế bào, bên trong tế bào và trong thành tế bào. Nó có chức năng
điều khiển sự vận chuyển các chất trong thực vật (một phần tham gia vào việc
giữ vững cho thành tế bào, mặt khác tham gia điều chỉnh sự vận chuyển của
chất lỏng), cho phép cây lớn lên và cạnh tranh để giành ánh sáng mặt trời.
Trong thiên nhiên, lignin có khả năng chống chịu lại sự thoái hóa và
được gắn kết với nhau một cách phức tạp nhờ những liên kết hóa học bền
vững. Nó thực sự không chỉ là một hợp chất mà bao gồm rất nhiều hợp chất.
Đó là những polymer ba chiều, phức tạp và vô định hình. Chúng có một cấu
trúc chung là một vòng benzen với một đuôi gồm 3 cacbon. Cấu trúc tự nhiên
của lignin quá phức tạp đến nỗi không một cấu trúc nào có thể được mô tả
một cách đầy đủ và ước tính trọng lượng phân tử của chúng khoảng 15.000
kDa hoặc nhiều hơn [12].
Lignin có cấu trúc phức tạp, là một polyphenol có mạng không gian mở.
Thành phần thay đổi theo từng loại gỗ, tuổi cây hoặc vị trí của nó trong cấu
trúc gỗ. Lignin là các phức hợp dị polymer thơm và hiếm, được tổng hợp từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
ba loại đơn phân hydroxycinnamyl alcohol. Ba loại đơn phân này phân biệt

với nhau tuỳ thuộc vào mức độ methoxyl hóa, với tên hóa học là: p-coumaryl
M1H, coniferyl M1G và sinapyl M1S alcohol [28], [31] (Hình 1.1).


Hình 1.1: Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin
Từ ba loại đơn phân này, các chất p-hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và
syringyl (S) phenylpropanoid được tạo ra. Các chất này sau đó sẽ kết hợp lại
để tạo ra phân tử lingin.
Mặc quá trình sinh tổng hợp các monolignol (đơn phân tạo ra lignin) đã
được xây dựng lại nhiều lần nhưng đến nay nó vẫn còn là vấn đề bàn cãi trong
các nhà khoa học. Tương tự như vậy, thì các quá trình khử và polymer hóa
các monolignol trong thành tế bào cũng vẫn là những chủ đề đang được
nghiên cứu và thảo luận.