Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô thuần Việt Nam tại Viện nghiên cứu ngô - Đan Phượng - Hà Nội “

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays.L) là cây lương thực quan trọng đối với con người có
tiềm năng năng suất cao được trồng phổ biến ở nhiều nước. Trên thế giới, ngô
xếp thứ ba về diện tích và thứ nhất về năng suất, sản lượng các cây lấy hạt và
sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau. Hiện nay, 49% sản lượng ngô được
sử dụng làm thức ăn gia cầm,12% làm thức ăn động vật, 25% làm lương thực
thực phẩm cho con người, 13% trong tinh bột và các ngành khác, 1% là làm
hạt giống. Ước tính đến năm 2020 sản lượng ngô trên thế giới sẽ tăng từ
820,7 triệu tấn lên 837 triệu tấn so với năm 2010.
Trong nền nông nghiệp Việt Nam, ngô là cây màu quan trọng nhất, đứng
vị trí thứ hai sau lúa, được trồng nhiều ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa
dạng về mùa vụ và hình thức canh tác. Kể từ thập niên 90 đến nay, cuộc cách
mạng ngô lai đã làm thay đổi căn bản nghề trồng ngô ở nước ta, đưa nước
Việt Nam đứng trong hàng ngũ các nước trồng ngô tiên tiến trong khu vực
Châu Á (Trần Hồng Uy,1997)[1]
Những năm gần đây, sản xuất ngô của nước ta đã có sự phát triển mạnh
mẽ về diện tích, năng suất và sản lượng. Tỷ lệ tăng trưởng bình quân trong 20
năm qua về diện tích là 7,5%, năng suất là 6,7% và sản lượng là 24,5%
(TS.Bùi Mạnh Cường, 2007)[2]. Đặc biệt việc khai thác tiềm năng năng suất
thông qua ưu thế lai và đưa nhanh các giống ngô lai vào sản xuất trên quy mô
rộng lớn là một trong những đóng góp quan trọng làm tăng sản lượng lương
thực cả nước.
Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học
(CNSH) đã tạo ra những thay đổi kì diệu trong nhiều lĩnh vực. Trong nông
nghiệp CNSH được coi là phương tiện giải quyết các vấn đề khó khăn mà
công tác chọn tạo giống truyền thống khó có thể thực hiện được hoặc nếu có
1
thực hiện được thì mất nhiều thời gian.
Trong công tác chọn tạo giống ngô lai, các kỹ thuật như tạo dòng thuần
bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá tính

đa dạng di truyền của tập đoàn nguyên liệu đã được sử dụng và là trợ giúp đắc
lực cho phương pháp truyền thống, góp phần đẩy nhanh việc xây dựng các tổ
hợp lai ưu tú đáp nhu cầu ngày càng tăng về số lượng cũng như chủng loại
giống ngô lai vào sản xuất, giảm thiểu một số công đoạn trong công tác chọn
tạo. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng
di truyền của một số dòng ngô thuần Việt Nam tại Viện nghiên cứu ngô -
Đan Phượng - Hà Nội”
2. Mục tiêu của đề tài
- Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam
trong phòng thí nghiệm.
- Kiểm tra độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử
- Dựa trên chỉ thị phân tử SSR xác định mức độ đa hình và xây dựng sơ
đồ phả hệ của các dòng
- Dự đoán các tổ hợp lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• Ý nghĩa khoa học
Đề tài nghiên cứu được thực hiện chi tiết, các vấn đề liên quan đến việc
đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô, phân tích đa dạng di truyền
bằng chỉ thị phân tử SSR với mong muốn cung cấp thêm số liệu, thông tin và
khả năng ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống lai trong
điều kiện cụ thể ở Việt Nam.
2
• Ý nghĩa thực tiễn
Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo
trên đồng ruộng, kết hợp các phương pháp đánh giá đồng ruộng sẽ nhanh
chóng xác định, chọn lọc tổ hợp lai cho năng suất cao.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: 20 dòng ngô thuần Việt Nam
- Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá độ thuần di truyền, khoảng cách di truyền
giữa các dòng, phân nhóm và dự đoán ưu thế lai nhờ sử dụng chỉ thị SSR

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện nghiên cứu
Ngô - Đan Phượng - Hà Nội.
- Thời gian từ 23/02/2011 đến 22/05/2011
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
Cây ngô (Zea mays.L) thuộc chi Zea, phân họ ngô (Maydeae), họ phụ
hòa thảo (Panicoideae), họ hòa thảo (Grmaineae), bộ hòa thảo (Grmainale),
lớp một lá mầm (Cosmobionia) và có bộ nhiễm sắc thể 2n=20. Cây ngô là cây
hàng năm với hệ thống rễ chùm phát triển, là loài cây giao phấn có hoa đơn
tính cùng gốc.
1.1. Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế
Trong lịch tiến hóa của khoảng một nghìn loài cây trồng phổ biến nhất
trên trái đất hiện nay, chưa có loài cây trồng nào phát triển nhanh chóng và có
nhiều công dụng cho con người như cây ngô (Cao Điểm Đắc, 1988)[3].
Trước hết ngô là cây ngũ cốc nuôi sống gần 1/3 dân số toàn cầu. Toàn
thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực. Ngô là lương thực chính
của người dân khu vực Đông Nam Phi, Tây Phi, Nam Á… Ngô là thành phần
quan trọng bậc nhất trong thức ăn chăn nuôi. Hầu như 70% chất tinh trong
thức ăn chăn nuôi tổng hợp là từ ngô, 71% sản lượng ngô thế giới làm thức ăn
chăn nuôi (Ngô Hữu Tình,2003)[8].
Ngô còn là một loại hàng hóa xuất khẩu của ngành nông nghiệp, trên thế giới
hàm lượng ngô xuất nhập khẩu khoảng 70 triệu tấn. Bên cạnh đó ngô còn đem lại
nhiều lợi nhuận cho người dân. Theo thống kê của ISAAA, ở Philippine, có ít nhất
200 ngàn người nông dân hưởng lợi từ cây ngô CNSH trong năm 2008. Nghiên cứu
về tác động của giống ngô này đến kinh tế - xã hội cho thấy trong niên vụ 2003-2004,
ngô CNSH làm thu nhập cho người dân thêm 7482 peso/ha (khoảng 135USD) trong
mùa khô, còn trong mùa mưa thì thu nhập tăng thêm là 7080 peso/ha (khoảng
125USD). Sử dụng số liệu năm 2008, các nhà khoa học đã tính được rằng ngô Bt có
thể cho thu nhập cao hơn từ 5-14% trong mùa mưa và từ 20-48% trong mùa khô
(Clive James, 2008).

4
1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô trên thế giới
Nhờ có vai trò quan trọng trong nền kinh tế mà cây ngô ngày càng được
quan tâm và phát triển. Ngô là một trong ba cây lương thực lấy hạt quan trọng
nhất trong nền nông toàn cầu và được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế
giới đem lại năng suất và sản lượng cao nhất trong các loại ngũ cốc. Thực vậy,
năm 2009 theo số liệu của tổ chức Nông nghiệp và lương thực LHQ (FAO) về
sản xuất ngô: Diện tích toàn thế giới là 159,53 triệu ha, Năng suất trung bình
là 5,18 tấn/ha, tổng sản lượng 817,1 triệu tấn. Năm 2009, phần lớn sản lượng
ngô thế giới tập trung ở các nước Mỹ, Trung Quốc, Braxin, Mehicô, Pháp và
Ấn Độ, chiếm trên 75% (FAOSTAT, 2009).
Bảng 1.1: Tình hình sản xuất ngô ở một số nước dẫn đầu trên thế giới năm
từ 2004 - 2010
Chỉ tiêu Nước 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Diện tích
(triệu ha)
Thế giới 145,3 145,5 149,6 160,5 158,2 156,3 160,6
Mỹ 29,8 30,4 28,6 35,0 31,8 32,2 32,9
Trung Quốc 25,4 26,4 28,5 29,5 29,9 31,2 31,5
Braxin 11,6 12,9 14 14,7 14,1 12,9 12,8
Thế giới 4,9 4,8 4,8 4,9 50 5,2 5,1
Mỹ 10,1 9,3 9,4 9,5 9,7 10,3 9,7
Trung Quốc 5,1 5,3 5,3 5,2 5,6 5,1 5,3
Braxin 3,0 3,2 3,6 4,0 3,6 4,3 4,0
Sản lượng
(triệu tấn)
Thế giới 715,5 699,4 713,5 793,6 797,8 812,4 820,7
Mỹ 299,9 282,3 267,5 331,2 307,1 333,0 318,5
Trung Quốc 130,3 139,4 151,6 152,3 165,9 158,0 168,0

Braxin 35,0 41,7 51,0 58,6 51,0 56,1 51,0
(Nguồn USDA (2010) [23])
Mỹ luôn là nước chiếm vị trí hàng đầu thế giới về diện tích và sản lượng ngô,
đồng thời cũng là nước có năng suất cao nhất. Hiện nay 100% diện tích trồng ngô
của Mỹ là ngô lai, năng suất ngô tăng từ 1,5 tấn/ha năm 1930 lên đến 10,34 tấn /ha
vào năm 2009, với tổng sản lượng 332,01 triệu tấn (FAO 2009). Và Mỹ đang phấn
5
đấu đến năm 2030, năng suất ngô sẽ tăng gấp đôi hiện nay, lên >18 tấn/ha.
Năm 2009 diện tích trồng ngô ở các nước Đông Nam Á là 8,212 triệu ha, năng
suất bình quân đạt 31,3 tạ / ha với tổng sản lượng 25,67 triệu tấn (USDA, 2010) [23].
Kể từ khi ngô được phát hiện ở châu Mỹ và du nhập vào các khu vực khác
trên thế giới, trong một khoảng thời gian dài năng suất chỉ đạt khoảng 0,1-0,2
tấn/ha. Nhưng đến nay nhờ những ứng dụng rộng rãi nhiều tiến bộ khoa học về kĩ
thuật di truyền chọn giống, các biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến, cơ giới hoá…
đặc biệt là khai thác và sử dụng ưu thế lai ở ngô trong quá trình chọn giống.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ngô ở Việt Nam
Trong nền nông nghiệp Việt Nam, cây ngô là cây màu quan trọng, cây
lương thực thứ hai sau lúa nước. Ngô được đưa vào Việt Nam cách đây
khoảng 300 năm, mặc dù cây lương thực đứng thứ hai nhưng do truyền
thống trồng lúa nước nên ngô vẫn chưa được chú trọng, không phát huy
được tiềm năng của nó (Ngô Hữu Tình, 2009)[9]. Ngày nay, sản xuất ngô đã
được phổ biến rộng khắp cả nước từ vùng núi cao đến đồng bằng, trung du.
Năm 2009, diện tích ngô cả nước là 1086.8 nghìn ha, năng suất đạt 40,8
tạ/ha và sản lượng ngô là 4431,8 nghìn tấn. Nhưng 9 tháng đầu năm 2009,
Việt Nam đã phải nhập hơn 0,8 triệu tấn ngô, do nhu cầu dùng ngô làm thức
ăn chăn nuôi tăng mạnh.
Hiện nay thị phần giống ngô lai của Việt Nam chiếm khoảng trên 60%,
chủ yếu là giống lai đơn được áp dụng vào sản xuất ở tất cả các vùng sinh thái
trong cả nước.Trong những năm gần đây Viện Nghiên cứu Ngô đã liên kết với
các Viện thành viên trong VAAS và các công ty trong nước và đã nâng cao

hiệu quả trong nghiên cứu và chuyển giao nhanh các kết quả nghiên cứu phục
vụ sản xuất, như các giống ngô LVN4, LVN9, LVN14, LVN99…
Bảng1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2005 – 2009
Năm Diện tích
(1000 ha)
Năng suất
Tạ/ ha
Sản lượng
(1000 tấn)
6
2005 1052,6 36,0 3787,1
2006 1033,1 37,3 3854,6
2007 1096,1 39,3 4303,2
2008 1140,2 40,1 4573,1
2009 1086,8 40,8 4431,8
Nguồn: tổng cục thống kê 2009 [12]
Tiến độ gieo trồng năm 2010 nhanh hơn so với năm 2009, tính đến trung
tuần tháng 2/2010 các địa phương trên cả nước gieo trồng được 2632,7 nghìn
ha ngô bằng 106,1% cùng kì năm trước. Đến trung tuần tháng 9/2010 cả nước
đã gieo trồng được 953,8 nghìn ha ngô tăng 1,4% so với cùng kì năm 2009. Và
đến ngày 15/3/2011 cả nước ta đă gieo trồng được 353,7 nghìn ha bằng 95,8%
cùng kì năm trước (Tổng cục thống kê 2010, 2011)[13].
Chiến lược nghiên cứu và phát triển cây ngô của Việt Nam đến năm 2020
xác định:
-Đẩy mạnh nghiên cứu về cây ngô góp phần đưa diện tích ngô của cả
nước đến năm 2015, phấn đấu đạt 1,3 triệu ha ngô; năng suất đạt trên 50 tạ/ha;
sản lượng đạt 6,5 triệu tấn, đến năm 2020 đạt 1.500.000 ha với năng suất bình
quân 60 tạ/ha và sản lượng 9,0 triệu tấn, nhầm đảm bảo cung cấp nguyên liệu
cho chế biến thức ăn chăn nuôi và các nhu cầu khác trong nước, từng bước
tham gia xuất khẩu.

7
Bảng 1.3. Dự kiến diện tích, năng suất và sản lượng ngô cả nước
đến năm 2020
Năm Diện tích
( ha )
Năng suất
( tạ / ha)
Sản lượng
Triệu tấn
2005 1043 300 36,0 3,7
2010 1200 000 42,0 5,4
2015 1300 000 50,0 6,5
2020 1500 000 60,0 7,8
Nguồn: Chiến lược pháp triển cây ngô đến năm 2020[14]
-Cải thiện thu nhập và đời sống cho người sản xuất ngô, nâng cao hiệu
quả sử dụng đất, lao động và vốn đầu tư.
-Đẩy mạnh nghiên cứu chọn tạo giống ngô lai đảm bảo đủ sức cạnh tranh
trên thị trường trong nước và xuất khẩu.
-Đảm bảo cung cấp giống ngô lai Việt Nam chiếm 51-55% thị phần ngô
lai của cả nước nhằm chủ động hạt giống với giá bán phù hợp với khả năng
đầu tư của nông dân.
-Nghiên cứu các giải pháp về khoa học kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả
sản xuất ngô, tăng thu nhập cho người trồng ngô, bảo vệ môi trường sinh thái,
góp phần xây dựng nền nông nghiệp bền vững.
1.3. Cơ sở khoa học
1.3.1. Ưu thế lai (ƯTL) - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng trong chọn tạo
giống ngô
ƯTL là hiện tượng di truyền, trong đó con lai biểu hiện sức sống, các đặc
tính hình thái, sinh lý, khả năng thích nghi, khả năng chống chịu và năng suất
hơn hẳn bố mẹ (Nguyễn Lộc, 1997) [5]. Người đầu tiên quan sát thấy hiện

tượng ƯTL ở ngô là Charles Darwin, ông nhận thấy những cây giao phối phát
triển cao hơn những cây tự phối 20% trong tác phẩm “ Tác động của giao phối
và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản năm 1876.
Năm 1878 nhà nghiên cứu người Mỹ tên Beal đã áp dụng thực tế ƯTL
trong việc tạo giống ngô lai giữa giống. Ông thu được những cặp lai hơn hẳn
8
các giống bố mẹ về năng suất từ 10-15%.
Năm 1904 Shull lần đầu tiên tiến hành tự thụ cưỡng bức ở ngô để thu
được các dòng chuẩn và đã tạo ra những giống lai từ các dòng chuẩn này.
Năm 1913 chính Shull đã đưa vào tài liệu khoa học thuật ngữ “Hetetosis” để
chỉ ƯTL (Hetetosis là từ rút gọn của Stimulus of heetrozygosis). Từ năm 1918
Jones đề xuất sử dụng lai kéo trong sản xuất để giảm giá thành hạt giống thì
việc áp dụng ƯTL vào trồng trọt, chăn nuôi được phát triển nhanh chóng.
ƯTL của những cơ chế dị hợp tử biểu hiện ở tổ hợp lai trên các tính trạng
đã được các nhà di truyền chọn giống chia làm 5 dạng biểu hiện chính:
- Ưu thế lai về hình thái.
- Ưu thế lai về năng suất.
- Ưu thế lai về tính thích ứng.
- Ưu thế lai về tính chín sớm.
- Ưu thế lai về sinh lý, sinh hóa.
Đối với cây ngô, ƯTL về năng suất có vai trò quan trọng nhất, thể hiện
qua sự tăng của các yếu tố cấu thành năng suất như chiều dài bắp, số hàng hạt,
số hạt/hàng, tỉ lệ hạt/cây… Theo Richey (1927) ƯTL về năng suất ở ngô với
các giống lai đơn có thể đạt từ 193% đến 263% so với trung bình của bố mẹ
(Trích dẫn theo Mai Xuân Triệu, 1998). Trong những năm gần đây, phương
pháp đánh giá đa dạng di truyền của các dòng thuần dựa vào chỉ thị phân tử để
phân nhóm cách biệt di truyền đã giảm bớt được khối lượng công việc lai tạo
trên đồng ruộng, rút ngắn thời gian đánh giá. Phương pháp này không phụ
thuộc vào môi trường và mùa vụ, do đó tiết kiệm được rất nhiều thời gian và
công sức cho các nhà tạo giống.

9
1.3.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền
thống
1.3.2.1. Đa dạng di truyền của cây ngô:
Sự đa dạng di truyền của cây ngô được thể hiện ở tất cả các tính trạng của
cây, bông cờ và bắp. Các nghiên cứu cho thấy: Ngô có mức độ sai khác về di
truyền rất lớn trong cùng một quần thể hoặc các quần thể chéo nhau. Các
nghiên cứu ở mức độ phân tử cũng cho thấy mức độ đa dạng của ngô cao hơn
3-10 lần so với những loài thân thảo khác (Buckler và cs, 2001) [17]. Các nhà
chọn giống đã dựa vào sự đa dạng tự nhiên để lựa chọn các giống /loài tốt, từ
đó cải tiến nhằm nâng cao chỉ tiêu về số lượng và chất lượng và chất lượng
của giống, ở ngô, năng suất hiện tại cao gấp 55 lần so với năng suất của các
giống ngô tổ tiên (Buckler và cs,2001)[17].
1.3.2.2. Đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai theo phương pháp truyền
thống
Các nghiên cứu về hiện tượng ƯTL cho thấy sự khác biệt di truyền của
bố và mẹ có ảnh hưởng rất lớn tới sự biểu hiện ƯTL của các tổ hợp lai đơn,
Shull G,H (1948) đã kết luận: ƯTL sinh lý của một cơ thể được biểu hiện qua
sự phát triển nhanh, qua chiều cao và ƯTL có mối tương quan thuận với độ
không giống nhau trong giao tử mà từ đó con lai được hình thành. Sự khác
nhau giữa giao tử càng nhiều thì sự biểu hiện ƯTL ở con lai càng lớn (trích
theo Ngô Hữu Tình và cs, 1997) [7].
Cây ngô là loài cây giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng và dị hợp tử
về kiểu gen, vì thế những thông tin về đa dạng di truyền của các nguồn gen là
rất cần thiết và vô cùng hữu ích trong công tác đánh giá dòng, phân nhóm
ƯTL và dự đoán tổ hợp lai ưu tú có khả năng cho năng suất cao.
Đa dạng di truyền có tầm quan trọng hết sức to lớn trong chọn tạo giống
ngô, đặc biệt là cho chương trình tạo giống ngô lai. Chính vì vậy, cây ngô đã
10
được mô tả, thu thập và bảo tồn rất tốt ở các trung tâm đa dạng di truyền.

Ngày nay, có khoảng 15 000 mẫu giống ngô được thu thập từ các nước khác
nhau trên thế giới (Ngô Hữư Tình và cs, 1997) [7]. Ở Việt Nam, nguồn gen
ngô được bảo tồn tại Viện nghiên cứu Ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn
tự do; 3 000 dòng tự phối và được trồng ở khắp các vùng miền trong cả nước.
1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và ưu
thế lai
Nguyên tắc cơ bản trong công tác tạo giống cây trồng là việc xác định và
khai thác các kiểu ƯTL giữa các nguồn vật liệu nghiên cứu (Hallauer và
Miranda, 1988) [18]. Đối với ngô, thông tin về đa dạng di truyền giữa các
dòng sẽ giúp cho các nhà chọn tạo giống quyết định được kế hoạch lai tạo,
cải tạo dòng và phân nhóm ƯTL. Công tác này mang tính quyết định chủ yếu
để dẫn đến sự thành công trong bất cứ chương trình chọn tạo giống ngô lai
nào. Chính vì thế mà các nhà chọn tạo giống ngô mong muốn mô tả được sự
đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu trong và giữa các nhóm ƯTL và mối
quan hệ di truyền giữa chúng (Messmer và cs, 1992) [20].
Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể được đánh giá thông
qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu
phả hệ, chỉ thị hình thái như kiểu nội nhũ, chỉ thị phân tử như: chỉ thị isozyme
và gần đây là chỉ thị DNA.
Các chỉ thị phân tử DNA có thể được chia làm hai nhóm chính sau: chỉ
thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP dựa vào các băng DNA
trên gel điện di có thể phát hiện các thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử (Becker và
cs, 1995) [16] và chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật
PCR như: RAPD, AFLP, SSR, STS…Trong những năm gần đây, nhiều chỉ thị
thuộc nhóm này đã thành công trong nghiên cứu đa dạng di truyền.
* Chỉ thị RFLP (Restiction Fragment Lengh Polymorphism)
11
Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn) được sử
dụng rộng rãi trong đánh giá tính đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến
hóa và phân loại các loài của nhiều nhóm thực vật và trong lập bản đồ di

truyền. Chỉ thị RFLP được sử dụng như là mẫu chuẩn để xác định sự có mặt
hay thiếu vắng các đoạn nhiễm sắc thể nhất định. Khả năng theo dõi quá trình
di truyền các đoạn nhiễm sắc thể cho phép sử dụng kĩ thuật RFLP trong chọn
tạo giống cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997).
Khả năng phân biệt của chỉ thị RFLP đã được nghiên cứu rộng rãi ở ngô,
như xác lập mối quan hệ với năng suất và UTL, đánh giá đa dạng di truyền.
Chỉ thị này không những phát hiện được những cá thể dị hợp tử và đồng hợp
tử mà còn phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn. Vì thế
mà phương pháp này còn được gọi là chỉ thị đồng trội. Tuy nhiên, phương
pháp này có quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, yêu cầu số lượng DNA
lớn, chất lượng DNA cao, sử dụng chất phóng xạ gây nguy hiểm cho người.
Do đó xu hướng sử dụng các chỉ thị phân tử đơn giản hơn trên cơ sở nhân bản
DNA bằng kĩ thuật PCR.
* Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DAN)
Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân
ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như
lập bản đồ di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác định giống cây trồng… Ở Việt
Nam chỉ thị RAPD cũng đã được Ts.Bùi Mạnh Cường và cs (2000,2003)
nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai.
Kỹ thuật RAPD có ưu điểm là quy trình phân tích đơn giản, nhanh, rẻ
tiền và cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn, an toàn với người thực hiện,
tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là mức độ phát hiện sự đa hình thấp.
* Chỉ thị AFLP (Amplified Length Polymorphism)
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, DNA nhân được cắt bằng
12
enzym giới hạn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, sau đó được gắn
với các đoạn nucleotide ngắn (adapter) vào hai đầu nhờ enzym ligase. Mồi của
phản ứng được thiết kế trên trình tự của các đoạn adapter có gắn thêm các
đoạn từ một vài nucleotide. Kỹ thuật AFLP cho phép phát hiện được đa hình
chiều dài các phân đoạn được nhân chọn lọc. Trên cây ngô chỉ thị AFLP được

các nhà khoa học ứng dụng trong đánh giá mối quan hệ giữa đa hình phân tử
với sự biểu hiện ở giống ngô lai (Ajmone-Marsan và cs,1998).
* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
SSR hay còn gọi là vi vệ tinh là sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide đơn
giản cực ngắn (chỉ từ 1-6 cặp base). Các SSR xuất hiện phổ biến trong bộ gen
của sing vật nhân thực (Eukaryote). Tuy nhiên tùy từng loài mà số lượng
nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số
lượng đợn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng trăm ngàn lần và nhiều
hơn. Phương thức lặp lại cũng rất phức tạp và đa dạng, chủ yếu có ba dạng
sau: (1) lặp lại hoàn toàn; (2) lặp lại không hoàn toàn; (3) lặp lại phức tạp.
Kỹ thuật SSR cho phép chúng ta phát hiện được tính đa hình về độ dài
các trật tự nucleotide lặp lại đơn giản. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc của
PCR và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Do sự khác nhau về số
lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số lần lặp lại mà sự đa hình
về độ dài của SSR khuếch đại sẽ được phân tách trong quá trình điện di.
Trên đối tượng là cây ngô, các nhà khoa học cũng đã sử dụng chỉ thị SSR
trong nhiều nghiên cứu khác nhau, Senior và Heun (1993) đã công bố, do sự
biến đổi cao trong số đơn vị lặp lại nên chỉ thị SSR cung cấp mức độ đa hình
cao ở ngô. Kết quả dự đoán của chỉ thị SSR nhanh, đáng tin cậy và có khả
năng lặp lại, chuẩn xác và có hiệu quả hơn phân tích RFLP. Phân tích SSR sử
dụng gel agarose chất lượng cao rất hữu ích trong đánh giá đa dạng di truyền
của các dòng tự phối ở ngô.
13
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị
phân tử trên cây trồng được nhiều nhà khoa học đề cập, quan tâm nghiên cứu
và đã thu được những kết quả khả quan như công trình nghiên cứu của tác giả
Nguyễn Thị Liên và cs (2003) “Ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn dòng lúa
chịu hạn”. Một số tác giả đã có những công trình nghiên cứu đa dạng di truyền
các nguồn vật liệu ngô bằng chỉ thị SSR phục vụ nghiên cứu về khả năng kết
hợp và xác định cặp lai:

Nguyễn Thị Phương Đoài (2004)[6] đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên
cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 30 dòng ngô có nguồn gốc
khác nhau. Kết quả xác định được khoảng cách di truyền của các dòng ngô
nghiên cứu biến động từ 0,47-0,86 và được phân thành 3 nhóm ưu thế lai.
Phan Xuân Hào và cs (2004)[11] đã sử dụng 41 mồi SSR để phân tích đa
dạng di truyền của 88 dòng ngô ( 51 dòng có nguồn gốc Việt Nam, 1 dòng từ
Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT). Trong đó có 16 dòng QPM ( Quality Protein
Maize), 6 dòng tham khảo từ AMBIONET. Kết quả xác định được sơ đồ phả
hệ giữa các dòng nghên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn. Nghiên
cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng gần nhau
trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ cấp.
Hiện nay sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và
dự đoán ưu thế lai ở ngô đặc biệt là chỉ thị SSR đang được Viện Nghiên cứu
Ngô tiếp tục nghiên cứu và phát triển. Với những ưu điểm vượt trội và lớn
mạnh của ngành CNSH, việc áp dụng phương pháp này là cần thiết để hỗ trợ
phương pháp truyền thống trong công tác tạo giống ngô lai, góp phần nhanh
chóng xác định được các tổ hợp ngô lai có ưu thế lai cao phục vụ sản xuất.
1.3.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai cây
ngô ở Việt Nam
Những năm trước đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng di truyền
14
của các dòng ngô thuần và dự đoán ƯTL chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái
như chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, …
Mai Xuân Triệu (1998) [4] đã sử dụng phương pháp phân tích nhóm của
Mahalanobis để phân loại dòng thuần theo sự cách biệt về di truyền (phân loại
dưới loài) của 24 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau của Viện nghiên cứu Ngô,
Kết quả 24 dòng đã được phân thành 4 nhóm.
Bùi Mạnh Cường và cs (2000) [1] đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD với
35 cặp mồi để nghiên cứu đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 7 dòng
ngô đường tại Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả đã chia được 7 dòng ngô nghiên

cứu thành 2 nhóm cách biệt di truyền.
Ngô Thị Minh Tâm, Bùi Mạnh Cường (2007) [10] đã sử dụng 36 mồi
SSR để phân tích đa hình của 8 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau trong tập
đoàn nguyên liệu của Viện nghiên cứu Ngô. Kết quả khảo sát đánh giá các tổ
hợp lai trên đồng ruộng và chỉ ra mối tương quan thuận giữa khoảng cách di
truyền với năng suất của con lai F1 ở 8 dòng ngô nghiên cứu…
Gần đây, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền và dự đoán ưu thế lai ở các đối tượng cây trồng nói chung và ở cây ngô
nói riêng đang ngày càng phát triển.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
15
2.1. Vật liệu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Gồm 20 dòng ngô thuần của Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên
cứu Ngô – Đan Phượng – Hà Nội
Bảng 2.1: Danh sách các dòng ngô nghiên cứu
TT Tên Nguồn gốc TT Tên Nguồn gốc
1 C1 Cargi U777 11 C200 CP888
2 C24 Syngenta 70224 12 C208 C919 x AC24
3 C40 Dekalbgold 13 C329 C919 x AC24
4 C43 Dekalbgold 14 C369 C919 x AC24
5 C45 NK67 15 C222 C919
6 C84 NK67 16 C236 LVN10
7 C115 MB69 17 C245 LVN61
8 C128 LVN99 18 C275 HQ2000
9 C133 CP999 19 C477 NK4300/06A
10 C143 CP999 20 C738 Pacific747
• Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu:
- Thiết bị thí nghiệm:

Máy PCR 9700, máy quang phổ kế Ultrospec, máy chạy điện di gel
agarose và polyacrylamide, máy khuấy từ gia nhiệt, máy li tâm, máy đo pH,
máy soi chụp gel, tủ lạnh sâu (-80 độ C), tủ lạnh, tủ đông, lò vi sóng… và các
trang thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu.
Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống eppendof, đầu côn các loại, lược gel,
ống bơm gel….
- Hóa chất tách chiết DNA:
Bao gồm các loại hóa chất như EDTA, CTAB, chloroform, Isoamyl
alcohol, Isopropanol, Amino acetic.
Đệm tách chiết DNA của mẫu lá: CTAB 2%( Tris-HCl 10mM, pH 8,0,
16
EDTA 10mM, NaCl 100mM, beta-Mercatoethanol 0,5%,), TE( 10mM Tris-
HCl, 1mM EDTA, pH 8,0 )
- Hóa chất chạy phản ứng PCR:
+ Đệm PCR 1X( 10mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl
2
, 5mM KCl) hoặc đệm
PCR 1X của Quiagen.
+ MgCl
2
của Fementas, Invitrogen.
+ dNTPs của Fementas, Invitrogen.
+ Mồi: hệ thống mồi SSR dùng trong nghiên cứu được cung cấp bởi
AMBIONET (bảng 2.2).
+ Marker 1kb
+ 2Tap polymerase của Fementas
+ H
2
O cất vô trùng
- Hóa chất chạy điện di và nhuộm gel: TEB 1X, TEB 5X, TEMED, APS 10%,

Acrylamide 4,5%, formandehyde 36%, Bind silane, Sigma code,
Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O…
- Chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đề tài: là hệ thống gồm 20
mồi SSR
17
Bảng 2.2: Danh sách 20 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
TT Tên mồi Kiểu lặp lại Vị trí gắn mồi trên NST
1 Phi308707 AGG 1,10
2 Phi448880 AAG 9,05
3 Phi109188 AAAG 5,0
4 Phi84 GAA 10,04
5 Phi109275 AGCT 1,00
6 Phi227562 ACC 1,12
7 Phi83 AGCT 2,04
8 Phi32 AAAG 9,04
9 Phi102228 AAGC 3,04-3,05
10 Phi374118 ACC 3,02
11 Phi029 AG/AGCG
***
3,04
12 Phi72 AAG 4,00
13 Phi108411 AGCT 9,06

14 Phi109642 ACGG 2,0
15 nc133 GTGTC 2,05
16 Phi06 ACG 4,11
17 Phi1304 (TCGA)4 8,02
18 Umc1143 AAAAT 6,0
19 Phi87 ACC 5,06
20 Phi423796 AGATG 6,01
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA của tổ hợp lai ưu tú 20 dòng ngô thuần Việt Nam trong
phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Ngô.
- Kiểm tra đánh giá độ thuần của các dòng ngô nghiên cứu ở mức độ
phân tử.
- Dùng chỉ thị phân tử SSR đánh giá khoảng cách di truyền, và xây
dựng sơ đồ phả hệ của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô
- Đan Phượng - Hà Nội.
- Xác định mức độ đa hình, phân nhóm ưu thế lai và dự đoán các tổ hợp
lai ưu tú của 20 dòng ngô thuần Việt Nam của Viện nghiên cứu ngô - Đan
Phượng - Hà Nội.
18
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền trong phòng thí nghiệm
Tách DNA tổng số
Mỗi dòng lấy 10 cây đại diện, lấy lá non lúc cây được 3 – 4 lá. Quy
trình tách triết theo phương pháp Saghai Maroof và cs (1984) [15].
Các bước tiến hành:
- Nghiền lá tươi thành thể nhuyễn, bổ sung 2-3ml đệm chiết CTAB,
chuyển sang ống eppendorf 1,5ml, đảo đều mẫu nhẹ nhàng.
- Ủ mẫu ở 65°C trong thời gian 45-60 phút, sau đó để nguội ở nhệt độ
phòng, đem ly tâm 13,000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chiết DNA 2 lần với Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly

tâm ở 13,000 vòng/phút mỗi lần trong 5 phút. Sau đó chuyển dịch trong phía
trên ống eppendorf sang một ống mới.
- Kết tủa DNA với 600µl Isopropanol và 100µl Ammonium acetate,
đảo đều ở -20°C trong 30 phút, ly tâm thu tủa ở 13,000 vòng/phút trong thời
gian 10 phút.
- Rửa tủa DNA trong 1ml dung dịch rửa, ly tâm trong 5 phút.
- Làm khô DNA sau đó hòa tan DNA trong 100µl dung dịch TE và bảo
quản ở 20°C.
• Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số
Độ tinh sạch và nồng độ của DNA tổng số được đo bằng máy đo quang phổ
( Ultrospec UV/Visible-65 spectrophotomrter)
Nồng độ DNA được tính theo công thức:
Nồng độ DNA (µg/µl) =( OD
260
x 50 x 50 µg/ml)/1000
Trong đó: OD
260
là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 260
50 là hệ số pha loãng
50 µg/ml là hằng số
19
Tỷ lệ OD
260
/OD
280
(OD
280
là chỉ số đo được ở bước sóng λ = 280nm) phản
ánh độ tinh sạch của mẫu. Tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8-2,0 thì DNA được
coi là sạch.

• Chạy phản ứng PCR (PCR- Polymerase Chain Reaction):
Bảng 2.3: Thành phần của 1 phản ứng PCR
Dung dịch gốc Nồng độ sử dụng
Thể tích (µl)
Nước cất vô trùng
Đệm PCR 10X
MgCl
2
25mM
dNTP 10mM
Primer 5uM
Tap DNA polymerase
5U/µl
DNA khuôn 10ng/ µl
-
1X
2,0mM
0,25mM
0,25mM
0,5U
10ng
5,6
1,0
0,8
1,0
0,5
0,1
1,0
Tổng thể tích 10,0
Chạy chương trình phản ứng PCR: phản ứng được tiến hành trong plate

96 giếng và chạy theo phương trình cụ thể
20
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bước Phản ứng Chu trình nhiệt
1 Biền tính đầu tiên 94
0
C trong 2 phút
2 Biến tính 94
0
C trong 30 giây
3 Gắn mồi 56
0
C trong 21 phút
4 Kéo dài chuỗi 72
0
C trong 1 phút
5 Lặp lại từ bước 2, 29 lần
6 Kéo dài chuỗi cuối cùng 72
0
C trong 1 phút
7 Bảo quản 4
0
C, ∞
Biến tính sản phẩm PCR và marker DNA có khối lượng chuẩn ( thang
chuẩn ФX174 DNA/HinfI, 20ŋg /µl) được biến tính ở 20°C trong 5 phút, sau
đó ngay lập tức làm lạnh và giữ lạnh cho đến khi tra mẫu vào bản gel.
• Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR và thang chuẩn sau khi biến tính và sốc nhiệt trong đá
lạnh được đưa vào chạy điện di trên gel polyacrylamide 4,5% và sau đó
nhuộm bạc để biểu hiện sản phẩm điện di.

Gel polyacrylamide gồm các thành phần:
+ Dung dịch acrylamide 4,5%: 60ml
+ Dung dịch APS 10% : 60ml
+ Dung dịch TEMED :60ml
Phương pháp nhuộm bạc:
- Chuẩn bị dung dịch nhuộm: hòa tan 1g AgNO
3
trong 1lit nước cất hai lần
khử ion, bổ sung 1,5ml dung dịch fomaldehyde 37%, để lạnh sâu trước khi dùng
- Chuẩn bị dung dịch hiện: hòa tan 30g Na
2
CO
3
trong 1 lit nước cất hai
lần khử ion, làm lạnh ở nhiệt độ -20°C. Trước khi dùng thì bổ sung 1,5ml
dung dịch fomaldehyde 37% + 200ml sodium thiosulfate 10mg/ml.
- Sau khi điện di xong, cố định tấm kính bám gel bằng dung dịch cố định
gel ( Glacial acetic acid 10%) trong 20 phút, lắc nhẹ.
21
- Lấy bản gel ra khỏi dung dịch cố định, rửa lại bằng nước cất hai lần
trong 5 phút
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong thời gian 30 phút, lắc nhẹ
- Bản gel được rửa lại bằng nước cất hai lần trong 5-10 giây
- Đưa bản gel vào dung dịch hiện, lắc nhẹ cho đến khi các băng xuất
hiện, sau đó đổ trực tiếp dung dịch cố định (đã dùng ở trên) lên trên bản gel
để dừng phản ứng hiện, duy trì trong 4-6 phút.
- Rửa sạch lại bằng nước cất hai lần và để bản gel khô ở nhiệt độ phòng
2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thống kê và xử lý theo hướng dẫn của AMBIONET –
CIMMYT (2004)[15]. Dựa vào thang chuẩn phiX174/HinfI, số liệu được đọc

theo quy ước: các alen xuất hiện băng DNA (1), không xuất hiện băng (0),và
khuyết số liệu (9). Kết quả được phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2,1
• Hệ số PIC (Polymorphic Information Content- Chỉ số thông tin
đa hình),
PIC = 1- ΣP
i
; Trong đó : P
i
là tần số xuất hiện của alen thứ i
• Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi dòng ngô
Số mồi xuất hiện ≥ 2 alen/1 locus SSR
H% = x 100
Tổng số mồi sử dụng – số mồi khuyết số liệu
• Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) được tính cho từng dòng và từng mồi
Số mồi khuyết số liệu
M% dòng = x 100
Tổng số mồi sử dụng
Số dòng khuyết số liệu
M% mồi = x 100
Tổng số dòng nghiên cứu
22
• Khoảng cách di truyền (GD)
GD = 1 – GS
Trong đó: GD là khoảng cách di truyền
GS là độ tương đồng di truyền được tính theo hệ số
Jaccard( Lanza và cs, 1997)
• Phân nhóm bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair
Group Meyhod with Arithmetical Averages),
23
CHƯƠNG 3:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA của các dòng ngô nghiên cứu được chúng tôi tách chiết theo quy
trình của Saghai- Maroof và cs (1984)[21] với một vài thay đổi nhỏ phù hợp
với điều kiện của phòng thí nghiệm. Sau đó, sản phẩm DNA được kiểm tra độ
tinh sạch và nồng độ trên máy đo quang phổ và điện di trên gel agarose 1%,
Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Độ tinh sạch và nồng độ DNA của các dòng ngô
TT Tên dòng Độ tinh sạch DNA
(OD
260
/ OD
280
)
Nồng độ DNA
(µg/,ml)
1 C1 1,90 2,96
2 C24 1,96 2,90
3 C40 1,98 3,09
4 C43 1,94 3,00
5 C45 1,98 2,83
6 C84 1,91 2,64
7 C115 1,97 2,80
8 C128 1,96 3,20
9 C133 1,94 3,10
10 C143 1,94 2,96
11 C200 1,93 2,86
12 C208 1,89 3,20
13 C329 1,87 3,12
14 C369 2,00 2,74

15 C222 1,84 2,78
16 C236 1,81 2,90
17 C245 1,87 2,86
18 C275 1,97 2,53
19 C477 1,95 2,46
20 C738 1,86 2,90
24
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD
260
/OD
280
biến thiên
từ 1,8 -2,0 nằm trong khoảng giới hạn cho phép của mức độ tinh sạch DNA.
Kết quả phù hợp với yêu cầu của sản phẩm tách chiết DNA tổng số do
AMBIONET-CIMMYT công bố.
Ngoài ra chúng tôi còn tiến hành kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA
bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di được thể hiện
trên hình 3.1


Hình 3.1:kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số
Hình 3.1 cho thấy các mẫu DNA đều xuất hiện một băng duy nhất, rõ
nét, điều đó chứng tỏ DNA tách chiết đạt độ tinh sạch cao.
Như vậy, sản phẩm tách chiết DNA tổng số của 20 dòng ngô nghiên
cứu đáp ứng được yêu cầu về chất lượng và số lượng, đảm bảo đạt tiêu chuẩn
để sử dụng cho các bước tiếp theo của thí nghiệm.
25