CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TỪ Bacillus thuringiensi

1

CHƯƠNG III:
CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT
SÂU TỪ Bacillus thuringiensis
2

I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA THUỐC TRỪ SÂU BT
1901 Bacillus thuringiensis được tiến sỹ Ishiwatari phát
hiện.
1911 Berliner phát hiện trong các silo hạt ở Thuringe.
1915 Berliner quan sát thấy sự tạo thành tinh thể trong giai
đoạn tạo bào tử.
1920 Được sử dụng lần đầu tiên làm thuốc trừ sâu.
1950 Chế phẩm chứa bào tử được thương mại hóa lần đầu
tiên.
1957 Thuốc Thuricide được sản xuất từ chủng Bt
var.kurstaki.
Những
năm
1970
Phát hiện chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao.
Công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh. Có 13
chủng Bt đã được xác định. Tất cả đều chỉ diệt được
côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera).
1977 Phát hiện ra Bt var.israelensis diệt ấu trùng ruồi,
muỗi.
1983 Phát hiện ra Bt var.tenebrionis diệt bộ cánh cứng.
1985 Gen cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu.
3

II. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA Bacillus thuringiensis

Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm

Phủ tiêm mao, di chuyển được

Gram +

Sinh bào tử, kích thước 1,6 – 2 µm

Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc

Tế bào đứng riêng hoặc xếp chuỗi

Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC

Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong
đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu

Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn
tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm
4

Bào tử: hình trứng dài, kích
thước 1,6 x 2 µm
Tinh thể: kích thước 0,6 x 2
µm. Bản chất là protein
5

III. PHÂN LOẠI Bacillus thuringiensis

Giới: Procaryotae
Ngành: Firmicutes
Họ: Bacillacaeae
Chi: Bacillus
Loài: thuringiensis
Loài phụ…

Bacillus thuringiensis thuộc:
Khoá phân loại của Bergey (1984)
6

III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)
1. Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao
Nguyên lí
Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với
kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng
kết → tạo cặn lắng trắng dưới đáy ống
nghiệm.
Quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào
không di chuyển được
7

III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)
1. Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao (tiếp)
Chuẩn bị
kháng nguyên
tiêm mao H
Tiêm vào thỏ →
thu huyết thanh
miễn dịch

(xác định hiệu giá)
Thử phản ứng
ngưng kết
8


Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H

Nuôi cấy VK B. thuringiensis trên môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar
2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2. Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.

Chuyển sang môi trường NB: nuôi ở chế độ lắc cho tới khi OD
650
= 0,8 – 1,0.

Bổ sung 0,5 ml formaldehyt
Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H

Thu nhận huyết thanh miễn dịch

Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:

Mũi đầu tiên dưới da.

Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần
(1ml, 2ml, 3ml), thời gian tiêm 3 tuần

Kiểm tra sự hình thành kháng thể:

Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu

giá.

Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu cầu.

Nếu HG nhỏ hơn 25 000 thì tiếp tục tiêm thêm 2 – 3 lần nữa để nhận
hiệu giá cao hơn.

Dùng 02 con thỏ cho một kháng nguyên để tránh rủi ro.

Huyết thanh được tách trong đièu kiện vô trùng và bảo quản ở 4
o
C hoặc
đông khô.
9


Xác định hiệu giá

Cho 1,8ml NaCl 1,15M và 200µl dịch huyết thanh miễn dịch tiêm mao
vào ống nghiệm 5ml.

Pha loãng với các nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40;
…… ; 1:2560.

Chuyển 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng này vào ống nghiệm có
chứa 900µl dịch vi khuẩn B. thuringiensis, như vậy độ pha loãng lúc
này là 1:100; 1:200; 1:400; … ; 1:25600. Mẫu đối chứng được thay thế
100µl dịch huyết thanh bằng 100µl dịch NaCl 1,15M.

Ủ các ống nghiệm ở 37

o
C trong 2 giờ và quan sát sự ngưng kết.
Hiệu giá thu được là nồng độ pha loãng cao nhất xảy
ra hiện tương ngưng kết
10

Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanh
Mối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn
trùng không nhất quán:

Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng
như nhau: loài phụ Kustaki và loài phụ alesti đều biểu hiện độc
với côn trùng bộ cánh vẩy.

Có các loài có type huyết thanh giống nhau nhưng độc tính với
côn trùng khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab)
có độc tính với côn trùng bộ hai cánh và loài phụ sandiego
(type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ cánh
cứng.
Không thể thông qua type huyết thanh của một loài
phụ để xác định hoạt tính diệt sâu của chúng
11

Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
1 thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel và Angus 1958
2 finitimus FIN Heimpel và Angus 1958
3a, 3c alesti ALE Toumanoff và Vago 195, Heimpel và

Angus 1958
3a, 3b, 3c kurstaki KUR De Barjac và Lemille 1970
3a, 3d sumiyoshiensis SUM Ohba và Aizawa 1989
3a, 3d, 3e fukuokaensis FUK Ohba và Aizawa 1989
4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905, Heimpel và Angus 1958
4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi và De Barjac 1963
5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959, De Barjac và Bonnefoi
1962
Độc với bộ cánh vẩy
12

H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
5a, 5c canadensis CAN De Barjac và Bonnefoi 1972
6 entomocidus ENT Heimpel và Angus 1958
7 aizawai AIZ Bonnefoi và De Barjac 1963
8a, 8b morrisoni MOR Bonnefoi và De Barjac 1963
8a, 8c ostriniae OST Ren et al., 1975
8b, 8d nigeriensis NIG Weiser và Prasertphon 1984
9 tolworthi TOL Norris 1964, De Barjac và Bonnefoi 1968
10a, 10b darmstadiensis DAR Krieg de Barjac và Bonnefoi 1968
10a, 10c londrina LON Arantes et al.(không công bố)
11a, 11b toumanoffi TOU Krieg 1969
11a, 11c kyushuensis KYU Ohba và Aizawai 1979
Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
13

H
antigen

Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
12 thompsoni THO De Barjac và Thompson 1970
13 pakistani PAK De Barjac et al., 1977
14 israelensis ISR De Barjac 1978
15 dakota DAK De Lucca et al., 1979
16 indiana IND De Lucca et al., 1979
17 tohokuensis TOH Ohba et al., 1981
18a, 18b kumamatoensis KUM Ohba et al., 1981
18a, 18c yosso YOS Lee H.H et al., 1995
19 tochigiensis TOC Ohba et al., 1981
20a, 20b yunnanensis YUN Wan-Yu et al., 1979
20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al. (không công bố)
Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
14

H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
21 colmeri COL De Lucca et al., 1984
22 shandongiensis SHA Wang Ying et al., 1986
23 japonensis JAP Ohba và Aizawa 1986
24a, 24b neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al., 1988
24a, 24c novosibirsk NOV Burtseva et al., 1995
25 coreanensis COR Lee H.H et al., 1994
26 silo SIL De Barjac và Lacadet (không công bố)
27 mexicanensis MEX Rodriguez-Padilla và Galan-Wong
(không công bố)
28a, 28b monterrey MON Rodriguez et al., 1988
29 amagiensis AMA Ohba (không công bố)
30 medellin MED Orduz et al., 1992

Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
15

H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
31 toguchini TOG Hodirev (không công bố)
32 cameroun CAM Jacquemard 1990, Juarez-Perez et al.,
1994
33 leesis LEE Lee H.H et al., 1994
34 konkukian KON Lee H.H et al., 1994
35 seoulensis SEO Lee H.H et al., 1995
36 malaysiensis MAL Ho (không công bố)
37 andaluciensis AND Aldebis et al., 1996
38 oswaldocruzi OSW Rabinovitch et al., 1995
39 brasiliensis BRA Rabinovitch et al., 1995
40 huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al., 1996
41 soocheon SOO Lee H.H et al., 1995
Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
16

H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
42 jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al.
43 guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al.
44 higo HIG Ohba et al., 1995
45 roskildiensis ROS Hinrinschen et al.(không công bố)
46 chanpaisis CHA Chanpaisaeng (không công bố)
47 wratislaviensis WRA Lonc et al., 1997

48 balearica BAL Caballero et al.(không công bố)
49 muju MUJ Seung Hwan Park et al.(không công bố)
50 navarrensis NAV Caballero et al.(không công bố)
51 xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (không công bố)
52 kim KIM Kim et al.(không công bố)
Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
17

H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
53 asturiensis AST Aldebis et al., 1996
54 poloniensis POL Damgaard et al.(không công bố)
55 palmanyolensis PAL Santiago-Alvarez et al. (không công bố)
56 rongseni RON Li Rong Sen
57 pirenaica PIR Caballero et al. (không công bố)
58 argentinensis ARG Campos-Dias et al.(không công bố)
59 iberica IBE Caballero et al. (không công bố)
60 pingluonsis PIN Li Rong Sen
61 sylvestriensis SYL Damgaard (không công bố)
62 zhaodongensis ZHA Li Rong Sen
63 bolivia BOL Ferré-Manzanero et al.(không công bố)
Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
18

H
antigen
Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả
64 azorensis AZO Santiago-Alvarez et al.(không công bố)
65 pulsiensis PUL Khalique F. Và Khalique A (không công

bố)
66 graciosensis GRA Santiago-Alvarez et al.(không công bố)
67 vazensis VAZ Santiago-Alvarez et al.(không công bố)
68 thailandensis THA Chanpaisaeng et al.(không công bố)
69 pahangi PAH Seleena và Lee H.L (không công bố)
Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H
19

2. Theo gen mã hóa protein tinh thể độc
Protein Cry
Gen Cry
Mã hóa
III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)
20


Protein cry hay còn gọi δ-endotoxin (tinh thể độc)

ICP tồn tại dưới dạng tiền độc tố, cần được hoạt hoá để có tác
dụng.

ICP tồn tại dưới nhiều hình dạng: kim tự tháp đôi, thoi phẳng,
khối hộp, hỗn hợp của các loại trên.

ICP có kích thước khoảng 230KDa với phần nhân độc 65KDa.

ICP tan trong điều kiện pH cao (pH >9,5).

Tính độc: gây độc ở nồng độ picomol (10
-12

M)

Gen cry

Các gen mã hoá cho ICP thường nằm trên các plasmid.

Mỗi ICP là sản phẩm của một gen.

Một số loài phụ có khả năng tổng hợp được nhiều hơn 1 ICP.

250 gen mã hoá tổng hợp protein cry đã được đọc trình tự và
được xếp vào 40 họ dựa vào sự tương đồng về trình tự sắp xếp
các nucleotit.
21

Độ tương đồng trình tự axít amin
của các gen cry
Hàng
thứ
Biểu
tượng
% tương đồng axít amin
của gen cry
Nhất Số arập 45%
Hai Chữ in hoa 75%
Ba Chữ
thường
95%
22

Gen Hình dạng tinh
thể
Kích thước
protein
(kDa)
Đối tượng sâu diệt
CryI (Aa, Ab, Ac, B,
C, D, E, F, G, H, I,
J, K, L)
Lưỡng tháp 130-140 ấu trùng bộ cánh vẩy
CryII (A, B, C) Hình lập
phương
69-71 Bộ cánh vẩy và bộ hai
cánh
CryIII (A, B, C, D) Phẳng/không
đều
73-74 Bộ cánh cứng
CryIV (A, B, C, D) Lưỡng tháp 73-134 Bộ hai cánh
CryV-cryIX Đa dạng 35-129 Đa dạng
Cyt 25-28 Tế bào động vật xương
sống và ko xương sống
Phân loại Bt theo gen mã hóa protein tinh thể độc (Hoft và Whiteley, 1989)
23

Phân loại Bt theo độc tố diệt sâu
Độc tố diệt sâu Khối lượng
phân tử (kDa)
Độc tính
Hofte and
Whiteley

(1989)
Crickmore et al.
(1999)
CryIA(a) Cry1Aa 133,2 Cánh vẩy
CryIA(b) Cry1Ab 131 Cánh vẩy/hai
cánh
CryIA(c) Cry1Ac 133,3 Cánh vẩy
CryIB Cry1Ba 138 Cánh vẩy
CryIC(a) Cry1Ca 134,8 Cánh vẩy/hai
cánh
CryIC(b) Cry1Cb 134 Cánh vẩy
CryID Cry1Da 132,5 Cánh vẩy
CryIE Cry1Ea 132 Cánh vẩy
CryIF Cry1Fa 133,6 Cánh vẩy
CryIG Cry9Aa 130 Cánh vẩy
CryIX Cry9Ba 81 Cánh vẩy
24

Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp)
Độc tố diệt sâu Khối lượng
phân tử (kDa)
Độc tính
Hofte and
Whiteley
(1989)
Crickmore et al.
(1999)
CryIH Cry9Ca 129,9 Cánh vẩy
CryIIA Cry2Aa 70 Cánh vẩy/hai
cánh

CryIIB Cry2Ab 70,8 Cánh vẩy
CryIIC Cry2Ac 71 Cánh vẩy
CryIIIA Cry3Aa 73,1 Cánh cứng
CryIIIB Cry3Ba 74,2 Cánh cứng
CryIIIC Cry7Aa 73 Cánh cứng
CryIIIC(b) Cry7Ab 73 Cánh cứng
CryIIID Cry3Ca 73 Cánh cứng
CryIVA Cry4Aa 134,4 Hai cánh
CryIVB Cry4Ba 127,8 Hai cánh
25

Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp)
Độc tố diệt sâu Khối lượng
phân tử (kDa)
Độc tính
Hofte and
Whiteley
(1989)
Crickmore et al.
(1999)
CryIVC Cry10Aa 77,8 Hai cánh
CryIVD Cry11Aa 72,4 Hai cánh
CryVIA Cry6Aa 54 Nematode
CytA Cyt1Aa 27,4 Hai cánh/phân
hủy tế bào
CytB Cyt2Aa 29 Hai cánh/phân
hủy tế bào