nghiên cứu sử dụng nấm mốc Trichoderma-Harzianum phòng bệnh héo rũ cây dưa leo pythiumsp

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
TÀI LIÊU
1.1BỆNH CÂY TRỒNG [2], [6], [7], [10]
1.1.1 Lịch sử ngành bệnh cây trồng
Năm 1729, nhà thực vật người Ý-Pier Antonio
Micheli lần đầu tiên quan sát nấm và các bào tử của
chúng, Persoon (1801) đã ấn hành quyển Synopsis
methodicaỷungorum, người mở đầu việc phân loại nấm.
Năm 1876, Louis Pasteur và Robert Koch chứng
minh bệnh than đen ở bò do một loài vi khuẩn gâv ra,
Koch cũng hình thành phương pháp xác định tác nhân
eâv bệnh trên động vật bao gồm bôn bước, ngàv nay
chúng được biết dưới tên là “ Định đề Koch” (Koch's
postulates), “Định đề Koch” cũng được các nhà khoa học
bệnh cây trồng đương thời và ngày nay tuân thủ.
Năm 1885, Pierre Marie Alexis Millardet, nhà
khoa học Pháp, tìm ra hỗn hợp Bordeaux-hỗn hợp
sunphat đồng và vôi bột có hiệu quả trị bệnh phấn trắng
trên nho. Năm 1892, Dmitri Ivanopski, nhà khoa học
Nga, chứng minh bệnh khảm trên cây thuốc lá lan truyền
do chất độc trong dịch trích từ lá thuốc bị bệnh.
Năm 1967, Doi và cộng sự chứng minh bệnh vàng
lá của cây Aster do một loại vi sinh vật giông như
Mycoplasma gây ra, mỏ’ đầu cho việc phát hiện nhiều
bệnh vàng lá trên cây trồng.
Ngày nay với phương tiện ngày càng hiện đại, các
nghiên cứu về bệnh cây đã có những bước tiến dài và rất
chuvên sâu góp phần tích cực trong nghiên cứu phòng
trừ bệnh cây.
1.1.2 Khái niệm bệnh cây

Bệnh cây là động thái phức tạp đặc trưng của một
quá trinh bệnh lý xảy ra liên tục trong cây do các nhân tố
ký sinh hoặc do một yếu tô" môi trường không thích hợp
dẫn đến những thay đổi chức năng sinh lý, câu tạo và
làm giảm năng suất, phẩm chất của cây trồng trong điều
kiện nhất định.
(dhtỉơnạ /, 7Jốfĩ(j quan. tài liẬu
1.1.3 Phân loại bệnh cây
Trên mỗi loại cây có rất nhiều bệnh khác nhau, để dễ dàng khảo cứu người ta
thường phân chia bệnh phụ thuộc các tiêu chuẩn sau:
+ Triệu chứng bệnh: thối rễ, thối thân, thối quả, thôi củ, ghẻ nứt, héo cây,
đốm lá, cháy lá
+ Vị trí bệnh: bệnh rễ, bệnh thân cành, bệnh lá, bệnh hoa trái, bệnh mạch
dẫn
+ Loại cây: cây lương thực, thực phẩm, cây lâm nghiệp, cây ăn trái, cây
rau, cây hoa kiểng.
+ Loại bệnh:
• Bệnh truyền nhiễm: bệnh do sinh vật ký sinh và có thể lan truyền
gồm bệnh do nấm, prokaryotes (vi khuẩn và mycoplasma), bệnh do vừus, bệnh do
tuyến trùng, bệnh do thực vật bậc cao, bệnh do protozoa.
• Bệnh không truyền nhiễm: bệnh xuất hiện do thay đổi bất thường
các yếu tô" vật lý, dinh dưỡng như thiếu dinh dưỡng, thiếu hay thừa độ ẩm đất, nhiệt
độ môi trường quá cao hay quá thấp, thiếu oxy, không khí nhiễm bẩn, độ chua hay
độ kiềm của đất, ngộ độc khoáng chất, thiếu hay thừa ánh sáng, độc tính của nông
dược, phương pháp canh tác không thích hợp.
1.1.4 Ký sinh và tính gâv bệnh
Một sinh vật sống bên trong hoặc bên trên sinh vật khác và sử dụng nguồn
dinh dưỡng từ cơ thể sinh vật đó gọi là sinh vật ký sinh, sinh vật bị sử dụng làm
nguồn dinh dưỡng gọi là kv chủ, mốĩ quan hệ giữa ký sinh và ký chủ gọi là hiện
tượng ký sinh.

Ký sinh thực vật: sinh vật sinh trưởng và sinh sản được trên thực vật, chúng
hấp thụ nước và chất dinh dưỡng làm suv giảm sinh trưởng, phát triển và sinh sản
bình thường ở cây ký chủ.
Như vậy trong nhiều trường hợp, tính ký sinh gắn bó chặt chẽ với tính gây
bệnh, vì ký sinh xâm nhập và định cư trong cây thường dẫn đến tình trạng bệnh ở ký
chủ.
Tính gây bệnh được xem là sự can thiệp của ký sinh vào một hay nhiều chức
năng chủ yếu của câv trong đó tính ký sinh đóng vai trò quan trọng và thường xuyên
nhưng không phải quan trọng nhất vì mức độ gây bệnh bởi tính ký sinh không luôn
luôn tỉ lệ thuận với sự hấp thụ dưỡng chất của kv sinh trên ký chủ của nó.
Một sô" ký sinh chỉ sống trên những ký chủ còn sô"ng gọi là ký sinh bắt buộc
(KSBB) như virus, tuvến trùng, một sô" loài nấm, một sô" ký sinh khác có thể sống
trên ký chủ còn sống hay đã chết gọi là ký sinh không bắt buộc (KSKBB).
Một vài loại KSKBB chủ yếu có đời sống ký sinh nhưng khi gặp điều kiện môi
trường có xác bã hữu cơ chúng vẫn sử dụng làm nguồn năng lượng gọi là hoại sinh
tùy ý, ngược lại một số loại chủ yếu có đời sống hoại sinh nhưng khi gặp kv chủ
trong điều kiện thuận lợi chúng có đời sống ký sinh gọi là ký sinh tùy ý.
K-SBB và KSKBB thường khác nhau ở cách tấn công ký chủ và lây đi châ"t
dinh dưỡng:
+ Nhiều KSKBB tiết ra men hoặc độc tô" làm cho thành phần vách tế bào bị
phân hủy, kv sinh sử dụng nội chất tế bào để sinh trưởng - nhiều loại nâ"m và vi
khuẩn tác động theo cách này, chúng sinh trưởng trên một chất nền chết trong cây
đang sô"ng.
KSBB (vàmột sô" K-SKBB) không giết tế bào trước nhưng lấy đi chất
dinh dưỡng bằng cách xâm nhập vào tế bào hoặc tiếp cận chúng, sự tiếp xúc của ký
sinh với ký chủ râ"t mật thiết, tạo nên sự hấp thụ liên tục dưỡng chât bình thường
dùng cho cây ký chủ vào trong cơ thể ký sinh
QhiẨđếiạ /. Ĩ7ếỉng qxưut tài lỉỀẤi
Mức đô suy kiêt chất dinh dưỡng mặc dù cản trở quá trình phát triển của
cây nhưng không nhất thiết luôn giết chết cây bệnh, trong một sô' trường hợp ký sinh

bắt buộc tế bào chết đi ngàn cản sự phát triển của ký sinh và làm chúng vếu chết dần
vì thiếu dinh dưỡng.
Các tác nhân ký sinh gây bệnh cây trồng:
1. Nấm: phần lớn nấm gây bệnh cây trồng có đời sông ký sinh tùy ý và
hoại sinh tùy ỷ, chung xâm nhập vào ký chủ qua khí khẩu, bì khẩu, thủy khẩu, mô bị
tổn thương hay xâm nhập trực tiếp qua biểu bì.
2. Protozoa: ký sinh trong mạch nhựa của cây, làm cho cây bị chết đột
ngột.
3. Vi khuẩn: ít gây bệnh cho cây trồng hơn nấm nhưng bệnh do vi khuẩn
rất khó trị và gây thiệt hại nghiêm trọng, vi khuẩn xâm nhập vào ký chủ qua khí
khẩu, bì khẩu, thủy khẩu, vết thương do côn trùng, tuyến trùng, do nông cụ.
4. Mycoplasma: vi sinh vật thuộc giới có nhân thật nhưng chúng không
có hình dạng nhâ't định.
5. Virus: gây rất nhiều bệnh cho cây trồng, bệnh có triệu chứng gây hư
hỏng hay làm chết tế bào.
6. Tuyến trùng: là động vật có kích thước nhỏ, sống trong đất, nước.
Thường gây bệnh ở bộ phận rễ thực vật.
7. Thực vật thượng đẳng: thường ký sinh ở thân cành (dây tơ hồng, chùm
gởi) hút lây nhựa của ký chủ.
1.1.5 Phổ kv chủ của mầm bênh
V •
Mầm bệnh khác nhau sẽ tùy thuộc vào loại cây chúng gây hại, bộ phận và mô mà
chúng xâm nhiễm, tuổi của cùng cơ quan hoặc mô trên cùng một cây
ũhưưttg. 1. 'íĩỔuiỊ qxưut tài lìệit
7
chúng đang sinh trưởng, một sô" mầm bệnh chỉ giới hạn một loại cây hay vài giống
cây.
KSBB thường chuyên tính trên loài cây ký chủ chúng gây hại, có lẽ do chung
phát triển song song với ký chủ và chỉ sử dụng những chất dinh dưỡng nào đó do loại
kỷ chủ này tạo ra hav có sấn trong ký chủ đó.

KSKBB có thể gây hại nhiều loại cây khác nhau và trên nhiều bộ phận cây có
tuổi khác nhau, do mức độ gây hại của chúng tùy thuộc vào độc tố không đặc hiệu và
rất nhiều loại enzym thủy phân khác nhau chúng tác động đến các vật chất hoặc các
chu trình biến dưỡng thường gập ở cây, nhưng cũng có KSKBB chỉ gây bệnh trên
vài loại cây.
1.1.6 Các giai đoạn phát triển bệnh Đốì với bệnh truyền nhiễm, sẽ có hàng
loạt những sự kiện rõ rệt hay không rõ rệt xảy ra dẫn đến sự phất triển và tồn tại của
bệnh. Chuỗi các sự kiện này gọi là chu kỳ bệnh, các sự kiện chính trong chu kv bệnh
gồm:
1. Giaỉ đoạn gây nhiễm: là cách kỵ sinh tiếp cận kv chủ, lượng ký sinh
tiếp xúc và gây bệnh trên ký chủ gọi là nguồn bệnh. Nguồn bệnh có thể là một bào tử
hoặc khôi đa bào như hạch nấm hoặc hàng triệu vi khuẩn trong một giọt nước, nguồn
bệnh có thể ở tại chỗ (trong đất, xác bã thực vật, ký chủ phụ) hoặc lan truyền từ nơi
khác đến (nhờ gió, nước, nông cụ).
2. Giai đoạn xâm nhập: các bào tử và trứng, hạt cần phải phát triển
thành cđ thể sinh dưỡng mới gây bệnh. Khi bào tử nảy mầm chúng tạo ra ống mầm
để xâm nhập vào ký chủ. Các đặc tính nảy mầm tùv thuộc vào những yếu tô" môi
trường như nhiệt độ, ẩm độ, các chất kích thích tiết ra từ cây.
3. Giai đoạn gây bệnh: là tiến trình mầm bệnh tiếp xúc với tế bào hoặc
mô cây và hút chất dinh dưỡng từ đó. Trong thời gian gây bệnh, mầm bệnh tiết ra và
đưa vào ký chủ các chất hoá học làm ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn
Qhưt&iạ 1. qiưut tàỉ Uềii
8
và chu trình sinh học của tế bào. Cây cũng có phản ứng đối với các cơ chế gây bệnh,
cây sống hay chết nói lên mức độ chông bệnh của cây. Cây bị nhiễm bệnh sẽ có các
triệu chứng như biến dạng, mất màu, chết hoại, triệu chứng có thể xuất hiện sau 2-4
ngày, vài tuần hay vài nãm. Đôi khi bệnh ở dạng tiềm ẩn, gặp điều kiện thích hỢp
bệnh sẽ phát triển.
4. Thời kỳ ủ bệnh: là thời kỳ giữa thời điểm gây bệnh của mầm bệnh và
sự biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Thời kỳ này dài hay ngắn tùy thuộc vào tổ hợp

ký sinh, kỷ chủ và môi trường. Đối với phần lớn các bệnh, nhất là trên cây thường
niên thời kỳ này kéo dài từ vài ngày đến vài tuần.
5. Sinh sản và phát tán của mầm bệnh: sau các giai đoạn trên, mầm
bệnh đi vào giai đoạn sinh sản, sự sinh sản diễn ra nhanh với sô" lượng lớn. Sau đó,
chúng được phát tán nhờ gió, nước, côn trùng, dụng cụ canh tác và con người.
1.1.7 Cách thức mầm bệnh gây hại cây trồng
Ký sinh muốn lây đi các vật châ"t cần thiết cho sự sông của chúng cần phải
tấn công vào câu tạo tế bào ký chủ, chúng phải vượt qua các lớp cản trở như: lớp sáp,
lớp cutin, vách tế bào. Mặt khác ký sinh phải chông lại được các chất đề kháng do
cây tiết ra bởi sự xâm nhập của chúng, mục tiêu này thường được ký sinh thực hiện
bằng hai con đường: cơ học và hóa học.
1.1.7.1 Tác động cơ học của ký sinh lên ký chủ
Các mầm bệnh thuộc nhóm virus hay vi khuẩn thường không có khả năng chủ
động xuyên qua mô bào ký chủ, chủ yếu xâm nhập qua các khẩu (khí khẩu, bì khẩu)
và nhờ vết thương do côn trùng, tuyến trùng và nông cụ gây ra.
Thực vật thượng đẳng và nấm tạo ra các sợi áp hoặc vòi bám gắn chặt vào ký
chủ, đây là dạng thể sợi nấm, từ sợi áp này mọc ra vòi xâm nhập xuyên qua lớp cutin
và thành tế bào. Vòi xâm nhập cũng thường đi vào giữa hai vách tê bào sẽ bị lực dính
của hai vách cản lại, do vậy nếu lực này yếu vòi xâm nhập sẽ phát triển nhanh, nếu
9
lực này mạnh vòi xâm nhập sẽ bị cản trở, Đối với tuvến trùng, chúng bám vào tê bào
bằng hâp lực của vách miệng, sau đó chúng đẩv kim chích vào tê bào bằng nhưng
cách riêng, cuối cùng thân tuyến trùng lọt vào theo.
1.1.7.2 Tác động hóa học của ký sinh lên ký chủ
Mặc. dù có tác động cơ học, tác động hóa học của kv sinh vẫn quan trọng hơn
do các phản ứng sinh hoá xảy ra liên tục nhờ các chất tiết ra từ ký sinh, các chất do vi
sinh vật trực tiếp hay gián tiếp tiết ra gồm: enzvm, độc tô", chất điều hòa sinh
trưởng, các đường đa và một sô" chất khác.
Trong 5 nhóm tác nhân là vi sinh vật gây bệnh cây, trừ virus còn tất cả điều có
thể tiết enzym, chất điều hòa sinh trưởng và các chất đường, riêng các độc tô" và

kháng sinh được biểt cho đến nay do nấm và vi khuẩn tiết ra, virus thúc đẩy tê" bào
ký chủ sinh ra một lượng lớn các chất có sẩn trong cây khỏe mạnh hoặc những chất
hoàn toàn mới so với ký chủ.
Các chất hóa học do ký sinh tiết ra tác động lên ký chủ:
• Các enzym phân hủv cấu trúc tế bào, phá vỡ các chất dự trữ, tác động
trực tiếp để nguyên sinh chất biến đổi chức năng tế bào.
• Các độc tô" tác động đến nguyên sinh chất và ngăn cản tính thâm của
tế bào cũng như các chức năng thông thường khác của tế bào.
• Các chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến khả năng phân bào và sự
lớn mạnh của tế bào.
• Các đường đa chi có tác dụng trong bệnh mạch dẫn, gây ra hiện tượng
cản sự vận chuyển chất dinh dưỡng trong mạch dẫn và có thể gây độc.
• Các chất kháng sinh ít được nghiên cứu nhất, dường như chúng có tác
động giống như các độc tô".
1
0
Chu thích:
cw (cell wall): vách tế bào thực vật
H (hypha): đoạn tơ nấm ký sinh A
(appressorium): giác bám
s (sheath): lớp vách bao ở thực vật khi bị nấm tấn công AH (advancing
hypha still enclosed in sheath): tơ nấm đang xâm nhập HC (hypha in
cytoplasm): đoạn tơ nấm trong tế bào chất Hình 1.1. Tơ nấm gây bệnh xâm
nhập trực tiếp vào tế bào thực vật
1.1.7.3 Tác hại của mầm bệnh lên chức năng sinh lý cây trồng
Tác động của ký sinh sẽ ảnh hưởng trực tiếp hay gián tiếp đến chức năng sinh
lý cây trồng, bao gồm:
1. Ánh hưỏng lên sự hấp thụ, chuyển vị nước và dinh dưỡng của cây: gây
cản trở hoặc làm giảm sự hấp thụ nước của rễ, sự chuvển vị nước và muôi khoáng
trong mạch mộc.

2. Ẳnh hưởng lên sự hô hấp: khi cây bị nhiễm bệnh, hô hấp ở cây tăng
cao hơn bình thường và nhiệt độ nơi mô bệnh cũng tăng lên chút ít. Khi cây bị vết
1
1
thương cơ học, cây cũng gia tăng hô hấp nhưng sau đó nhanh chóng trở lại bình
thường.
3. Ảnh hưởng lên quang hợp: mầm bệnh tác động bằng cách phá hủy diệp
lục tố và lục lạp đồng thời làm giảm hiệu quả quá trình quang hợp của sô" diệp lục
tô" còn lại.
1.1.8 Giám định bệnh do nấm [8]
Giám định bệnh cây trồng là tìm nguyên nhân gây bệnh của cây trồng đó, việc
chuẩn đoán này rất quan trọng vì tìm ra đúng tác nhân gây bệnh sẽ giúp chúng ta đề
ra biện pháp thích hợp.
Tùy loại bệnh muôn chuẩn đoán là bệnh đã biết từ trước hay bệnh lạ mới xuâ"t
hiện, người ta áp dụng một trong hai phương pháp chuẩn đoán.
1.1.8.1 Đốĩ với các bệnh đã biết trước
Quá trình chuẩn đoán tốì thiểu thực hiện 3 bước sau:
1. Căn cứ vào triệu chứng bệnh: Đô"i với một sô" bệnh, triệu chứng
biểu hiện bệnh rất đặc trưng, dựa vào đó làm cơ sở xác định bệnh.
2. Quan sát trực tiếp từ bộ phận bị bệnh: Dùng kính lúp, kính hiển vi
và dựa vào những biểu hiện bệnh đặc trưng của từng loài mà xác định nguyên nhân
gây bệnh. Tuy nhiên, có trường hợp nhiều vi sinh vật cùng hiện diện trong một loại
mô, một bộ phận của cây bệnh nên việc quan sát tác nhân trực tiếp từ mô bệnh có thể
không chính xác (chỉ quan sát ở giai đoạn nào đó của quá trình gây bệnh, thường là
giai đoạn sinh sản vô tính của nấm gây bệnh). Do vậy cần phải phân lập mầm bệnh
từ mô bệnh.
('‘ỈUửlHíỊ 1. ỸĩatttJ (ỊltílH tài llỀẤL
1
2
3. Phân lập nấm gây bệnh: cắt mô cây vừa mới nhiễm bệnh ở vị trí tiếp

xúc với mô không bị nhiễm, cấy lên môi trường chọn lọc, quan sát nấm bệnh (hình
dạng, màu sắc, khuẩn ty, bào tử) để định danh chúng.
Tổng hỢp các đặc điểm ở 3 bước trên và dựa vào danh mục bệnh hại cây
trồng để kết luận tác nhân gây bệnh.
1.1.8.2 Đổì với bệnh lạ
Trường hợp là bệnh lạ, danh mục bệnh hại cây trồng của khu vực chưa đề cập
đến, chúng ta phải giám định theo nguyên tắc của “Định đề Koch” gồm bôn bước
sau:
1. Ghi nhận triệu chứng bệnh.
2. Phân lập, làm thuần nấm gây bệnh, quan sát nấm bệnh (hình dạng,
màu sắc, khuẩn ty, bào tử) để định danh chúng.
3. Gây bệnh nhân tạo vi sinh vật này lên cây khỏe mạnh (cùng loài và
cùng giống với cây bệnh) trong điều kiện cách ly thật tốt để ưánh bị lây nhiễm từ
thiên nhiên. Khi nuôi cấy tác nhân gây bệnh trên môi ữường nhân tạo mỗi loại vi
sinh vật gây bệnh có một môi trường sồng khác nhau, do đó phải có một môi trường
chọn lọc thích hợp cho vi sinh vật phát triển.
4. Tái phân lập từ vết bệnh do gây nhiễm nhân tạo và ghi nhận được vi
sinh vật này.
1.2BỆNH HÉO RŨ CÂY TRỎNG THUỘC HỌ BAU BÍ YÀ ĐẶC DIÊM
SINH HỌC CỦA NẤM PYTHIUM SPP. [7], [9], [11]
1.2.1 Bệnh héo rũ cây trồng thuộc họ Bầu bí
Bệnh héo rũ là khái niệm chung, bởi vì triệu chứng của cây bệnh biểu hiện bên
ngoài rất khác nhau.
Cây bị héo có thể do một hay nhiều vi sinh vật cùng xâm nhiễm, có loài xâm
nhiễm trước và là nguyên nhân chính gây bệnh nhưng cũng có nhiều trường hợp rết
khó xác định chính xác tác nhân gâv bệnh khi chuẩn đoán.
Bệnh héo rũ cây trồng thuộc họ Bầu bí là một trong nhừng bệnh phổ biến
trong sản xuất nông nghiệp, bệnh thườn2 xuất hiện và gâv hại ngoài đồng ruộng,
mức độ phát sinh, diễn biến và tác hại của từng loại bệnh rất biến động.
1.2.1.1 Một số loại bệnh héo rũ cây trồng thuộc họ Bầu bí

Bệnh thôi rễ, héo dây do nếm Fusarium oxysporum: bệnh thường xuất hiện
trên cây dưa hấu-xảy ra ở giai đoạn có trái non trở về sau và trên cây dưa leo. Bệnh
biểu hiện khi lá có màu xanh vàng từ lá gốc lan dần lên các lá bên trên, sau đó xuất
hiện triệu chứna héo từng bộ phân của cây-thường ngọn héo vào buổi trưa và tươi
trở lại vào buổi chiều hay sáng sớm, mặt ngoài và bên trons thân cây bệnh có màu
nâu với lớp mốc trắng và chất nhờn xuất hiện ở từng bộ phận câv. Nếu cây bị nhiễm
bệnh lâu, quanh gốc bị bao phủ bởi lớp bào tử màu hồng, chẻ dọc gốc cây bên trong
có màu nâu đỏ, rễ bị thối và có màu mật ong.
Bệnh héo cây con và héo khô do nấm Rhizoctonia solani: bệnh được nhận
diện dễ dàng nhờ dấu hiệu của bệnh, đó là các sợi nấm và hạch nấm phát triển ngay
trên vết bệnh của gốc thân và ăn lan lên thân, bệnh có thể tấn công suốt giai đoạn
sinh trưởng của cây, thường gây thiệt hại nặng ở giai đoạn cây con.
+ Tnệu chứng bệnh ở cây con: cổ thân bị úng và teo tóp lại, rễ vàng và
thôi, cây bị ngã ngang nhưng lá vẫn còn xanh tươi, sau đó lá mới héo dần làm cho
cây con chết.
+ Triệu chứng bệnh ở cây trưởng thành: bệnh xâm nhiễm ở thân, nhất là
phần sốc thân, làm cho mô vỏ bị thôi nâu hoặc nâu đen, lá héo khô rồi rụng dần.
1.2.1.2 Bệnh héo rũ do Pythium spp,
Bệnh héo rũ do Pythium spp. rất phổ biến trên thế giới, chúng xuất hiện trên
ruộng, trong nhà lưới ở nhiều điều kiện khí hậu khác nhau. Pythium spp. có thể tấn
công vào hạt, cây con, cây trưởng thành ở hầu hết các loại thực vật: cây hoa, ngũ
cốc Bệnh gây thiệt hại lớn nhất ở giai đoạn trước khi hạt nhú mầm (reemereence)
và hạt sau khi nhú mầm (postemergence) và giai đoạn cây con.
Triệu chứng bệnh do Pythium spp. ở các giai đoạn khác nhau của cây với
những đặc điểm như sau:
+ Bào tử nảy mầm hay hệ sợi hoại sinh của Pythium spp. trong đất sẽ tiếp
xúc với hạt hay mô non của cây kv chủ do ngẫu nhiên hay do cây thải ra những chất
tiết và nhờ vào tính hóa hướng động mà bào tử động hay hệ sợi của chúng di
chuyển hướng về ký chủ. Khi xâm nhiễm vào hạt, Pythium spp. sẽ tác động vào
phôi, mô rễ, mô thân của ký chủ nhờ pectinase - enzym phân hủy phiến giữa các

vách tế bào, giúp phá vỡ các liên kết giữa các tế bào, sau đó hệ cellulase sẽ hoàn tất
quá trình phân hủv vách tế bào kv chủ.
+ ở thân cây con: Pyĩhium spp. tấn công vào mô vỏ thuộc gốc thân (phần
thân tiếp xúc với đất), sau đó nấm tiếp tục xâm nhiễm vào mô mạch biến mô mạch
có dạng thấm nước về sau có màu vàng, cây con bị nhiêm ở trường hợp nàv sẽ chết
rất nhanh vì mô mạch dẫn bị phá hủy. Nếu bệnh xảy ra ở giai đoạn cây sinh trưởng
tốt, tế bào có vách dàv với thành phần cấu tạo nhiều lignin nấm sẽ bị chặn đứng gần
vết bệnh.
+ Cây trưởng thành hoặc cây già: chúng xâm nhiễm vào gốc thân với vết bệnh nhỏ,
nếu vết bệnh nhiều và đủ lớn sẽ làm cây chậm tăng trưởng nhưng hiếm khi gâv chết.
Tuy nhiên, giai đoạn nấm bệnh chủ yếu tân công vào rễ tại đầu mút rễ và phát triển
mạnh trong tế bào non, trường hợp này cây nhanh chóng bị héo rũ do rễ không có
khả năng hấp thu nước.
1+
/,
&ểnq quan tài liệu
1*2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Pythium spp.
1.2.2.1 Vị trí phân loại
Theo Agrios (1997), Pythium spp. thuộc nhóm nấm bậc thấp có cơ quan sinh
sản là túi bào tử. bên trong chứa bào tử động, với vị trí phân loại như sau:
Giới : Chromista Ngành :
Oomycota Lớp :
Oomvcetes Bộ :
Peronosporales Họ :
Pythiacea Giông :
Pythium
1.2.2.2 Đặc điểm sinh học của Pythium spp.
Pythìum spp. thường sống trong đất, than bùn, cát chúng có hai hình thức
sinh sản:
+ Sinh sản hữu tính (SSHT) tạo ra bào ti/ noãn (oospores)

+ Sinh sản vô tính (SSVT) tạo túi bào tử (sporangia)
Pythium spp. có tơ màu trắng, mảnh, phân nhánh, không vách ngăn ngang,
phát triển nhanh (đường kính khuẩn lạc 4-5 cm sau 2 ngày nuôi cấy), túi bào tử hình
thành giữa sợi nấm hay đầu sợi nấm dạng hình cầu, dạng sợi hay các dạng khác,
Túi bào tữ nảy mầm trực tiếp nhờ hình thành từ một đến vài ống mầm hay
hình thành một đoạn tơ ngắn, cuối đoạn tơ này hình thành thể túi gọi là nang, sau đó
nguvên sinh chất di chuyển từ túi bào tử vào nang để sinh ra hơn 100 bào tử động.
Khi bào tử động được phóng thích, chúng di chuvển trong nước vài phút sau đó
hoặc chúng nảy mầm tạo ông mầm để bắt đầu quá trình xâm nhiễm mới hoặc hình
thành dạng nang để hình thành tạo động bào tử thứ cấp và quá trình trên được lặp
lại.
16
(ễhưưng 1
.
^ĩểnạ quan tài Liệu
Giai đoạn sinh sản hữu tính: hệ sợi của Pythium spp. hình thành túi noãn dạng
hình cầu và túi tinh dạng chùy. Đoạn tơ mang túi tinh có nguồn gô"c từ đoạn tơ
mang túi noãn hay từ đoạn tơ khác trên hệ sợi, túi noãn tiếp xúc túi tinh tạo ra ống
thụ tinh, ông này đi vào bên trong túi noãn để nhân đực di chuvển vào nhân cái của
túi noãn hình thành thể tiếp hợp, cấu trúc như vậy gọi là bào tử noãn.
Bào tử noãn có vách dày, có khả năng chông lại những điều kiện môi trường
không thuận lợi như nhiệt độ môi trường quá cao hay quá thấp, đây là dạng bào tử
nghỉ của nấm. Bào tử noãn nảy mầm cũng giống như túi bào tử: phát triển thành hệ
sợi hay tạo nang bên trong chứa bào tử động.
Có hai trường hợp nảy mầm ở các hình thức sinh sản (SSHT: bào tử noãn,
SSVT: túi bào tử), phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường: nếu nhiệt độ lớn hơn 18°c sự
nảy mầm thích hợp tạo ống mầm, nếu nhiệt độ môi trường từ 10 -18°c thích hợp tạo
động bào tử.
(ễhưđnạ 1
.

Uonạ qiưưi tài
liệu
13 ĐẶC ĐIẾM SINH HỌC CỦA NAM Mốc TRICHODERMA
13.1 Vị trí phân loại của Trichođerma [11], [13],
Trichoderma là chi nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuv nhiên hệ thông phân
loại của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều V kiến khác nhau đưa
ra khi phân loại gicíng nấm này.
Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trickoderma spp. thuộc lớp nấm
bất toàn Deuteromvcetes (fungi imperíect), thứ tự phân loại như sau:
Giới : Nấm
Ngành : Ascomycota
Lớp : Deuteromycetes (nấm bất toàn)
Bộ : Moniliales Họ : Moniliaceae Giông :
Trichoderma
Theo Agrios (1997), Harman (2002) hầu hết Trichoderma spp. có giai đoạn
Hình 1.2. Chu trình gây bệnh thối ướt và thôi hạt của nấm Pythium spp.
-18
-
lẵhiỀẩiiạ,
/.
'lổtỉíỊ quan tài
lụn
sinh sản vô tính (trường hợp này Trichoderma spp. được phân loại thuộc lớp nấm
bất toàn Deuteromycetes, bộ Moniliales), nhưng vài loài Trichoderma spp. cũng có
khả năng sinh sản hữu tính nên được phân vào lớp nấm túi Ascomycetes, bộ
Hypocreales, họ Hypocreacea, giống Hypocrea
13.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
13.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh lý
Trichoderma spp. có khuẩn lạc màu từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục đậm, giông
nàv tăng trưởng rất mạnh, đường kính khuẩn lạc đạt 2 - 9 cm sau 4 ngày nuôi cấv ở

25°c (Elisa Esposito và Manuela da Sìlva, 1998), khuẩn ty không màu mang
cuống sinh bào tử. Cuông sinh bào tử phân nhánh, cuối nhánh có thể bình đính một
số bào tử màu lục liên kết nhau nhờ chất nhày, các bào tử này gọi là bào tử đính,
bào tử đính dạng hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn.
Chú thích:
A, B : nhánh chứa những cuống sinh bào tử c, D : cuống sinh
bào tử E : bào tử đính
Hình 1.3. Một sô" đặc điểm về cơ quan sinh sẵn của T. viriãe
Trichoderma spp. được tìm thấy rất nhiều trong môi trường tự nhiên, đặc biệt
trong môi trường đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp. gỗ.
các loài nấm khác), chung cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ồ mức cao (10%) và sống
được ở đất acid và baz (pH = 3-8).
-19-
lẵhiỀẩiiạ,
/.
'lổtỉíỊ quan tài lụn
1.3.2.2 Đặc điểm sinh hóa
Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp được nhiều loại enzym ngoại bào như
chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease để phân hủy
nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh
của chúng, sau đây là một số hệ enzym điển hình ở Trichoderma.
• Hệ enzym chitinase [18]
Chitin là polvsaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết
câu trúc polyme ở nấm và côn trùng, công thức hóa học: [CịịHisNOsln
Công thức cấu tạo:
CHI™
Hình 1.4* Cấu tạo chitin
Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên ehitin
là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về sô" lượng, chitin thay thế một phần
hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một sô" loài thực vật.

Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các aciđ, cồn,
dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh
(HCl đậm đặc) hoặc bằng enzym vi sinh vật.
-20
-
lẵhiỀẩiiạ,
/.
'lổtỉíỊ quan tài
lụn
Chitinase là enzvm thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C[ và c
4
của
2 đơn vị: [3-1,4- N-acetylglucosamin (GlcNac). Hệ enzvm chitinase được phân làm
3 lớp (Sahai và Manocha, 1993):
1. Chitobiosidase: enzym này giải phóng đơn vị diacetylchitobiose.
2. Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất
kỳ, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose.
Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm.
3. P-l,4-N-acetylglucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose,
diacetylchitobiose thành GlcNac monomer.
Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamin là một đường khử có
nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa man £ đặc tính
của nhóm amino.
Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là
endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N-aeetyl-P-D-ghicosaminidase có
kích thước 70-73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và
cộng sự, 1992), chitobiosidase 40 kDa enzym nàv có thể hoạt động một mình hoặc
kết hợp với enzym endochitinase 42 kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase
28 kDa (Deane và cộns sự, 1998) và p-l,4-N- acetylglucosaminiđase 102 kDa có vai
trò duy nhất trong việc gây biểu hiện các enzym thủy phân chitin khác nhưng chưa

tinh chế được (Haran và cộng sự, 1995).
Chitinase ở Trichoderma spp, được xem là enzym có hoạt tính thủy phân
mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzym khác như p-
glucanase, sự phôi hợp giữa hai enzym này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân.
Mặt khác báo cáo của Lorito (1994) cho biết có sự phôi hợp tác động lên màng tế
bào giữa enzvm thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp.
-21-
lẵhiỀẩiiạ,
/.
'lổtỉíỊ quan tài lụn
• Hệ enzym p- glucanase [16], [17], [38], [42]
p-glưcan trong vách tế bằo nấm thường ở dạng p-L3-glucan và nhánh là dạng p-l,6-
glucan. p-glucanase cũng là một hệ enzym quan trọng của Trỉchoderma spp. trong-
đời sống hoại sinh và ký sinh nâm, gồm 2 lốp enzym chính: p-l,3-glucanase và p-
1,6-glucanase:
p-l,3“glucanase: enzym phân cắt liền kết O-elycosidic của p-l,3-glucan nhờ 2
cơ chế:
1. Exo-p-l,3“glucanase (EC 3.2.1.58) phân cắt giải phóng glueose ở cuối
chuỗi liên kết polymer.
2. Enđo-p-l,3-glucanase (EC 3.2.1.39) cắt liên kết p ở vị trí bất kv trong
chuỗi polysacchariđe, giải phóng oligosaccharide.
Trichoderma spp. phân giải p-l,3-glucan thường kết hợp giữa 2 hoạt tính exo
và endo-P-l,3-glucanase, p-Ẹ3“glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh
và ký sinh nấm, ngoài ra P-Ẹ3-glucanase giúp thực vật chống lại mầm bệnh.
Tùy thuộc thành phần cấu tạo vách tế bào của các loài nấm bệnh khác nhau
Trichoderma spp. tiết p-slucanase ở các mức độ khác nhau, Lorito (1994) đã tách
chiết in viĩro được một endo-p-l,3-glucanase 78kDa có khả năng ức chế sự nảy mầm
bào tử B. cinerea khi phôi hợp với một GlcNAcase.
ở một sô" chủng khác như T. hariianum T-24, El-Katatny (2001) tách chiết
được một endo P-l,3-ducanase có kich thước tương tự, có khả năng ức chê sự phát

triển của Sclerotium rỡựsii khi kết hợp vđi một endochitinase 43kDa. Lorito (1995)
đã tạo dòng sen của p-l,6-endoglucanase kích thước 43kDa, có thể ức chế sự phát
triển của nhiều nấm bệnh khi phôi hợp với các enzym thủy phân khác.
p-l,6-glucanase (EC 3.2.1.75): trong điều kiện đặc biệt, Trỉchoderma spp. tiết
p-l,6“glucanase, enzym này phân cắt liên kết p-l,6-glucan trong vách tê bào nấm.
-22
-
lẵhiỀẩiiạ,
/.
'lổtỉíỊ quan tài
lụn
Hình 1.5. Cấu tạo cellulose
Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D-glucose nối nhau bởi liên kết
Ị3-l,4-glycosiđic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng Cacbon ở rất
nhiều vi sinh vật tiết ra eellulase.
Hệ enzym cellulase ở Trichoderma spp. được phân thành 3 lớp:
1. Exo 13-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) hay Cị (EC 3,2.1.91) giải
phóng đơn vị cellobiosvl từ chuỗi cellulose.
2. Endo (3-1,4 -D-glucanase hay Cx (EC 3.2,1.4) phân cắt liên kết
glucosidic bên trong cấu trúc cellulose.
3. (3-1,4-D-glucosidase phân cắt cello-oligosaccharide thằnh glucose
khử.
Quá trình thủy phân cellulose có sự phôi hợp của ít nhât là hai enzym
cellobiohvdrolase, hai enzvm endoglucanase và một enzym [3 -glucosidase (Hui et
al. 2001), T. reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellưlase, T.
harzianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả khi sử dụng để kiểm soát đốì với
Pvthium, chủng này được biết cũng tạo nhiều loại cellulase.
-23-
lẵhiỀẩiiạ,
/.

'lổtỉíỊ quan tài lụn
• Hệ enzym cellulase [38]
• Hệ enzym protease
Theo Delgado và Jarana (2000) khi khảo sát trên T. harzianum đã xác định
nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc điều kiện môi trường, trong môi trường có
pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon T. hariianum tiết protease acid làm tác
nhân điều hòa, đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase,
glucanase, cellulase, ngược lại protease có tính baz hoặc trung tính được T.
harzianum. sinh ra trong môi trường có nguồn Cacbon khó bị phân hủy như vách tế
bào nấm.
Haab (1990) đã tách chiết được một protease acid 42kDa không nhạv cảm với
pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzym cellulase từ 71 reesei QM 9414 trong
điều kiện tạo cellulase. Một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000),
một protease 73kDa thuộc nhóm protease serin đã được tách chiết khi nuôi cây T.
harzianum.
Protease của Trichoderma spp. có vai trò trong tấn công kỵ chủ bằng cách thủv
phân protein vốn là một phần của bộ khung vách tế bào. Marco (2002) thu nhận
được một protease 18.8kDa của T. hariianum 1051, enzvm này kêt hợp với những
enzym thủy phân khác trong quá trình đối kháng nấm Crinipellis perniciosa gâv
bệnh trên cây Coea.
-24
-
lẵhiỀẩiiạ,
/.
'lổtỉíỊ quan tài
lụn
Bảng 1.1. Một sô"loại enzym thủy phân của T. harzianum
2+
(khưưnụ 1. "lốnọ quan tài lÌỀẤi