Đề cương Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả năng ứng dụng

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu,
liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch. Lectin giữ vai trò quan
trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế
bào với tế bào vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả
năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào. Những đặc tính này làm cho lectin
trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu
miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu
tế bào ung thư…[77].
Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đến
nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng
dụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [23,24]. Các nghiên cứu
về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so với
lectin từ thực vật bậc cao. Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp,
tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với
glycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật) và thuộc nhóm protein rất bền
nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [43]. Với
những tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong
các nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển
khoảng 3260km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy. Trong đó, đã xác định
được 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong Đỏ
(Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngành
rong Lam (Cyanophyta) [58]. Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp cho
việc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin.
Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùng
biển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011, chúng tôi nhận thấy, hơn 90%
dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin. Chúng có khả năng làm
ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm. Trong đó, dịch

chiết từ rong Eucheuma denticulatum thuộc dòng rong Đỏ cho hoạt tính ngưng kết
hồng cầu mạnh nhất với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu [44, 45]. Đồng thời, loài
2
rong này cũng đã và đang được trồng phổ biến ở các vùng khác nhau thuộc tỉnh Khánh
Hòa và Ninh Thuận.
Với những kết quả khảo sát sơ bộ và cơ sở nêu trên, đề tài được thực hiện
“Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo sát khả
năng ứng dụng”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu điều kiện tối ưu để thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma
denticulatum.
Nội dung nghiên cứu
• Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thu nhận lectin.
• Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
• Đánh giá các đặc tính của lectin thu nhận được.
• Đánh giá khả năng của lectin kháng một số vi khuẩn gây độc cho người.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến của đề tài:
Đề tài "Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong Đỏ Eucheuma denticulatum và khảo
sát khả năng ứng dụng” không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học, nhằm khai thác một
hợp chất hoạt tính sinh học mới từ rong biển để sử dụng làm thuốc thử chẩn đoán một
số vi khuẩn gây bệnh cho người, mà còn góp phần nâng giá trị kinh tế.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN
1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển
Rong biển là một loài thực vật sinh sống ở biển. Chúng mọc trên các rạn san hô,
vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời
chiếu tới để quang hợp. Sự có mặt của rong biển trong thủy vực không chỉ đóng vai trò
quan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồn
cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển khác [4].

Ở nước ta có khoảng hơn 1000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển các
tỉnh phía Nam và phía Bắc. Với hơn 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam.
Trong đó, có các đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ
(Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún
(Enteromorpha) [31].
1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN
1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin
Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng
đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu. Tuy
nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ
nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho
các mục đích y tế. Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của
các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch
lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein.
Những protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực
vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật. Tuy nhiên, tất cả các nhà
khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin
là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat
(nay là trường đại học Tartu, Estonia) vào năm 1888. Chất hemagglutinin được
Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin,
một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [34].
Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc
liên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít
nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [47]. Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện
hoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã phân chia lectin thành 3 loại:
4
• Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên
kết đường, do đó không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp
chất liên kết đường. Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan
(Orchidaceae).

• Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả năng
gây ngưng kết tế bào và gây tủa, do tương tác với nhiều loại hợp chất cộng hợp đường.
Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện
bởi vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là
hemmagglutinin.
• Chimerolectin là những phân tử, trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với
đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học).
Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom typ 2 (RIP, Type 2) có trong hạt thầu
dầu (Ricinus communis L.,) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.).
Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu
vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin, để sử dụng chúng một cách
thiết thực và có hiệu quả hơn. Hiện nay các nhà khoa học đã hiểu biết khá nhiều về
bản chất của lectin. Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như
sau: “Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết
thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của
carbohydrate được liên kết. Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc
glycolipid bề mặt. Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử
lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử
dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật
khác nhau” [61].
1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới
 Sự phân bố lectin trong giới thực vật
Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng
trong các cơ quan như thân, lá và hạt. Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành
điều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các
cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [9]. Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài
lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ
(Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa
lectin [12].
5

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được
trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [6]. Lectin từ họ
Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis),
Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2].
Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của
lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y
(Lichenes) và Rong (Algae). Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và
cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [18], từ đó đến nay đã có
hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác
nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[58].
Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu
khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực
vật [8].
 Sự phân bố lectin trong giới động vật
Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm. Lectin trong
giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus
polyphemus). Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật
thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra. Ở Việt Nam, khi khảo sát
30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa xuất hiện 10
loài có chứa lectin [8].
Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều
tra cơ bản. Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia),
lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin.
Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata)
hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)… Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô
người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ
miễn dịch cũng chứa lectin. Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin. Đó
cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [14].
 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật
Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện là vào năm 1942, khi Hirst và cộng

sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [8]. Sau này, một
số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã phát
hiện thấy lectin ở một số loài virus khác [51].
Trên đối tượng là vi khuẩn E. coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế
bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào. Hoạt tính này mất đi
6
khi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó. Đó chính là
lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn. Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một số
loài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và cộng sự năm 1984 [45].
Cấu tạo của lectin từ rong biển
 Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển
Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di
trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion
hóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry), khối lượng phân tử
của khá nhiều dạng lectin đã được xác định. Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượng
phân tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốc
khác nhau thì khối lượng có thể giống nhau hoặc khác nhau.
Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử nhỏ nhất là lectin của
Hypnea japonica thuộc dòng rong Đỏ, khoảng 4,2 kDa. Trong khi đó lectin có khối
lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong Đỏ, Ptilota plumose, gồm một chuỗi
polypeptide khoảng 170 kDa [50, 33].
Năm 1986, Rogers đã tinh chế lectin từ rong lục Codium fragile và đã xác định
khối lượng phân tử của nó là 60 kDa, bao gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khối lượng
là 15 kDa cấu tạo nên [50]. Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8 đến
3,9. Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Jong Won Han và các cộng sự (2011) đã
xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa là 11,5 kDa, lectin này ở dạng đơn
phân [33].
Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin
và đã cho thấy mức độ biến đổi khá mạnh của chúng. Tuy nhiên, so với khối lượng
phân tử của lectin từ thực vật bậc cao như lectin từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis

L.,) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus)
có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rong
biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45
kDa. Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối
lượng phân tử lectin và hoạt tính của chính nó. Khối lượng phân tử của lectin không
mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa
của loài hay cá thể đó [8].
 Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển
Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, khi nghiên cứu trình tự
axit amin trong phân tử lectin từ rong biển các nhà khoa học đã nhận thấy: trình tự axit
amin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa. Khi nghiên
7
cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 3 loài rong cùng chi Eucheuma là E. serra,
E. amakusaensis và E. cottonii, Kawakubo và cộng sự đã cho biết: trình tự của 20 axit
amin đầu N của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu các
gốc Glx, Asx, Gly và Ser [35, 36].
Có khá nhiều công trình đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biển
được cấu tạo từ một mạch polypeptide. Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạch
polypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị
này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau. Ví dụ như lectin từ rong đỏ
Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là
59,6 và 15,2 kDa [22], trong khi đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo
tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15 kDa.
Hori và cộng sự nghiên cứu cấu trúc bậc nhất của 2 đồng phân lectin hypnin A-
1 và hypnin A-2 từ rong đỏ Hypnea japonica cho thấy: chúng có cấu tạo đơn phân chỉ
do một chuỗi polypeptide gồm 90 gốc axit amin tạo thành; trong đó, có 4 gốc cystines
tạo thành 2 cầu nối disulfide: cys
5
-cys
62

và cys
12
-cys
89
; 3 loại axit amin là serine,
glycine và proline chiếm đến 43% số gốc axit amin có trong chuỗi polypeptide; trình
tự axit amin của 2 lectin này chỉ khác nhau ở 3 vị trí: 19, 31 và 52, sự khác nhau của
các gốc axit amin này không ảnh hưởng đến sự giống nhau về hoạt tính ngưng kết
hồng cầu cũng như khả năng liên kết với một số glycoprotein của 2 loại lectin này.
Mặt khác, ngoài glycoprotein, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng còn bị ức chế
bởi protein phospholipase A-2, điều này cho phép chúng ta nhận định rằng lectin
hypnins không chỉ chứa vị trí liên kết với carbohydrate mà còn chứa vị trí liên kết với
protein. Với trọng lượng phân tử chỉ xấp xỉ 9,1 kDa cùng với 2 cầu nối disulfide, đây
được xem là 2 yếu tố chính làm tăng khả năng chịu nhiệt của 2 lectin này. Không
những vậy, khi alkyl hóa hoặc cắt đứt cầu disulfide, Hori cũng nhận thấy hoạt tính
ngưng kết hồng cầu của chúng cũng bị mất đi, từ đây có thể đưa ra giả định rằng trung
tâm hoạt động của 2 lectin này có chứa cầu nối disulfide [22].
Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hoặc cấu trúc không gian phức
tạp đều chứa trung tâm hoạt động. Đó là trung tâm liên kết carbohydrate. Chính trung
tâm này quyết định hoạt tính của lectin. Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của
chúng là các gốc axit amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâm
hoạt động của chúng là do một số gốc axit amin như tyrozine, xerine, treonine,
tryptophan… có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên. Các dạng lectin
8
khác nhau thì có thành phần axit amin trong trung tâm hoạt động là khác nhau. Cho
đến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp [28, 19].
1.2.3 Một số tính chất và sinh học của lectin từ rong biển
 Tính tan và kết tủa
Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa
tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng. Lectin

có bản chất là protein nên chúng có thể đuợc kết tủa bởi một số tác nhân hóa như:
ethanol, acetone, một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là ammonium
sunphate.
 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó
Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được tách
chiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đường
đơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết với
các glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: porcine stomach mucin,
lactotransferrin, asialofetuin…[39, 57].
Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phức
tạp. Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sử
dụng lectin. Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có
thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó
[31]. Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein
để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu. Gần đây, dựa vào các
loại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế
nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin
để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học.
 Khả năng gây ngưng kết tế bào
Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và
người. Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin. Số lượng lectin có khả năng
ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít, vì chúng đồng thời có thể
gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa…. Theo tác giả
Allen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứa
lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu. Lectin từ
rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ
rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể
9
ngưng kết với các nhóm máu khác của người như O, B hay AB [50]. Các lectin đặc
hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng.

Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người
và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng
tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi…
[55].
1.3 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN
Lectin từ rong biển đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau của đời sống. Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:
 Lectin trong huyết học
Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn
còn được áp dụng rộng rãi. Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quả
nhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này
đòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao.
Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng
trong nhiều năm nay. Lectin từ rong Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm
máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu máu A đã
xử lý papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB
[50].
 Lectin trong tế bào học
Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế
bào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thông
qua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào.
Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một
công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà phần lớn là
Glu-NAc.
 Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc
Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ
và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoprotein
đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự
chết.
10

Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng
Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng
Liên kết
đặc hiệu
Tác giả
Gracilaria
cornea (rong
Đỏ)
Boophilus
microplus
Làm côn trùng
chậm phát
triển, giảm
trọng lượng
trứng và lượng
trứng nở thành
con…
Fetuin, porcine
stomach mucin
Lima et al
2005 [41].
Gracilaria
ornate (rong
Đỏ)
Callosobruchus
maculatus
Làm côn trùng
chậm phát
triển…
Fetuin, porcine

stomach mucin
Leite et al 2005
[39].
 Lectin trong y học
Lectin có tiềm năng rất lớn trong nhiều lĩnh vực. Lectin được sử dụng như một
công cụ chẩn đoán có hiệu quả. Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển
của một số vi sinh vật, lectin từ rong biển được sử dụng kết hợp với các xét nghiệm
thông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển.
Dịch chiết lectin từ rong Eucheua serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển
của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vobrio vulnificus, 2 loại vi
khuẩn này gây bệnh ở cá [40]. Lectin từ một số loài rong nâu như Fucus vesiculosus,
Dictyopteris membranacea, Fucus serratus…có khả năng gây ngưng kết và ức chế sự
phát triển của các chủng nấm nhầy gây bệnh như Candida guilliermondi [60].
Lectin từ một số loài rong đỏ như Eucheuma serra, Oscillatoria agardhii hay
Griffithsia sp. có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose N-
glycan ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của
màng tế bào HIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khả
năng mắc bệnh [31].
Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩn
đoán các bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học và
miễn dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất
trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [8].
11
 Lectin trong virus học
Gần đây, lectin từ rong biển đang được xem là nguồn sản phẩm tự nhiên phong
phú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ. Ví dụ như grifftithsin (GRFT) [31],
Oscillatoria agardhii (OAA) (Sato et al, 2007) [32], Eucheuma serra (ESA-2) [53]
những lectin này đã cho thấy hoạt tính rất mạnh kháng lại virus HIV và những virus
khác. Không giống như phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những
lectin có khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm

nhập vào tế bào vật chủ của virus. Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được
nhiệt độ cao, pH thấp, không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein
trên bề mặt lớp vỏ của virus. Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan
tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai.
1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài
 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào
năm 1966, ông đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng
cầu ở người [31]. Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong
rong biển:
• Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng kết hồng cầu của 31 loài rong biển
trên hồng cầu người và động vật. Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạt
tính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế
bào rong biển. Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [29].
• Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong
trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển. Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự
đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ,
rong nâu và rong lục. Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biến
nhất [31,23].
• Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở
nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ,
Châu Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam cực. Hơn thế nữa, không chỉ dừng lại ở việc
khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng
đã được chú tâm đến [25,15].
Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặc
tính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậc
cao [31]. Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở một số dòng
12
rong đỏ như: Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum; Solieria filiformis [22];
Pterocladiella capillacea [57] ….Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã

được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc 1 như: H. japonica và Vidalia obtusiloba [22].
 Tình hình nghiên cứu trong nước
Khác với lectin từ thực vật cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rong
biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện nghiên cứu
và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên
cứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau Kết quả cho thấy, hầu
hết các loài rong biển đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ
động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu A, B, O của người. Một số tính chất
hóa sinh như liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng
dụng của các lectin này cũng đang được nghiên cứu [30, 31].
13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Rong Đỏ Eucheuma denticulatum thu ở vùng biển
Khánh Hòa – Ninh Thuận.
2.2.1 Vật liệu, hóa chất
 Vật liệu
Mẫu rong Eucheuma denticulatum thu ở vùng biển Khánh Hòa – Ninh Thuận.
Hồng cầu của máu thỏ, cừu, ngựa và gà lấy từ Viện Vaccine - Nha Trang. Hồng
cầu các nhóm máu A, B, O ở người lấy từ Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa.
 Hóa chất
Các loại đường và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, L-fucose,
D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p-
nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, laminaran, transferrin, fetuin,
porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan… (Merck-Đức).
Sephadex G-75 của (Pharmacia, Uppsala-Thụy Điển).
Hóa chất phân tích các loại.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong
E.denticulatum

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách
chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết…thì các yếu tố còn lại
được cố định. Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp tục
khảo sát đến các yếu tố khác.
 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum bằng dung dịch đệm phosphate
(PBS 0,05M 0,85% NaCl) với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:2, 1:4, 1:6, 1:8,
1:10, 1:12, 1:14, ở nhiệt độ 4
o
C và thời gian chiết là 3 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ
6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR)
của từng DC. So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) thích hợp.
 Khảo sát dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum trên 3 hệ dung môi: nước cất,
phosphate (PBS 0,05M 0,85% NaCl) và ethanol 30% với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi
14
(w/v) thích hợp đã khảo sát ở trên, nhiệt độ chiết 4
o
C và thời gian chiết 3 giờ. Sau đó,
ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra
loại dung môi chiết thích hợp.
 Khảo sát nồng độ dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum với hệ dung môi thích hợp đã
được xác định ở trên với các nồng độ khác nhau, với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi
(w/v) thích hợp, nhiệt độ chiết 4
o
C và thời gian chiết 3 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ
6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.

Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra
nồng độ dung môi chiết thích hợp.
 Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum với các khoảng thời gian khác
nhau: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 (giờ), với hệ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v)
thích hợp đã được xác định và nhiệt độ chiết 4
o
C. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000
vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra
thời gian chiết thích hợp.
 Khảo sát nhiệt độ chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum với các nhiệt độ khác nhau: 4, 10,
20, 30, 40 (
o
C), với hệ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) và thời gian chiết
thích hợp đã được xác định. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút,
thu DC.
Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra
thời gian chiết thích hợp.
2.2.2. Khảo sát các nhân tủa và nồng độ thích hợp để thu chế phẩm lectin kỹ
thuật
Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein lectin ở những
nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt độ NKHC sau khi kết tủa.
Tiến hành khảo sát khả năng tủa protein lectin từ DC bằng các tác nhân ở các nồng độ
khác nhau.
Tiến hành khảo sát các tác nhân kết tủa protein lectin có trong DC rong:
acetone, ethanol ở nhiệt độ tủa 0
o
C và ammonium sunfate (NH

4
)
2
SO
4
ở nhiệt độ tủa 4
o
C, thời gian tủa 4 giờ.
Hệ tác nhân tủa khảo sát gồm:
15
- Tủa bằng ethanol được làm lạnh, với các tỷ lệ DC : ethanol (v/v): 1:1, 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7.
- Tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
, nồng độ tủa theo % bão hòa (NH
4
)
2
SO
4
: 60, 65,
70, 75, 80, 85 và 90%.
- Tủa bằng acetone được làm lạnh, với các tỷ lệ DC : acetone (v/v): 1:1, 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7.
Chế phẩm kỹ thuật (CPKT) được thu nhận bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4
o

C,
tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, hòa với dung dịch PBS 0,05M pH 7,0 (lượng ít
nhất) để đưa về cùng thể tích. Sau đó, tiến hành xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu
hồi của CPKT, từ đó chọn ra tác nhân và nồng độ tủa thích hợp.
16
CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN NỘI DUNG, TIẾN ĐỘ, ĐỊA ĐIỂM VÀ KINH PHÍ THỰC
HIỆN ĐỀ TÀI
1 Dự kiến nội dung:
• Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thu nhận lectin.
• Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
• Đánh giá các đặc tính của lectin thu nhận được.
• Đánh giá khả năng của lectin kháng một số vi khuẩn gây độc cho người.
2 Tiến độ thực hiện:
Bảng 1. Tiến độ thực hiện đề tài
TT Nội dung nghiên cứu
Thời gian
dự kiến
Địa điểm
Kinh phí
dự kiến
(triệu đồng)
1
Đọc tài liệu, thu thập thông tin và
Xây dựng đề cương
11/2012
Viện Nghiên
cứu và Ứng
dụng Công
nghệ Nha
Trang

5
2
Nghiên điều kiện tối ưu để thu nhân
lectin
12/2012 –
2/2013
- nt- 10
3
Tinh sạch và xác định tính chất của
lectin bao gồm đặc tính liên kết
carbohydrate của lectin và ảnh
hưởng của pH, nhiệt độ và cation
hóa trị hai đến hoạt tính của lectin.
2/2013 –
4/2013
- nt- 25
4
Đánh gía khả năng của lectin kháng
một số vi khuẩn gây hại cho người
4/2013-
5/2013
5
5 Xử lý số liệu và viết báo cáo
5/2013-
6/2013
- nt-
6 Bảo vệ
3 Địa điểm thực hiện:
Viện Nghiên Cứu Công và Ứng dụng Công nghệ Nha trang.
Phòng Công nghệ sinh học biển.

17
18
PHỤ LỤC
1. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75
 Nguyên tắc
Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng
phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những chất có kích thước lớn
đi len lõi ở bên ngoài các hạt gel, di chuyển nhanh và ra ngoài trước. Trong khi đó
những phân tử có kích thước nhỏ thì chui vào bên trong lỗ gel nên di chuyển chậm, ra
khỏi cột sau.
Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thiết lập như sau:
- Gel: Sephadex G-75
- Kích thước cột: đường kính 1cm, chiều cao 30cm.
- Đệm: PBS 0,05M pH 7 (đã loại khí)
- Thể tích mẫu: 1mL
- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 1mL/phân đoạn
- Số lượng phân đoạn: 40 phân đoạn
2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương
pháp điện di SDS-PAGE [38]
 Nguyên tắc
Điện di là sự dịch chuyển các chất có điện tích trong điện trường, tốc độ dịch
chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của chất đó.
SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là
một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một
tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein
được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol. Với các tác
nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1)
và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các
phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di

chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước
nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường
so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng
phân tử khác nhau đã biết.
 Đổ gel
 Gel phân tách 12,5% (Separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch:
Acrylamide/Bis (15,5:1) 3,8 mL
19
Tris – HCl 3M; pH 8.8; 0,8 % SDS 5 mL
Glycerine 2 g
Nước cất 4,2 mL
APS 10% 50 µL
TEMED 5 µL
Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau
đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ
gel đông (khoảng 2 giờ).
 Gel cônông độ (Stacking gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác:
Acrylamide/Bis (15,5:1) 1 mL
Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS 3,1 mL
Nước cất 8,4 mL
APS 10% 100 µL
TEMED 10 µL
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đỗ hết nước bên trên. Tiến
hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn.
Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn
gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung
dịch điện di vào buồng điện di.

 Tiến hành chạy điện di
Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng. Tiến hành chạy điện di với
dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch
chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm.
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-
250, trong 30 phút. Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch
giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước). Protein sẽ được phát hiện nhờ các
vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
 Xác định trọng lượng phân tử của protein
Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng
protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối
cùng).
Tính giá trị Rf.
Khoảng cách di chuyển của protein lectin
20
Rf =
Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf
trên, nhờ phương pháp ngoại suy theo đồ thị.
Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng
vạch protein. Kết quả được trình bày trong bảng 2.3 (phụ lục A). Từ đó, xây dựng
phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của
các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.
3. Phương pháp khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin
Tiến hành khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin với một số loại
đường và glycoprotein được liệt kê trong bảng 2.4.
Khảo sát khả năng liên kết của lectin với một số loại đường và glycoprotein
Đường (100mM) Glycoprotein (2000µg/mL)
• D-glucose
• D-mannose
• D-galactose

• L-fucose
• D-xylose
• D-glucosamine
• D-gluconic acid
• p-nitrophenyl-D-galactoside
• p-nitrophenyl-D-glucoside
• p-nitrophenyl-D-mannoside
• Transferrin
• Fetuin
• Yeast mannan
• Porcine thyroglobulin
• Asialo-porcine thyroglobulin
• Bovine thyroglobulin
• Asialo-bovine thyroglobulin
• Bovine submaxillary mucin
• Asialo-bovine submaxillary mucin
• Porcine stomach mucin
 Tiến hành
- Sử dụng đĩa 96 giếng đáy chữ V. Cho 25µL NaCl 0,85% vào các giếng.
- Cho 25µL dung dịch đường hoặc glycoprotein vào giếng số 1 và số 2, rồi pha
loãng 2 lần theo từng hàng bắt đầu từ giếng số 2.
- Cho 25µL dung dịch lectin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ và giữ ở nhiệt độ phòng
trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ, cho 25µL huyền phù hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào mỗi giếng.
Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
 Đọc kết quả
- Nếu hoạt độ NKHC của lectin không thay đổi: lectin không có khả năng liên
kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra.
Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)
blue

21
- Nếu hoạt độ NKHC của lectin giảm: lectin đã liên kết với đường hoặc
glycoprotein được kiểm tra. Nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein
(2000µg/mL) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn (nghĩa
là lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein kiểm tra), được tính theo công thức:
Trong đó:
C
min
: Nồng độ phản ứng nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (µg/mL)
mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn.
C: Nồng độ của đường và glycoprotein. (Nồng độ đường: 100mM; Nồng độ
glycoprotein: 2000µg /mL).
HI: Giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt độ NKHC vẫn còn bị ức chế, sau
khi lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein.
4. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong
E.denticulatum
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong E.denticulatum bằng phương
pháp khuếch tán trên giếng thạch.
 Tiến hành
- Chuẩn bị dịch huyền phù của vi khuẩn đã được nuôi cấy qua 24 giờ với mật độ
khoảng 10
9
tế bào/mL. Trải dịch huyền phù vi khuẩn lên môi trường thạch trong đĩa
petri.
- Sử dụng thanh kim loại vô trùng để tạo thành những giếng nhỏ có đường kính
khoảng 5mm trên bề mặt môi trường thạch.
- Nhỏ một lượng lectin nhất định vào mỗi giếng của đĩa thạch. Hoạt chất lectin sẽ
khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo
vòng vô khuẩn.
- Ủ đĩa ở 37

0
C. Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính
vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tùy thuộc vào đường kính vòng vô
khuẩn lớn hay nhỏ.
 Vi khuẩn thí nghiệm
Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ
rong E.denticulatum
Kí hiệu Vi khuẩn
T1 Staphylococcus hominis
T2 Bacillus cereus
T3 Pseudomonas aeruginosa
22
T4 Enterobacter aerogenes
T5 Enterobacter cloacae
T6 Proteus mirabilis
T7 Klebsiella pneumoniae
T8 Clostridium perfringens
T9 Serratia liquefaciens
T10 Acinetobacter baumannii
T11 Vibrio parahaemolyticus
T12 Vibrio harveyi
5. Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu [28]
Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của
lectin là hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin.
 Tiến hành:
- Cho 25µL NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V.
- Thêm 25µL mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào
giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là
1/2
n

(n: số lần pha loãng).
- Tiếp tục cho 25µL hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng.
- Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
 Đọc kết quả:
- Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.
- Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.
 Đơn vị hoạt độ
1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC trên 1 mL (HU/mL) chính
là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng
làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.
 Hoạt độ lectin được xác định theo 2 chỉ số:
- Hoạt độ tổng (U
tổng
): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất
định. Đơn vị: HU
U
tổng
= V. 2
n
Trong đó: V: tổng thể tích (mL)
n: số lần pha loãng
- Hoạt độ riêng (U
riêng
): là số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein. Đơn
vị: HU/mg
23
Trong đó: U
tổng
: tổng số đơn vị hoạt tính.
Protein

tổng
: tổng hàm lượng protein.
6. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm
1951 [5], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất
chuẩn.
 Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với
thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng
độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang
điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được
hàm lượng protein ở nồng độ vài chục micro gram (µg).
 Hóa chất
Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na
2
CO
3
(2%) pha trong 1000mL nước
cất.
Dung dịch B: 0,5g CuSO
4
.5H
2
O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%)
hoặc trong dung dịch Natri-Kali Tactrat 1%.
Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi sử
dụng).
Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.
Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
 Các bước tiến hành

Cân 10mg BSA hòa tan trong 10mL nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng
độ 1mg/mL. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40,
60, 80, 100 và 120µg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
Lấy chính xác 0,5mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống
nghiệm, thêm vào đó 2,5mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm
vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và
để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước
sóng 750nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi
quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường.
Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã nêu
trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính
giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.
24
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Balzarini J (2007). Targeting the glycans of glycoproteins: a novel paradigm for
antiviral therapy. Nat Rev Microbiol 5: 583–597.
2. Duvet S, Cocquerel L, Pillez A, Cacan R, Verbert A, Moradpour D, Wychowski C,
Dubuisson J (1998). Hepatitis C virus glycoprotein complex localization in the
endoplasmic reticulum involves a determinant for retention and not retrieval. J Biol
Chem 273: 32088–32095.
3. Hori K, Sato Y, Ito K, Fujiwara Y, Iwamoto Y, Makino H, Kawakubo A (2007)
Strict specificity for high mannose-type N-glycans and primary structure of a red alga
Eucheuma serra lectin. Glycobiology 17: 479-491.
4. Lê Đình Hùng (2009a) Một vài tính chất của lectin từ rong đỏ. Hội nghị Công
nghệ sinh học toàn quốc ở Thái nguyên 26-27/11/2009, Tr: 177-181.
5. Le Dinh Hung, Sato T, Shibata H, Hori K (2009b) Biochemical comparison of
lectins among three different color strains of the red alga, Kappaphycus alvarezii. Fish
Sci 75: 723-730
6. Le Dinh Hung, Sato Y, Hori K (2011). High-mannose N-glycan-specific lectins

from the red alga Kappaphycus striatum (Carrageenophyte). Phytochemistry 72: 855-
861.
7. Kawakubo A, Makino H, Ohnishi J, Hirohara H, Hori K (1997) The marine red
alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins. J Appl
Phycol 9: 331-338
8. Li Y, Cleveland B, Klots I, Travis B, Richardson BA, Anderson D, Montefiori D,
Polacino P, Hu S (2008). Removal of a single N-linked glycan in human
immunodeficiency virus type 1 gp120 results in an enhanced ability to induce
neutralizing antibody responses. J Virol 82: 638–651.
9. Miyoshi E, Nakano M (2008) Fucosylated haptoglobin in a novel marker for
pancreatic cancer: Detailed analysis of oligosaccharide structures. Proteomics 8:
3257-3262.
25
10. Mori T, O’Keefe BR, Sowder RC II, Bringans S, Gardella RS, Berg S, Cochran P,
Turpin JA, Buckheit RWJr, McMahon JB, Boyd MR (2005) Isolation and
characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga
Griffithsia sp. J Biol Chem 280:9345-9353.
11. Pinto VPT, Debray H, Dus D, Teixeira EH, Oliveira TM, Carneiro VA, Teixeira
AH, Filho GC, Nagano CS, Nascimento KS, Sampaio AH, Cavada BH (2009) Lectins
from the red marine algal species Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion
triquetrum as tools to differentiate human colon carcinoma cells. Advances in
Pharmacological Sciences. Doi:10.1155/2009/862162.
12. Okuyama S, Nakamura-Tsurura S, Tateno H, Hirabayashi J, Matsubara K, Hori K
(2009). Strict binding specificity of small-sized lectins from the red alga Hypnea
japonica for core (alpha1-6) fucosylated N-glycans. Biosci Biotechnol Biochem 73:
912-920.
13. Ritchie G, Harvey DJ, Feldmann F, Stroeher U, Feldmann H, Royle L, Dwek LA,
Rudd PM (2010). Identification of N-linked carbohydrates from severe acute
respiratory syndrome (SARS) spike glycoprotein. Virology 399: 257- 269.
14. Sato Y, Morimoto K, Hirayama M, Hori K (2011a). High mannose-specific lectin

(KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus
infection in a strain-independent manner. Biochem and Biophys Research
Communications 405: 291–296.
15. Sato Y, Hirayama M, Morimoto K, Yamamoto N, Okuyama S, Hori K (2011b)
High mannose-binding lectin with preference for the cluster of α1–2-mannose from the
green alga Boodlea coacta is a potent entry inhibitor of HIV-1 and influenza viruses.
J Biol Chem 286: 19446–19458.
16. Sharon N, Lis H (2003) Lectins (second edition), Kluwer Academic Publishers,
The Netherlands
17. Sugahara T, Ohama Y, Fukuda A, Hayashi M, Kato K (2001) The cytotoxic effect
of Eucheuma serra agglutinin (ESA) on cancer cells and its application to molecular
probe for drug delivery system using lipid vesicles. Cytotechnology 36: 93-99.