Các phường pháp sắc ký cột

SẮC KÝ CỘT
I. NGUYÊN TẮC
II. KỸ THUẬT TRIỂN KHAI
III. RỬA CỘT
IV. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
NGUYÊN TẮC
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong
một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha
tĩnh.
Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi
là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng
vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.
Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ
và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần
lượt trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel,
CaCO
3
, than hoạt tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn
hóa.
Dung môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ
thích hợp.
Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng
dần.
Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có
nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán
sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ.
Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có
đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.
NGUYÊN TẮC
KỸ THUẬT TRIỂN KHAI

a. Chuẩn bị cột
Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch).
Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột.
Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
- Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương
phình như Silicagel, Sephadex …
- Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng
trương nở như Al
2
O
3
, CaCO
3
.
b. Đưa chất phân tích vào cột
Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng
đồng đều trên mặt thoáng phẳng.
Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:
- Phương pháp dùng đĩa giấy
- Cho thẳng dung dịch thử lên cột
- Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ:
Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn
đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp
đều trên mặt cột.
Trong 3 cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và
nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau:
•
Chất thử hoà tan hoàn toàn.

•
Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều.
•
Khi toàn bộ chất thử đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi
mới.
•
Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột. Nếu chất
thử ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau là
chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo.
RỬA CỘT
Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột.
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có
thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén.
Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào
trọng lực.
Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí
nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột.
Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào
việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để
giải ly dung môi ra khỏi cột.
Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy
thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly.
Ở sắc ký cột cổ điển, thường dùng dung môi tinh khiết có độ phân
cực tăng dần để rửa cột.

Khi sử dụng silicagel đảo pha làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp
thu tỉ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký. Pha động sử dụng
thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước. Như vậy
các thành phần phân cực sẽ được giải ly ra trước thành phần không
phân cực. Phương pháp này được ứng dụng rất hiệu quả đối với các
hợp chất có độ phân cực mạnh cao trong thực vật như: saponin hay
triterpen.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ
bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần.
Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột thì sẽ làm gãy cột.
Nguyên nhân do các chất hấp phụ như Al
2
O
3
hoặc silicagel khi được
trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt làm cho
dung môi bốc hơi cục bộ sẽ tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả
tách sẽ không tốt.
Vận tốc chảy của dung môi rửa cột cũng phải điều chỉnh cho phù hợp;
Tốc độ di chuyển của một chất trên mặt hấp phụ phụ thuộc vào dung
môi .
Bảng sắp xếp dưới đây của Trappe theo thứ tự tăng dần lực phản hấp
phụ của một số dung môi:
Ether dầu hỏa - cyclohexan - carbon tetraclorur - tricloroetylene -
toluen - benzen - methylclorur - chloroform - ether ethylic -
ethylacetat - pyridin- aceton - n-propanol - ethanol - methanol - nước
Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách
được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi .
Một số hỗn hợp dung môi thường dùng cho các hợp chất phân cực
(dùng cho sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng)

CHẤT HẤP PHỤ CỔ ĐIỂN
1
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 15:12:2
2
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 8:4:1
3
BuOH/AcOH/H
2
O 4:1:5
4
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 13:7:2
5
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 7:3:1
6

CHCl
3
/MeOH/EtOAc/ H
2
O 2:2:4:1
7
BuOH/ EtOAc/ H
2
O 4:1:2
8
CHCl
3
/MeOH /H
2
O 13:7:1
9
EtOAc/Acetone/MeOH/H
2
O 10:10:1:1
10
Benz/Dioxane/AcOH 90:25:4
11
Benz/MeOH/AcOH 45:8:4
12
EtOAc/ Acetone/MeOH/H
2
O 10:10:1:1
13
BuOH/AcOH/H
2

O 4:1:2
14
EtOAc/AcOH/H
2
O 100:16:13
15
Benz/Acetone/AcOH 75:25:1
CHẤT HẤP PHỤ ĐẢO
1
MeOH/H
2
O 1:2
2
MeOH/H
2
O 1:1
3
MeOH/H
2
O 2:1
4
CH
3
CN/MeOH/H
2
O 1:1:1
5
H
2
O/ CH

3
CN/AcOH 7:2:1
Theo dõi quá trình giải ly cột:
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột
có thể được theo dõi bằng mắt thường.
Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc
hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo
để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ
dung môi tách tốt nhất.
Khi chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể
tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải
ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực
hành.
SẮC KÝ CỘT NHANH (Flash chromatography)
Xuất phát từ yêu cầu thực tế là cần phải có một phương pháp tách
và tinh chế các hợp chất thiên nhiên với một lượng mẫu nhỏ, thời
gian tiến hành nhanh chóng và làm giảm bớt khả năng phân hủy của
các chất có thể gặp trong trường hợp sắc ký cổ điển.
Phương pháp sắc ký nhanh đã được nghiên cứu và công bố đầu tiên
bởi W. CLARK STILL , MICHEAL KAHN, ABHIJIT MITRA vào
năm 1978 và được đăng ký bằng phát minh vào năm 1981 (US Patent
4293422).
Sắc ký nhanh là kỹ thuật sắc ký lỏng có sự tác dụng của áp suất
không khí, thực hiện trên một cột thủy tinh ngắn.
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký nhanh (FC) rất đơn giản,
dụng cụ rẻ tiền, sự tách được thực hiện nhanh chóng và có hiệu
quả cao.
Trong phương pháp sắc ký cột nhanh, người ta sử dụng cột thủy

tinh ngắn với các đường kính thích hợp từ 10-50mm tùy thuộc vào
lượng mẫu phân tích. Dưới đáy cột có gắn một vòi có khóa để dẫn
dung dịch ra ngoài.
Bộ phận điều chỉnh áp suất và tốc độ dòng chảy gồm bộ phận dẫn
khí nén có lắp một van điều chỉnh tốc độ chảy.
Đường kính
cột (mm)
Thể tích
dung môi
rửa (ml)
Lượng mẫu cho vào (mg) Phân đoạn
(ml)
4R
f
≥0,2 4R
f
≥0,1
10 100 100 40 5
20 200 400 160 10
30 400 900 360 20
40 600 1600 600 30
50 1000 2500 1000 50
Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung môi
Chất nhồi cột:
Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu là silicagel với các cỡ hạt nhỏ 40-
60mm (230-400 mesh)
Dung môi rửa cột:
Dung môi nên có độ nhớt thấp như: CHCl
3
, EtOAc, MeOH.

Dùng SKLM để tìm hệ dung môi thích hợp sao cho R
f
≥ 0,35.
Việc tách đạt hiệu quả tốt nếu sự khác biệt về hằng số R
f
của các
chất trong hỗn hợp đạt điều kiện R
f
>0,15. Nếu không đạt yêu cầu
trên thì có thể dùng giải pháp tăng chiều dài cột và giảm lượng mẫu
phân tích và điều chỉnh hệ dung môi.
Hệ dung môi dùng cho pha thường là các dung môi có độ phân
cực thấp như ether dầu hỏa, hexan, ethyl acetat.
Hệ dung môi dùng cho pha đảo thường là các dung môi có độ
phân cực cao như MeOH, H
2
O, MeOH-H
2
O.
Áp dụng FC để tách các hợp chất tự nhiên
Hợp chất Nguồn thực vật Chất hấp phụ Dung môi rửa
Neolignans Piperfuto Kasura
Piperaceae
SiO
2
Hexan-EtOAc
Sesquiterpen Canelle Winterane
Canellaceae
SiO
2

Ether ethyl
-Hexan
Capsaicinoid Onion RP-18
RP-18 40
mm
MeOH
MeOH-H
2
O
Alcaloid
quinolizidin
Lipinus argentens
Fabaceae
Al
2
O
3
baz
(Merck)
Ether Ethyl
Ether ethyl-
MeOH
Nhồi cột:
Đầu tiên cho một lớp bông thủy tinh lót dưới đáy cột, sau đó cho một lớp
cát biển. Cho từ từ silicagel khô 40-63 mm vào cột, sau đó cho một lớp cát
biển lên trên bề mặt lớp silicagel.
Đổ dung môi giải ly lên trên bề mặt của lớp cát biển đến đầy cột, gắn bộ
phận điều chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột. Van kim luôn được mở, mở nhẹ
nhàng cho dòng khí chảy qua, tay bịt air gió. Áp suất trong cột sẽ gia tăng,
nén lớp dung môi chảy qua cột nhanh. Áp suất được duy trì như vậy đến khi

tất cả không khí trong cột bị đuổi ra ngòai. Chú ý không được để lớp
Silicagel trên đỉnh cột bị khô.
Cho chất phân tích vào cột cũng giống như sắc ký cột thường nghĩa là chất
cần sắc ký cũng hòa tan vào dung môi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén
tất cả dung dịch mẫu vào lớp silicagel, sau đó dùng vài ml dung môi tinh chế
để rửa quanh thành cột. Rót dung môi đầy cột, mở van điều chỉnh áp và bắt
đầu hứng các phân đoạn. Lượng dung môi rửa cột và thể tích các phân đoạn
hứng tùy thuộc vào lượng mẫu tương ứng.
SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography)
Sắc ký cột nhanh khô là một cải biên của sắc ký cột nhanh, dùng áp
suất kém để gia tăng tốc độ giải ly của pha động. Kỹ thuật này khác với
FC là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được.
Dụng cụ gồm phễu lọc xốp bằng thủy tinh và áp suất vừa phải.
Chất hấp phụ thường dùng là silicagel hoặc Al
2
O
3
dùng cho SKLM.
Nạp chất hấp phụ vào phễu lọc ở trạng thái khô, có tạo áp suất kém, gõ
nhẹ vào thành phễu để chất hấp phụ được nén đều, tạo thành một khối
cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phẳng…
Chiều cao của chất hấp phụ không được quá cao, nếu muốn tách một
lượng chất nhiều thì dùng phễu có đường kính to.
Chất cần sắc ký được nạp vào đầu cột ở dạng khô hoặc ướt để có một
lớp mỏng và đều.