Báo cáo thí nghiệm công nghệ vi sinh

Bài 1
CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT
A. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
1. Khái quát các giai đoạn của quá trình chọn lọc giống vi sinh vật:
Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm:
 Phân lập từ tự nhiên,
 Gây đột biến,
 Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn,
 Bảo quản giống.
2. Một số phương pháp phát hiện giống vi sinh vật có đặc tính mong
muốn:
Việc phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào:
 Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ như kháng sinh, sắc tố, …
 Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường
 Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật
 Sự thay đổi hình thái
3. Một số phương pháp bảo quản giống:
Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, nhưng không có cách nào hoàn hảo cả. Việc
lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường mang tính kinh nghiệm.
3.1. Giữ giống trên thạch
Cấy chuyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường mới.
Phương pháp này hay được áp dụng mặc dù tốn nhiều công sức và có thể dẫn đến thoái hóa
chủng. Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý thành phần môi trường để tránh thoái hóa
chủng.
Giống có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 – 5
0
C
Thời gian cấy chuyền thường từ 1 tuần đến 1 tháng, tùy theo chủng
3.2.Giữ giống dưới lớp dầu khoáng:
Khi giữ giống ở 4 – 5
0

C, môi trường thường có hiện tượng bị khô làm giống bị chết hoặc giảm
hoạt tính. Để khắc phục người ta cho lên bề mặt môi trường một lớp dầu trơ (dầu khoáng,
parafin, vaselin, …)
Thực hiện như sau: giống sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng trong
điều kiện tối ưu đến giai đoạn logarit hoặc đến khi bào tử chín. Sau đó phủ một lớp dầu khoảng
10 mm trên bề mặt môi trường, và gắn kín nút bông bằng parafin. Giữ ở nhiệt độ phòng hoặc ở
4 – 7
0
C.
Dưới lớp dầu khoáng, vi sinh vật vẫn duy trì sự sống và các chủng hiếu khí vẫn sinh trưởng với
tốc độ chậm. Và trong quá trình bảo quản có thể lấy chủng ra bằng cách chọc que cấy qua lớp
dầu mà không làm hỏng tình trạng chủng.
Cách này giữ chủng được lâu, có thể lên đến nhiều năm, do vậy phải nghiên cứu điều kiện môi
trường để đảm bảo dự trữ dinh dưỡng và chống các sản phẩm chuyển hóa hay acid tạo ra trong
quá trình sinh trưởng. Thường chọn môi trường giàu protein và có lượng đường tối thiểu.
3.3.Giữ giống trong cát:
Phương pháp này thường chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử. Do đặc tính của chủng có khả
năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt và nếu gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm thành
dạng dinh dưỡng.
Thực hiện bằng cách: cát sông được rửa nước cho sạch bụi, có thể rửa bằng cách đun với HCl
và rửa lại bằng nước. Rây để lấy các hạt mịn. Sấy khô cát 120
0
C trong 3 – 4 giờ. Phân thành
từng liều nhỏ trong ống nghiệm và tiệt trùng bằng tủ sấy 160 – 180
0
C trong 2 – 3 giờ hoặc 120
0
C hai lần cách ngày, mỗi lần 1 giờ. Kiểm tra độ vô trùng của cát.
Chủng được nuôi cấy đến khi bào tử chín, đổ cát đã thanh trùng vào và cho bào tử bám vào cát.
Đổ cát có dính bào tử vào ống nghiệm khô vô trùng, hút kiệt ẩm và nút kín. Bảo quản ở nhiệt

độ phòng hoặc 4 – 5
0
C
3.4.Đông lạnh:
Là làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật đã phát triển từ từ đến độ lạnh sâu -20 đến -30
0
C,
tốt nhất là -80
0
C. Khi làm lạnh cần chú ý tốc độ làm lạnh thích hợp và phải thêm các tác nhân
bảo vệ chống đông thích hợp như glycerin (10 – 15%), sữa (~5%), lòng trắng trứng, …
Tùy độ lạnh mà thời gian bảo quản khác nhau, nếu ở -20
0
C, khoảng 6 tháng, còn ở -80
0
C
khoảng 10 năm. Khi cần sử dụng thì làm tan băng bằng cách lấy chủng ra và đặt vào bếp cách
thủy 37
0
C. Không làm tan băng nhiều lần. Hoặc có thể dùng que cấy cứng cạo lấy một ít vi
sinh vật đang đông đá rồi cấy lên môi trường thích hợp, phần còn lại trả nhanh về tủ đông.
3.5.Đông khô:
Là quá trình làm khô ở áp suất (>1 mbar) và nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông đặc của mẫu).
Ở nhiệt độ này và áp suất đủ thấp, nước đá trong mẫu sẽ thăng hoa. Do nước được lấy đi từ
dạng rắn thành dạng hơi nên nồng độ chất tan trong mẫu sẽ không tăng dần lên như các lúc bay
hơi từ dạng lỏng, nên ít ảnh hưởng đến chất lượng sinh học của mẫu, đồng thời khi mẫu khô sẽ
có cấu trúc xốp, dễ dàng lấy lại trạng thái ban đầu khi thêm nước vào.
Mẫu sau khi đông khô có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài. Phương pháp rất
đắt tiền nhưng cho phép bảo quản giống rất tốt, cho khả năng phục hồi cao mà ít ảnh hưởng đến
hoạt tính.

B. NỘI DUNG THỰC TẬP
1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có đặc tính mong muốn:
 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym amylase
 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym protease
2. Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật:
 Xác định khả năng sinh kháng sinh của E.coli
 Xác định khả năng sinh kháng sinh của S.aureus
3. Ly trích chủng có tiềm năng và lưu chủng:
C. CÁCH THỰC HIỆN
1. Phân lập và phát hiện các chủng vi khuẩn có đặc tính
mong muốn
1.1. Nguyên tắc:
 Phân lập và phát hiện các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym
amylase
Vi sinh vật từ mẫu đất sau khi được cấy trên thạch tinh bột, đem ủ thì sẽ phát triển. Khi đem
tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch Lugol (iod) thì nền môi trường sẽ có màu tím
than do màu của iod với tinh bột. Nếu chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào thì xung
quanh chỗ vi sinh vật mọc sẽ có vòng sáng, trong do tinh bột đã bị thủy phân nên không tạo
màu với iod. Đường kính của vòng phân giải tinh bột tỷ lệ với hoạt tính.
 Phân lập và phát hiện các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym
protease
Vi sinh vật từ mẫu đất sau khi được cấy trên thạch gelatin, đem ủ thì sẽ phát triển. Khi đem
tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch TCA 50% thì nền môi trường sẽ đục vì
gelatin bị tủa. Nếu chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinh
vật mọc sẽ có vòng sáng, trong do gelatin đã bị thuỷ phân nên không bị tủa. Đường kính
của vòng phân giải gelatin tỉ lệ với hoạt tính.
1.2. Tiến hành:
ủ 37
0
C / 24h

tráng bề mặt thạch bằng thuốc thử thích hợp
Mẫu đất và
10 ml đệm PBS
vortex
để lắng 15’
…
Quan sát
1000 µl dịch
huyền phù vi
sinh vật
1
100 µl dịch từ ống 1
900 µl NaCl 0,85%
2
100 µl dịch từ ống 4
900 µl NaCl 0,85%
5
Lấy 100 µl
trải lên thạch
bằng que
chải
5
100 µl dịch từ ống 5
900 µl NaCl 0,85%
6
Lấy 100 µl
trải lên thạch
bằng que
chải
6

100 µl dịch từ ống 6
900 µl NaCl 0,85%
7
Lấy 100 µl
trải lên thạch
bằng que
chải
7
2. Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật
2.1. Nguyên tắc:
2.2. Tiến hành:
Trải đều vi khuẩn E.coli / S.aureus lên mặt thạch
Đục lỗ 5 lỗ trong bản thạch
Nhỏ vào 5 lỗ lần lượt các dịch chứa:
chủng vi khuẩn B
1
, B
2
, B
3
, B
4
và lỗ chứng chỉ chứa môi trường
Để yên để chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch.
Ủ 37
o
C trong 16 – 18 giờ
Đọc kết quả
D. KẾT QUẢ THỰC TẬP
1. Phân lập và phát hiện các chủng vi khuẩn có đặc tính

mong muốn
Trên hộp thạch thấy xuất hiện 3 loại khóm.
Dựa vào có sự xuất hiện của vòng tròn sáng xung quanh khóm hay không sau khi cho thuốc thử
ta xác định được khả năng sinh Amylasae hay Protease của các chủng trên như sau:
Chủng Mô tả khóm
Trên thạch
tinh bột
Trên thạch
gelatin
Kết luận về khả năng
tạo
Amylase
ngoại bào
Protease
ngoại
bào
1 Khóm lớn, đường kính
khoảng 5 - 8 mm, màu
trắng, rìa gợn đều, có tâm
Vòng sáng
trên nền tím
than
Vòng trong
trên nền trắng
đục
Có Có
2 Khóm nhỏ, tròn, rìa không
răng cưa, màu trắng
Vòng sáng
trên nền tím

than
Vòng trong
trên nền trắng
đục
Có Có
3 Khóm nhỏ, tròn, màu vàng,
đường kính khoảng 1 mm
Vòng sáng
trên nền tím
than
Vòng trong
trên nền trắng
đục
Có Có
2. Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật
Chủng Vòng kháng khuẩn xung quanh
B B
1
B
2
B
3
B
4
E.coli Không Có
d = 5 mm
Không Có
d = 7 mm
Không
S.aureus Không Không Không Có

d = 1 mm
Không
Kết luận:
 E.coli có khả năng sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B
1
, B
3
 S.aureus có khả năng sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B
3
Bài 3
TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT
A. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
Enzym amylase có ứng dụng quan trọng trong công nghiệp, thực phẩm, y dược Trong những
năm gần đây amylase được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học để sản xuất gluose. làm dịch
tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sản
xuất một số thuốc.
Enzym amylase có thể thu nhận từ động vât, vi sinh vật và thực vật, tuy nhiên enzym để có thể
ứng dụng trong y dược cần trải qua các bước tinh chế từ enzym thô.
B. NỘI DUNG THỰC TẬP
1. Thu enzym amylase từ khoai lang
2. Tinh chế amylase
3. Xác định hoạt lực của enzym thu được
C. TIẾN HÀNH
1. Sơ đồ tóm tắt qui trình tiến hành:
Thu enzym thô
Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp cơ học (xay),
chiết amylase bằng đệm phosphat.
Loại tạp thô (các mảnh tế bào) bằng rây
Loại tinh bột (để lắng rồi gạn lọc lấy phần dịch)
Lọc phần dịch 2 lần qua giấy để loại hoàn toàn tinh bột

Dịch enzyme thô
Tinh chế enzym amylase bằng alginat
Tạo liên kết giữa amylase với sodium alginat 2%
(15 ml dịch chiết thu được cho vào 75 ml dung dịch sodium alginate 2%.
Khuấy, ủ 1 giờ)
Tạo cấu trúc mạng lưới bắt giữ amylase (dùng 15 ml dung dịch CaCl
2
0.7M)
Lọc lấy phần gel có amylase
Tách amylase từ mạng lưới gel alginat (dùng 75 ml dung dịch glucose 2%,
để ở 4
0
C trong 12 giờ.)
Bỏ phần gel thu được phần dịch tinh chế có amylase.
Xác định hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh
chế bằng OD
280
Ly tâm 15000 vòng/phút.
Pha loãng mẫu enzym thô 10 lần, mẫu enzym tinh chế 5 lần.
Lấy 1 ml mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm
Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel
2. Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp
của Heinkel:
Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel: đo mật độ quang của dung dịch
sau khi thực hiện phản ứng màu với Iode.
2.1. Nguyên tắc
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của
hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode.
Một đơn vị hoạt độ tương ứng với khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 30
0

C.
2.2. Cách tiến hành
 Ống thử: tiến hành pha như sơ đồ bên dưới
 Ống kiểm tra: Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên
nhưng cho dung dịch acid sulfosalicylic vào trước rồi mới cho dung dịch enzyme vào.
 Dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra được pha loãng 5 lần. Sau
đó, lấy 0,1 ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra sau khi pha loãng đó
cho vào ống nghiệm khô rồi thêm 0,9 ml dung dịch iod pha loãng 150 lần, so màu ở bước
sóng 560 nm.
0,5 ml dung dịch
Tricloacetic acid –
TCA5%
Giữ ở 30
0
C
30 phút
0,1 ml dd enzyme
Thêm
0,1 ml dd tinh bột 1%
0,1 ml dd NaCl 0,1%
0,2 ml dd đệm phosphat
0.05M pH6
ống khô Lắc đều
(Vortex)
Lắc đều
(Vortex)
Ly tâm 10.000
vòng/phút trong 1 phút
2.3. Cách tính kết quả
 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase: Hoạt độ amylase = f(OD)

Bảng 1. Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase
1 2 3 4 5
Tinh bột (mg 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Tinh bột (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
NaCl 0,1% (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Dung dịch đệm (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Nước cất (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
A.Sulfosalicylic (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Hút 0,1 ml từ mỗi ống sang eppendorf mới
TT Iode 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9
Dùng nước cất làm ống trắng để chỉnh máy về 0.
 Tính hiệu số số đọc được trên máy giữa mẫu kiểm tra và mẫu thí nghiệm.
∆OD= OD
KT
- OD
TN
 Từ ∆OD, dựa vào đường chuẩn tính được hoạt độ amylase tương ứng
D. KẾT QUẢ THỰC TẬP
1. Xác định hàm lượng protein trong dịch enzym thô
và enzym tinh chế bằng OD
280
OD
280
Hệ số pha
loãng
N
Tổng thể tích
dịch enzym
V (ml)
Tổng lượng protein trong mẫu

Protein (A
280nm
) = n x OD
280
x V
Dịch enzym thô 0,654 10 15 98,1
Dịch enzym tinh chế 0,184 5 75 69
2. Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính
amylase
ống 1 2 3 4 5
Tinh bột (mg) 0,2 0,4 0,6 0,8 1
OD 0,087 0,267 0,358 0,501 0,662
U/ml 2 4 6 8 10
3. Kết quả xác định hoạt độ của amylase
Hệ số pha
loãng
n
OD
KT
OD
TN
∆OD
(OD
KT
- OD
TN
)
Hoạt tính amylase
U/ml
(suy từ đường

chuẩn)
Dịch enzym thô 5 0,739 0,233 0,506 7,89
Dịch enzym sau
tinh chế
1 0,525 0,22 0,332 5,38
4. Thông số quy trình tinh chế
Hệ số
pha
loãng
n
Tổng
thể
tích
dịch
enzym
V (ml)
Tổng
protein
(A
280
)
Tổng hoạt tính Hoạt tính
chuyên
biệt
(U/A
280
)
Hiệu
suất
Tổng

protein
A
280
(%)
Hiệu
suất
tổng
hoạt
tính
protein
(%)
Mức
tinh
chế
(lần)
Dịch
enzym thô
5 15 98,1 5917,5 60,3
70,3% 68,2% 0,96
Dịch
enzym sau
tinh chế
1 75 69 4033,9 58,46
E. NHẬN XÉT
1. Tổng lượng protein:
Tổng lượng trong mẫu dịch enzym thô là A
280
= 98,1
Tổng lượng trong mẫu dịch enzym sau tinh chế là A
280

= 69
Hiệu suất tinh chế enzym H% = 70,3%
Như vậy, quá trình tinh chế đã giúp loại đi một lượng các protein, trong đó các các protein
không phải là enzym amylase. Nhờ đó mẫu dịch enzym amylase sau tinh chế tinh khiết hơn so
với mẫu dịch enzym thô ban đầu.
2. Tổng hoạt tính của enzym:
Tổng hoạt tính của enzym thô là U = 5917,5
Tổng hoạt tính của enzym sau tinh chế là U = 4033,9
Như vậy, sau tinh chế thì tổng hoạt tính của dịch enzym bị giảm đi so với dịch thô.
3. Hoạt tính chuyên biệt của enzym:
Hoạt tính chuyên biệt của enzym thô là 60,3
Hoạt tính chuyên biệt của enzym tinh chế là 58,46
Mức tinh chế là 0,96 lần
Như vậy, sau tinh chế thì hoạt tính của enzym amylase trong 1 mg protein giảm đi so với trước
tinh chế.
4. Một quá trình tinh chế enzym amylase lý tưởng thì chỉ giúp loại bỏ các tạp protein khác
enzym amylase chứ không làm mất đi một lượng enzym amylase nào, đồng thời cũng không
được làm giảm đi hoạt tính của amylase. Tuy nhiên, trong thực tế quá trình tinh chế thì rất khó
đạt được kết quả lý tưởng mà thường có thể làm mất đi một lượng enzym amylase nhỏ hay
cũng có thể làm giảm đi một phần nhỏ hoạt tính của amylase.
Qua kết quả thực tập nhận thấy quá trình tinh chế amylase của nhóm làm vẫn chưa đạt kết quả
tốt vì trong quá trình tinh chế amylase đã làm mất đi một lượng enzym amylase, làm giảm đi
một phần hoạt tính của amylase.
5. Nguyên nhân có thể là do:
 Thao tác tinh chế enzym chưa chính xác:
- Tỉ lệ các chất cần cho quá trình tinh chế cho vào chưa thật chuẩn,
- Thời gian ủ, nhiệt độ ủ chưa tuân thủ chặt chẽ,
- Quá trình lọc bỏ tủa thu dịch chứa enzym không cẩn thận nên có thể làm
mất đi một lượng enzym amylase,
- Xác định tổng thể tích dịch lọc chứa enzym thô, dịch lọc chứa enzym sau

tinh chế còn sai số,
 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính Amylase chưa thật đúng
 Thao tác đo quang chưa chính xác gây sai số
Bài 4
CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINAT
F. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả năng
chuyển hóa tinh bột và các chất tự thành hỗn hợp cyclodextrin ở các mức độ polymer hóa từ 6,
7 và 8 đơn vị glucose (ứng với α-CD, β-CD và γ-CD). Việc cố định sẽ tận dụng được khả năng
tái sử dụng của các CGTase đắt tiền, và tăng cường tính ổn định cũng như hoạt tính enzym.
Dựa vào bản chất các liên kết giữa chất mang và enzym, người ta phân loại các phương pháp
cố định enzym sau:
 Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion…
 Phương pháp liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzym và chất mang để tạo
phức giữa enzym-chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
 Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa trên nguyên tắc sự bắt giữ của enzym
vào một mạng lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được nhưng không cho enzym
khuếch tán vào môi trường.
 Phương pháp tạo vi nang: enzym được giữ trong các bao vi thể có màng bán thẩm dày
200 Å (cellulose, polysaccarid).
G.NỘI DUNG THỰC TẬP
1. Cố định enzym CGTase lên alginat bằng phương pháp bắt giữ.
2. Xác định hoạt tính CGTase sau khi cố định lên alginat bằng phương pháp bắt
giữ.
3. Cố định enzym CGTase lên alginat bằng phương pháp hấp phụ.
4. Xác định hoạt tính CGTase sau khi cố định lên alginat bằng phương pháp hấp
phụ.
5. Nhận xét, so sánh về hai phương pháp cố định enzym: phương pháp bắt giữ, và
phương pháp hấp phụ.
H. HÓA CHẤT

1. Maltodextrin 4%: Là cơ chất dùng để xác định hoạt tính của CGTase.
2. Enzym CGTase: Toruzyme ® 3.0 L, Novozymes
3. NaOH 60 mM
4. Phenolphtalein 0,02% (trong đệm Na
2
CO
3
/NaHCO
3
125 mM, pH 10,5): Chất
tạo màu
5. Đệm Tris-HCl 50 mM pH8
6. BSA 0,1 mg/ml: Dùng để xây dựng đường chuẩn định lượng protein
7. Thuốc thử Bradford: Tạo màu với BSA giúp đo OD
595
8. Alginat 2%: Là chất mang, nơi enzym CGTase được cố định vào
I. TIẾN HÀNH
1. Sơ đồ tóm tắt qui trình tiến hành:
Cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ
Tạo dung dịch alginate 2%
Trộn lẫn enzym với chất mang
(Thêm 2ml CGTase vào 20 ml dung dịch alginate 2%)
Tạo liên kết giữa polyme và các ion đa hóa trị
để tạo cấu trúc mạng lưới bắt giữ enzym
(Nhỏ từ từ hỗn hợp enzym và alginat vào 40 ml dung dịch CaCl
2
0,2 M.
Vừa nhỏ vừa xoay nhẹ becher)
Rửa phức hợp gel Calci alginat – enzym bằng đệm Tris-HCl
(3 lần, mỗi lần dùng 15 ml đệm Tris-HCl)

Thu hạt gel Thu dịch rửa
Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định
Xây dựng đường chuẩn C
protein

(µg/ml)
= f(OD
595
)
Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase
Xác định hàm lượng protein trong dịch rửa
Tính toán được hàm lượng protein cố định
Xác định hoạt tính CGTase cố định
Xây dựng đường chuẩn ∆OD
550
= f(C
β-CD

(µg/ml)
)
Xác định hoạt tính của CGTase ban đầu
Xác định hoạt tính của CGTase cố định
Nhận xét về Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định bằng
phương pháp bắt giữ
Cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ
Tạo dung dịch alginate 2%
Tạo cấu trúc chất mang hấp phụ dạng gel Calci alginat
(Nhỏ từ từ 20 ml alginat vào 40 ml dung dịch CaCl
2
0,2 M)

Thu hạt gel Ca-alginat
Hấp phụ enzym vào hạt gel Ca-alginat
(Cho hạt gel vào 20 ml đệm Tris-HCl pH8,
thêm 2 ml enzym CGTase vào dung dịch.
Cố định enzym trên gel trong 1 giờ)
Rửa hạt gel Calci alginat – enzym bằng đệm Tris-HCl
(3 lần, mỗi lần dùng 15 ml đệm Tris-HCl)
Thu hạt gel Thu dịch rửa
Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định
Xây dựng đường chuẩn C
protein

(µg/ml)
= f(OD
595
)
Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase
Xác định hàm lượng protein trong dịch rửa
Tính toán được hàm lượng protein cố định
Xác định hoạt tính CGTase cố định
Xây dựng đường chuẩn ∆OD
550
= f(C
β-CD

(µg/ml)
)
Xác định hoạt tính của CGTase ban đầu
Xác định hoạt tính của CGTase cố định
Nhận xét về Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định bằng

phương pháp hấp phụ
2. Điểm khác biệt giữa cách cố định enzym bằng
phương pháp bắt giữ và phương pháp hấp phụ:
Cố định enzym bằng
phương pháp bắt giữ
Cố định enzym bằng
phương pháp hấp phụ
Hạt gel Ca-aglinate được tạo ra cùng lúc
với quá trình bắt giữ enzym
Thời gian bắt giữ enzym nhanh
Hạt gel Ca-aglinate được tạo ra trước rồi
mới hấp phụ enzym
Thời gian để hấp phụ enzym lâu
3. Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định
3.1. Nguyên tắc xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định
Phương pháp dựa trên sự thay đổi λ
max
của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue khi tạo phức
hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm
có λ
max
465 nm. Khi kết hợp protein thì thuốc nhuộm có λ
max

595 nm.
Trước tiên ta xây dựng đường chuẩn với dung dịch protein đã biết trước nồng độ. Sau đó thực
hiện đo dung dịch thử để xác định hàm lượng protein. Từ đồ thị chuẩn và các giá trị mật độ
quang đo được của mẫu thử chứa protein cần xác định, suy ra hàm lượng protein mẫu đo
(tương ứng với giá trị trục hoành).
Công thức tính:

Hàm lượng protein có trong 1 ml enzym: mg protein/ml enzym = n*x*10
-3
Với n: hệ số pha loãng
x: nồng độ protein có trong mẫu thử suy ra từ đường chuẩn (μg/ml)
Hàm lượng protein cố định: m
pr cố định
= m
pr ban đầu
– m
pr không cố định
Hiệu suất cố định protein: H% = m
pr cố định
/ m
pr ban đầu
(%)
3.2. Cách xác định hàm lượng và hiệu suất hoạt tính protein cố
định
 Xây dựng đường chuẩn định lượng protein C
protein

(µg/ml)
= f(OD
595
)
Pha dung dịch BSA với các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml từ dung dịch BSA 0,1 mg/ml
Số thứ tự 0 1 2 3 4 5
Nồng độ BSA (μg/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch BSA 0,1 mg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất 5 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,2 ml thuốc thử Bradford 5X + 0,8 ml dung dịch BSA vừa pha.

Lắc đều, để yên cho màu ổn định trong 2 phút. Đo OD 595 nm.
Vẽ đường chuẩn định lượng protein C
protein

(µg/ml)
= f(OD
595
)
 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase
Pha loãng chế phẩm CGTase 100 lần.
Hút 0,8 ml chế phẩm trên rồi cho vào 0,2 ml thuốc thử Bradford 5X
Đo OD 595 nm.
 Xác định hàm lượng protein không cố định
Hút 0,8 ml dịch rửa thu được cho vào 0,2 ml thuốc thử Bradford
Đo OD 595 nm.
 Xác định hàm lượng protein cố định
Được suy gián tiếp từ hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase ban đầu và hàm lượng
protein không cố định
4. Xác định hoạt tính CGTase cố định
4.1. Nguyên tắc xác định hoạt tính CGTase cố định
Hoạt tính của CGTase được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin do CGTase tạo ra từ
maltodextrim trong điều kiện xác định. Dựa vào khả năng hấp phụ và làm mất màu
phenolphtalein của cyclodextrin, ta có thể xác định được cyclodextrin tạo thành từ maltodextrin
trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch
phenolphtalein.
Hoạt tính của enzym được định nghĩa là số μmol β-CD được tạo thành trong 1 phút ở điều kiện
thí nghiệm.
∆OD = OD
chứng
– OD

thử
Từ ∆OD, đưa vào đồ thị để tính được số μg cyclodextrin tương ứng được tạo ra do CGTase.
Sau đó, ta có thể xác định hoạt tính của enzym.
Hoạt tính của CGTase trong mỗi ml dung dịch CGTase (Số µmol β-CD tạo ra trong 1
phút) là:

Trong đó:
[(∆OD – b) : a] × 10
-3
là hàm lượng β-CD tạo ra nhờ enzym, được suy ra từ
đường chuẩn và quy ra đơn vị là g/ml
M là khối lượng riêng của β-CD (M = 1135 g/mol)
10
6
: nhằm quy từ đơn vị mol sang µmol
n là hệ số pha loãng
i là tỷ lệ enzyme phản ứng
t là thời gian phản ứng (phút)
Hoạt tính riêng của enzyme tự do: HTR enzyme tự do = (U/mg protein)
Hoạt tính riêng của enzyme cố định: HTR enzyme CĐ = (U/mg protein CĐ)
Tỉ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do: TLHT (%) = (%)
HTC enzyme tự do
HL protein
HTC enzyme CĐ
HL protein CĐ
HTR enzym CĐ
HTR enzym tự do
( )
[ ]
6

3
10
10:
×××
×
×−∆
=
−
ni
tM
abOD
A
4.2. Cách xác định hoạt tính CGTase cố định
 Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin ∆OD
550
= f(C
β-CD

(µg/ml)
)
Pha giai mẫu nồng độ β-cyclodextrin từ dung dịch β-CD 0,2%
Số thứ tự 0 1 2 3 4 5
Nồng độ β-CD (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
β-CD 0,2% (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Lấy 6 ống nghiệm mới, cho vào: 100 μl các dung dịch β-CD tương ứng, 900 μl đệm Tris-HCl,
400 μl dd NaOH, 100 μl phenolphtalein.
Để ổn định trong 10 phút, đo cường độ màu ở bước sóng 550 nm
Mẫu trắng chỉnh máy về 0 có: 0,4 ml dung dịch NaOH; 1 ml Tris-HCl 50mM; 0,1 ml nước cất
Vẽ đường chuẩn cyclodextrin ∆OD

550
= f(C
β-CD

(µg/ml)
)
 Xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm CGTase ban đầu:
Pha loãng chế phẩm CGTase ban đầu 15 lần.
Chuẩn bị mẫu chứng và mẫu thử trong 2 ống nghiệm sạch và khô theo thứ tự như sau:
Mẫu thử Mẫu chứng
Enzyme (ml) 0,1 0,1
NaOH 60 mM (ml) 0 0,4
Maltose dextrin 4% (ml) 0,9 0,9
Ủ 37˚C trong 15 phút
NaOH 60 mM (ml) 0,4 0
Phenolphtalein (ml) 0,1 0,1
Để ổn định trong 10 phút, đo OD
550
 Xác định hoạt tính enzyme sau cố định:
Cân 200 mg hạt cho mẫu chứng, mẫu thử. Li tâm
Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chứng trong 2 ống nghiệm trên:
Mẫu thử Mẫu chứng
Enzyme (mg) 200 200
NaOH 60mM (ml) 0 0,4
Maltose dextrin 4% (ml) 0,9 0,9
Ủ 37˚C trong 15 phút
NaOH 60 mM (ml) 0,4 0
Phenolphtalein 0,1 0,1
Để ổn định trong 10 phút, đo OD
550

J. KẾT QUẢ THỰC TẬP
1. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein
C
protein

(µg/ml)
= f(OD
595
)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ BSA (μg/ml) 0 10 20 30 40 50
∆OD
595 nm
0 0,165 0,349 0,474 0,628 0,784

2. Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính CGTase
∆OD
550
= f(C
β-CD

(µg/ml)
)
Số thứ tự (i) 0 1 2 3 4 5
Nồng độ β-CD (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
OD
550
0,823 0,616 0,513 0,394 0,305 0,2
∆OD
550

(giữa 0 – i) 0,207 0,31 0,429 0,518 0,623
Đường chuẩn β-cyclodextrin
3. Kết quả xác định hàm lượng protein trong chế
phẩm CGTase và protein cố định
3.1. Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase :
Hệ số pha loãng n 100
∆OD
595 nm
0,261
Nồng độ protein (µg/ml) [(0,261 – 0,0119) : 0,0155] x 100 = 1607
Hàm lượng protein trong 2 ml
chế phẩm CGTase (mg)
1607 x 2 x 10
-3
= 3,214
3.2. Xác định hàm lượng protein không cố định :
Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ
∆OD
595
0,358 0,452
Nồng độ protein (μg/ml)
(suy từ đường chuẩn
C
protein

(µg/ml)
= f(OD
595
))
22,33 28,39

Tổng thể tích dịch rửa V (ml) 94,1 97
Hàm lượng protein trong V ml dịch
rửa (mg)
2,101 2,753
3.3. Xác định hàm lượng protein cố định:
Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp
phụ
Hàm lượng protein trong 2 ml CGTase
(mg)
3,214 3,214
Hàm lượng protein trong V ml dịch rửa
(mg)
2,101 2,753
Hàm lượng protein cố định (mg) 1,113 0,461
Hiệu suất cố định protein (%) (1,113 : 3,214) x 100%
= 34,63%
(0,461 : 3,214) x 100%
= 14,34%
64,11215:10
1135
1006,99
6
3
=×







×








×
−
4. Kết quả xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm
và hoạt tính enzym cố định
4.1. Kết quả xác định hoạt tính của CGTase ban đầu :
Số lần pha loãng n (lần) 15
Thể tích enzym đem đo quang (ml) 0,1
OD
chứng
(550 nm) 0,633
OD
thử
(550 nm) 0,182
∆OD
550
= OD
chứng
- OD
thử
0,451
Hàm lượng β-CD tạo ra nếu

dùng 2 ml enzym (mg/ml) [(0,451 – 0,101 ) : 0,53] x 15 x (2 : 0,1) = 198,11
Hoạt tính chung của enzym trong
2 ml dung dịch CGTase ban đầu (U)
(Số µmol β-CD tạo ra trong 1
phút)
4.2. Kết quả xác định hoạt tính của enzym cố định:
Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ
Tổng khối lượng hạt
nhựa thu được (m g)
14,61 14,89
Lượng enzym cố định
dùng xác định hoạt
tính (g)
0,2 0,2
OD
chứng
(550 nm) 0,543 0,555
OD
thử
(550 nm) 0,287 0,368
∆OD
550
0,256 0,187
Hàm lượng β-CD tạo
khi dùng m g enzym
cố định (mg/ml)
21,36 12,08
Hoạt tính chung của m
g enzym cố định (U)
(Số µmol β-CD tạo

ra trong 1 phút)
1,255 0,71
( )
[ ]
36,21
2,0
61,14
53,0:101,0256,0 =×−
( )
[ ]
08,12
2,0
89,14
53,0:101,0187,0
=×−
71,015:10
1135
1008,12
6
3
=






×









×
−
255,115:10
1135
1036,21
6
3
=






×








×

−
64,1115:10
1135
1011,198
6
3
=






×








×
−
5. Tính toán Hoạt tính riêng của enzym tự do và
enzym cố định:
Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ
Hoạt tính chung của
enzym tự do (U)
11,64 11,64

Hàm lượng protein ban
đầu (mg)
3,214 3,214
Hoạt tính chung của
enzym cố định (U)
1,255 0,71
Hàm lượng protein cố
định (mg)
1,113 0,461
Hoạt tính riêng của enzym
tự do (U/mg protein)
3,622
11,64 : 3,214 = 3,622
3,622
11,64 : 3,214 = 3,622
Hoạt tính riêng của enzym
cố định (U/mg protein)
1,1
1,225 : 1,113 = 1,1
1,54
0,71 : 0,461 = 1,54
Tỉ lệ hoạt tính enzym cố
định so với enzym tự do
(%)
30,37%
1,1 : 3,622× 100% = 30.37%
42,52%
1,54 : 3,622 × 100% = 42,52%
K. NHẬN X É T – BIỆN LUẬN KẾT QUẢ
Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp

phụ
Thời gian tiến hành Nhanh Dài
Hiệu suất cố định protein (%) 34,63% 14,34%
Tỉ lệ hoạt tính enzym cố định so với
enzym tự do (%)
30,37% 42,52%
Từ bảng so sánh trên ta nhận thấy:
1. Hiệu suất cố định protein
Hiệu suất cố định protein bằng phương pháp bắt giữ thì cao hơn so với phương pháp hấp
phụ. Nguyên nhân là :
 Cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ là phương pháp cố định enzym không
thuận nghịch bằng cách bắt giữ enzym vào một mạng lưới mà cơ chất, sản phẩm qua được
nhưng enzym không thoát ra được.
 Còn cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ là phương pháp cố định enzym thuận
nghịch dựa trên sự hấp phụ vật lý hoặc liên kết ion. Sự hấp phụ xảy ra là nhờ tương tác bề
mặt như liên kết hydro, liên kết Vanderwals, cầu nối ion, tương tác kị nước.
 Chính vì thế mà với phương pháp bắt giữ thì enzym được cố định vào chất mang tốt
hơn so với phương pháp hấp phụ
2. Thời gian tiến hành cố định enzym
Thời gian tiến hành cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ thì ngắn hơn so với phương
pháp hấp phụ. Nguyên nhân là :
 Khi cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ thì hạt gel Ca-aglinate được tạo ra cùng
lúc với quá trình bắt giữ enzym
 Khi cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ thì hạt gel Ca-aglinate được tạo ra
trước. Sau đó chất hấp phụ và enzym cần phải được trộn lẫn với nhau trong một khoảng
thời gian nhất định để các tương tác bề mặt giữa chúng xảy ra.
3. Tỉ lệ hoạt tính enzym cố định so với enzym tự do
Tỉ lệ hoạt tính enzym cố định so với enzym tự do khi cố định enzym bằng phương pháp bắt
giữ thì bé hơn so với phương pháp hấp phụ, và tỉ lệ này đều bé hơn 100% ở cả hai phương
pháp. Nguyên nhân là :

 Cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ là phương pháp cố định enzym thuận
nghịch. Cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ là một phương pháp cố định enzym
không thuận nghịch. Do đó enzym được cố định bằng phương pháp hấp phụ thì ít chịu ảnh
hưởng hơn so với enzym được cố định bằng phương pháp bắt giữ.
 Sau khi được cố định bằng phương pháp bắt giữ thì khả năng tiếp xúc với cơ chất
của enzym kém đi vì chỉ những enzym ở bề mặt gel thì mới tiếp xúc được với cơ chất. Còn
ở phương pháp hấp phụ thì enzym được cố định lên trên bề mặt gel. Chính vì vậy mà hoạt
tính của enzym sau cố định bằng phương pháp bắt giữ thì bé hơn so với phương pháp hấp
phụ.
 Sự gắn của enzym vào chất mang dù bằng phương pháp nào thì cũng ít nhiều gây
ảnh hưởng đến phần nào cấu trúc của enzym, ngoài ra thì sự cản trở về mặt không gian do
liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất. Chính vì vậy mà
enzym sau cố định thường có hoạt tính thấp hơn hoạt tính của enzym tự do.
Tóm lại, Enym cố định là enzym bị bắt giữ hay định vị trong một vùng không gian xác định
nào đó nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác của nó. Enzym sau cố định thường bị giảm hoạt
tính nhưng với nhiều ưu điểm khác thì enzym cố định vẫn được ứng dụng rộng rãi. Các ưu
điểm đó là :
 Enzym có thể được sử dụng lặp lại nhiều lần với cùng một điều kiện phản ứng xúc
tác nên giảm được chi phí trong quá trình sản xuất.
 Chế phẩm bền hơn enzym tự do nhờ chúng được bảo vệ bởi chất mang. Trong các
điều kiện pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu bất thường enzym vẫn hoạt động được.
 Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm cuối, tiết kiệm được thời gian và
chi phí cho việc tinh chế sản phẩm.
 Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại.
Bài 6
TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC
A.TÓM TẮT LÝ THUYẾT
Nguyên tắc sắc ký ái lực:
Dựa vào sự gắn thuận nghịch của một nhóm chức năng trên protein với một nhóm chức năng
của pha tĩnh sắc ký. Như vậy chỉ có Protein đích mang nhóm chức năng đặc hiệu mới gắn vào

pha tĩnh, còn các protein khác thì đi ra khỏi cột. Protein đích sau đó được thôi ra khỏi cột bằng
một chất cạnh tranh với nó.
Đây là kĩ thuật sắc kí đơn giản và hiệu quả nhất để tinh chế protein. Tuy nhiên, nó có nhược
điểm là đòi hỏi protein đích phải có nhóm chức năng nào đó, mà không phải lúc nào cũng có
được.
Ngày nay với kỹ thuật tái tổ hợp, người ta có thể thêm vào đoạn gen đích một đoạn acid nucleic
mã hóa cho đoạn peptid mang chức năng này để sau này có thể tách chiết protein đích, đoạn
peptid sau đó có thể được loại bỏ bằng một peptase.
Sắc ký ái lực ion kim loại – IMAC (ion metal affinity
chromatography)
Nhựa sắc ký được gắn ion kim loại (hóa trị II như Ni, Cu). Các ion này có ái lực với đoạn
peptid có nhiều Histidine (poly Histidine), đặc biệt là 6-10 His.
Chất dùng để thôi protein là imidazole > 100 mM.
B.NỘI DUNG THỰC TẬP
1. Tinh chế protein bằng kỹ thuật sắc ký ái lực
2. Xác định hàm lượng protein tinh chế được
C.VẬT LIỆU
− Đệm chạy H 1X
5 mM Imidazole
0,5 M NaCl
20 mM Tris-HCl pH 7.9
− Đệm thôi H 1X
100 mM Imidazole
0,5 M NaCl
20 mM Tris-HCl pH 7.9
− Đệm ion 1X (Charge Buffer)
50 mM NiSO
4
− Đệm rửa H 1X
50mM Imidazole

0,5 mM NaCl
20 mM Tris-HCl pH 7.9
− Đệm xả H 1X
100 mM EDTA
0.5 M NaCl
20 mM Tris-HCl pH 7.9

1. TIẾN HÀNH
Chuẩn bị cột
Rửa sạch cột rỗng bằng nước cất vô trùng.
Phân tán đều nhựa sắc ký.
Nạp 2 ml SP Sepharose vào cột
Để yên 1 giờ cho sepharose lắng xuống.
Mở cho chảy hết dung dịch bảo quản cột
Rửa cột với 3 thể tích Nước cất vô trùng
Rửa cột với 5 thể tích Đệm ion H 1X
(Nạp Niken (Niken sulfat)lên cột)
Rửa cột với 5 thể tích Đệm chạy H 1X
(Loại Niken không gắn trên cột)
Phá tế bào
Li tâm thu tế bào E.coli
Phân tán tế bào
trong 2 ml Đệm chạy H 1X
Làm lạnh
(tránh tác động của nhiệt
do tán siêu âm ở bước sau)
Tán siêu âm mẫu
Đổ dịch vào eppendorf
Ly tâm 15000 rpm/5 mins
Thu phần nước nổi (Dịch A)

Tinh chế his-tag protein
Nạp 1,5 ml dịch chứa protein / E.Coli (Dịch A) lên cột
Hứng toàn bộ dịch chảy ra (Dịch B)
(Dịch B chứa các tạp protein không có Histidin)
Rửa cột với 5 thể tích Đệm chạy H 1X
Hứng toàn bộ dịch chảy ra (Dịch C) cho đến khi không còn protein
(Dịch C chứa các tạp protein không có Histidin đặc hiệu mong muốn)
Thôi protein ra khỏi cột bằng cách cho từng 1 ml Đệm thôi H 1X
Hứng dịch chảy ra vào các ống 1ml (đánh số D
1
đến D
n
)
(Dịch D
1
đến D
n
chứa protein chứa Histidin đặc hiệu)
Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích Đệm chạy H 1X
Xác định hàm lượng protein tinh chế bằng đo OD
280