NGHIÊN cứu TỔNG hộp một số dẫn CHẤT có tác DỤNG SINH học từ cây HOA hòe TRỒNG tại VIỆT NAM

THUY T MINH TẾ ĐỀ ÀI:
CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
NGHIÊN CỨU TỔNG HP MỘT SỐ
DẪN CHẤT CÓ TÁC DỤNG SINH
HỌC TỪ CÂY HOA HÒE TRỒNG TẠI
VIỆT NAM
Chủ nhiệm đề tài: Th.S. HOÀNG THỊ KIM DUNG
Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA
HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU
Các hợp chất có hoạt
tính sinh học nguồn
gốc từ thiên nhiên
Các hợp chất có hoạt
tính sinh học nguồn
gốc từ thiên nhiên
Khả năng gây độc thấp,
an toàn trong sử dụng
Sử dụng trong:
-
Thực phẩm
-
Mỹ phẩm
-
Dược phẩm
Sử dụng trong:
-
Thực phẩm
-

Mỹ phẩm
-
Dược phẩm
Nhu cầu của xã hội
Các flavonoid:
-
Không độc dù ở liều cao
-
Nhiều tác dụng sinh học
-
Có thể phối hợp với nhiều
loại thuốc
Các flavonoid tự nhiên, flavonoid tổng
hợp và các dẫn xuất có tác dụng mạnh
hơn, ít độc hơn ?
MỞ ĐẦU
MỞ ĐẦU
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN
Flavonoid: khoảng
4.000 chất đã được
xác định trong tự
nhiên
Hoa: anthocyanine,
avonol, avanone,
avone, chalcone,
aurone
Vỏ quả: naringin,
hesperidin (họ Cam)
Hạt

Lá
Gỗ, rễ và vỏ cây
Rượu vang đỏ, trà, cà
phê,…
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN
Dự đoán con người tiêu thụ
khoảng vài trăm mg flavonoid
trong thực phẩm/ngày
Flavonoid quan trọng đối
với con người
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN
Tính chất dược lý của flavonoid:
Flavonoid (flavone,
isoflavone, flavanone,
flavonol)
Kháng oxy
hóa
Tác nhân
chống ung
thư
Kháng viêm
Phòng ngừa
và điều trị
bệnh tim
Ức chế
enzyme
Kháng
khuẩn,

kháng nấm
Chống dị
ứng
Bảo vệ gan
ứ
c

c
h
ế

t
ạ
o

c
h
ấ
t

t
r
u
n
g

g
i
a
n

B
ắ
t

c
á
c

g
ố
c

t
ự

d
o
Flavonoid thực phẩm: đậu
nành-ung thư vú, trà xanh-
ung thư bao tử, hành- ung
thư phổi
Flavonoid tổng hợp:
flavopiridol,
phenoxodiol, silybin
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN
Cơ chế kháng ung thư của
flavonoid:
•
Flavonoid là tác nhân ngăn ngừa về mặt hóa học

•
Flavonoid ức chế sự phát triển hoặc sự tăng sinh của tế bào ung thư:
Một số flavonoid có thể gây độc tế bào ung thư và gây chết tế bào theo chương
trình bằng cách biến đổi DNA.
•
Flavonoid là tác nhân chống lại sự xâm nhập, sự bám dính và sự phát triển mạch
•
Các dẫn xuất flavonoid có tác dụng ngăn ngừa tác dụng phụ của các loại thuốc
trị ung thư khác (doxorubicin – bệnh tim).
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN
Những nghiên cứu về tổng hợp dẫn xuất flavonoid trên thế giới:
Vai trò flavonoid
trong thực phẩm
Nghiên cứu tổng hợp dẫn
xuất flavonoid (flavone,
flavonol, flavanone,
isoflavone) bằng con
đường tổng hợp, bán
tổng hợp, sinh học
Kháng viêm
Bền thành mạch máu
Giảm nguy cơ bệnh tim
Dưỡng da, chống tia UV
Chống ung thư
Thử lâm sàng: flavopiridol,
aminoflavone, phenoxodiol, silybin
Năm 2007, để tăng khả năng di chuyển của quercetin qua màng tế bào, Lucia
Biasutto đã tổng hợp một số dẫn xuất ester của quercetin.
TỔNG QUAN

TỔNG QUAN
Ở Việt Nam: flavonoid → kháng oxy hóa, kháng viêm, và một vài nghiên cứu rải rác
về gây độc tế bào, … (ĐH Y dược TP.HCM, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM)
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN
XÁC ĐỊNH ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:
Việt Nam (thảm thực vật đa
dạng, nguồn flavonoid trong
cây dồi dào)
Việt Nam (thảm thực vật đa
dạng, nguồn flavonoid trong
cây dồi dào)
Cây hòe: vùng nguyên
liệu lớn → flavonol
Cây hòe: vùng nguyên
liệu lớn → flavonol
Thuốc nhuộm, bài thuốc
dân gian, chiết rutin
Thuốc nhuộm, bài thuốc
dân gian, chiết rutin
Chọn đối tượng nghiên cứu:
RUTIN, QUERCETIN
Chọn đối tượng nghiên cứu:
RUTIN, QUERCETIN
Tổng hợp các dẫn chất
Tổng hợp các dẫn chất
Xác định cấu trúc, độ
sạch: IR, LC-MS, 1H-
NMR, 13C-NMR, HMBC,
HSQC

Xác định cấu trúc, độ
sạch: IR, LC-MS, 1H-
NMR, 13C-NMR, HMBC,
HSQC
Xác định hoạt tính sinh
học: kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng oxy hóa, gây
độc tế bào
Xác định hoạt tính sinh
học: kháng nấm, kháng
khuẩn, kháng oxy hóa, gây
độc tế bào
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Tổng hợp các dẫn xuất của rutin, quercetin và xác định các hoạt tính kháng oxy hóa,
kháng nấm, kháng khuẩn và khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này
để từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao ý nghĩa
khoa học và ý nghĩa thực tiễn của các flavonoid này.
Mục đích tổng hợp các dẫn xuất để biến đổi cấu trúc của các chất ban đầu nhằm
thay đổi tính chất lý hóa, từ đó sẽ làm thay đổi tác dụng sinh học của chất, tạo ra các
sản phẩm có thể phù hợp hơn cho dược phẩm → các hợp chất có các hoạt tính sinh
học tốt hơn.
Tổng hợp các dẫn xuất của các flavonoid:
Khi dựa vào một hợp chất tự nhiên làm cơ sở để thay đổi cấu trúc, ta có thể sử
dụng các phương pháp:

Đơn giản hóa công thức so với chất ban đầu.

Mở vòng hợp chất tự nhiên.


Thêm một số nhóm thế vào nhân.

Gài thêm một hoặc nhiều nhóm vào mạch…
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
giữ nguyên khung
cấu trúc flavonoid

Thêm một số nhóm thế vào nhân.

Gài thêm một hoặc nhiều nhóm
vào mạch…
-
ester hóa: acetic anhydride, acyl chloride,
n-butyl isocyanate
-
ether hóa: dimethyl sulfate, alkyl
bromide
Các nhóm này khi thay thế hoặc đưa vào có thể làm tăng, giảm hoặc thay đổi tác
dụng sinh học do sự thay đổi cấu trúc hóa học.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp xác định hoạt tính sinh học:
1- Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH:
2- Xác định khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp MDA (malonyl dialdehyde):
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
–
MDA tạo thành do sự peroxy hóa lipid màng tế bào.

HN
N
O
S OH
2
+
CC
O
H
C
H
O
H
H
t
0
-2H
2
O
HN
N
O
S OH
H
H
C
H
CH CH
N
NH

SO
O
H
MDA
acid thiobarbituric
trimethin
Các chất chống oxy hóa sẽ ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, ngăn chặn
sự tạo thành MDA.
3- Xác định khả năng kháng nấm, kháng khuẩn: phương pháp của Vanden Bergher và
Vlietlinck
4- Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRB (Sulforhodamine B)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính,
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính
SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích
điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng
của tế bào.
Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng
tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của
chất thử.
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
S¶n
phÈm
R
1
R
2
R

3
R
4
R
5
HiÖu
suÊt (%)
Q -H -H -H -H -H 71
Q-1
-CONHC
4
H
9
-H
-CONHC
4
H
9
-CONHC
4
H
9
-CONHC
4
H
9
51,5
Q-2 62
Q-3
-COC

6
H
5
-COC
6
H
5
-COC
6
H
5
-COC
6
H
5
-COC
6
H
5
78
Q-4 -H 78
Q-5
-COC
2
H
5
-COC
2
H
5

-COC
2
H
5
-COC
2
H
5
-COC
2
H
5
41
Q-6
-COCH
3
-COCH
3
-COCH
3
-COCH
3
-COCH
3
84
1. Các dẫn xuất ester của quercetin (6):
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
Phổ 1H-NMR của Q-1
Phổ 1H-NMR của quercetin

Phổ 1H-NMR giãn rộng của Q-1
H
6
H
8
H
5’
H
2’
H
6’
NH
NH
NH
NH
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
H
8
H
6
H
2’
H

6’
H
5’
Phổ 1H-NMR của Q
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
Phổ 13C-NMR của Q-1
C=O
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
Phổ 13C-NMR của quercetin
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
2. Tổng hợp các dẫn xuất ether:
Các dẫn xuất ether của quercetin (4):
S¶n
phÈm
R
1
R
2
R
3
R

4
R
5
HiÖu
suÊt (%)
Q-9
-CH
3
-CH
3
-CH
3
-CH
3
-CH
3
65
R-2 -H
-CH
3
-CH
3
-CH
3
-CH
3
43
Q-10
-CH
2

C
6
H
5
-CH
2
C
6
H
5
-CH
2
C
6
H
5
-CH
2
C
6
H
5
-CH
2
C
6
H
5
52
Q-11

-C
3
H
7
-H
-C
3
H
7
-C
3
H
7
-C
3
H
7
48
Phản ứng S
N
2
: - acetone: dung môi phân cực phi proton + hòa tan tốt các alkyl bromide và
sản phẩm tạo thành
- K
2
CO
3
: kiềm yếu
H
8

H
6
H
2’
H
6’
H
5’
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
Phổ 1H-NMR của quercetin
H
6
H
8
H
5’
H
6’
H
2’
-CH
3
Phổ 1H-NMR của R-2
Phổ 13C-NMR của quercetin
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
Phổ 13C-NMR của R-2
-CH
3

KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
3- Thử nghiệm khả năng kháng nấm, kháng khuẩn:
Mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml)
Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men
E.coli P. aeruginosa B. subtilis S.aureus ASP.niger F.
oxysporum
S. cerevisiae C.
albicans
R 12,5 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
R-2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Q (-) (-) (-) 25 (-) (-) (-) 25
Q-1 25 (-) 50 50 50 50 (-) 50
Q-2 (-) 50 (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Q-3 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 50 (-)
Q-4 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Q-5 (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-)
Q-6 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Q-9 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Q-10 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Q-11 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
4.1- Khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH:
4- Khả năng kháng oxy hóa:
- Quercetin có khả năng bắt DPPH rất cao (> 92%), tương đương với vitamin C (95%).
→ kết hợp nhóm 5-OH ở vòng A với nhóm 3-OH và 4-oxo ở vòng C và liên kết đôi 2,3.
-
Nhóm 3-OH bị khóa bởi gốc đường (R), hoạt tính giảm.

-
Q-11, Q-1, Q-4: còn 5-OH: mất hoạt tính
-
So sánh Q-9, R-2, Q: 3-OH và liên kết đôi 2,3 là cấu trúc cơ bản bắt gốc tự do
Quercetin
R-2
Q-9
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
4.2- Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp MDA:
Các hợp chất quercetin, rutin, R-2 thử so sánh với Trolox
4.3- Xác định giá trị SC
50
:
Bảng 3.13: Kết quả tính SC
50

(DPPH) của các mẫu có hoạt tính
STT Mẫu
SC
50
(µg/ml)
1 Vitamin C 5.15
2 Quercetin 7.44
3 Rutin 11.38
4 R-2 42.50
Bảng 3.14: Kết quả tính SC
50

(phương pháp MDA)

STT Mẫu
SC
50
(µg/ml)
1 Trolox 2.54
2 Quercetin 15.57
3 R-2 23.83
4 Rutin 173.19
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
KẾT QuẢ VÀ BÀN LuẬN
5- Khả năng gây độc tế bào ung thư:
7.1- Các flavonol và dẫn xuất:
•
Q-9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào thấp hơn quercetin.
•
Ở Q-2 và Q-3 thì sự thay thế nhóm hydroxy bằng nhóm thiophene-2-carbonyloxy và
benzoyloxy đã làm mất hoạt tính của quercetin.
•
Q-10 và Q-11 (10 µg/ml) cho thấy có khả năng gây độc tế bào MCF-7.
•
So sánh R-2 và Q-9, khi nhóm 3-OH thay bằng nhóm methoxy thì hoạt tính gây độc tế
bào tăng, đặc biệt ở dòng HeLa và NCI-H460.
•
Rutin không có hoạt tính.
•
Quercetin, Q-6, Q-5, Q-1 đều có
hoạt tính gây độc trên các dòng tế
bào.
Quercetin
Q-9

R-2