PHÂN lập ISOFLAVONE tử đậu NẢNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN GLYCOSIDE FLAVONE TƯƠNG ỨNG

Mục lục
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3
ĐẶT VẤN ĐỀ 4
Chương 1 – TỔNG QUAN 5
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 5
1.1.1.Vị trí phân loại: [20][21] 5
1.1.2.Hình thái thực vật 6
1.1.3.Phân bố, sinh thái 6
1.1.4.Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 6
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 12
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17
2.1.1.Nguyên liệu 17
2.1.2.Dung môi, hóa chất 17
2.1.3.Thiết bị, dụng cụ 17
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU: 20
3.1. Phương pháp 1: THỦY PHÂN ISOFLAVONE TỪ DỊCH
CHIẾT ĐẬU NÀNH TOÀN PHẦN[31] 20
3.2 Phương pháp 2: THỦY PHÂN ISOFLAVONE SAU KHI PHÂN LẬP
TỪNG ISOFLAVONE GLYCOSID RIÊNG[34] 34
Chương 4 – BÀN LUẬN 37
Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
EtOH: Ethanol
HDL-C: lipoprotein tỉ trọng cao toàn phần
HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao

LDL-C: lipoprotein tỉ trọng thấp toàn phần
MeOH: Methanol
SFE: chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn
3
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đậu nành và những chế phẩm từ đậu nành như đậu phụ, sữa đậu nành… từ lâu đã được
người châu Á sử dụng như một thực phẩm giàu chất dinh dưỡng. Trong những thập kỉ
gần đây, nhiều nghiên cứu dịch tể được thực hiện và cho thấy việc sử dụng đậu nành
làm giảm nguy cơ của nhiều bệnh ung thư[1] như ung thư vú[2][3], ung thư tuyến tiền
liệt[4], ung thư ruột kết[5], loãng xương[6][8], triệu chứng hậu mãn kinh[6][7][8] và
bệnh động mạch vành[7][9]… Chính vì vậy, đậu nành trở thành đề tài thu hút nhiều
nhà nghiên cứu trên thế giới, nhất là trong bối cảnh hiện nay, nhu cầu sử dụng estrogen
thực vật thay cho trị liệu hormone truyền thống đối với phụ nữ mãn kinh hoặc sau mãn
kinh ngày càng gia tăng[10][11]. Từ đó, hàng loạt các nghiên cứu về thành phần hoạt
chất và phương pháp phân lập chúng ra khỏi đậu nành đã được tiến hành. Kết quả cho
thấy đậu nành là một trong những nguồn cung cấp isoflavone dồi dào nhất[12].
Isoflavone trong đậu nành tồn tại chủ yếu ở dạng glycoside: 6״ - O – malonyl-
glucosides, 6״ - O - acetyl – glucoside, β-glucoside và hiếm khi ở dạnh aglycone[13]
[14][15][16][17]. Bên cạnh đó, những nghiên cứu lâm sàng cũng cho thấy isoflavone
dạng aglycone có sự hấp thu nhanh hơn và nhiều hơn so với dạng glycoside ở cùng liều
dùng[18]. Điều đó gợi ý rằng một chế phẩm giàu isoflavone dạng aglycone sẽ tốt hơn
một chết phẩm giàu isoflavone dạng glycoside. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi
sẽ khảo sát điều kiện tối ưu để chiết xuất isoflavone dạng aglycone từ đậu nành.
4
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
Tên gọi: Tên thường gọi: Đậu tương, đậu nành
Tên khoa học: Glycine max (L) Merr. Họ: Đậu (Fabaceae)[19]
1.1.1. Vị trí phân loại: [20][21]
Theo hệ thống phân loại Takhtajan, cây Đậu nành có vị trí phân loại như sau:

Hình 1: cây đậu nành
Ngành Ngọc Lan
(Mangnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan
(Magnoliopsida)
Bộ Đậu (Fabales)
Họ Đậu(Fabaceae)
Chi Glycine
Glycine max
Sơ đồ 1: vị trí phân loại của đậu nành
5
1.1.2. Hình thái thực vật
• Cây thảo hàng năm, có thân mảnh, cao 50-150 cm, có lông, các cành hướng lên
trên. Lá mộc so le, có 3 lá chét hình trái xoan, gần mũi nhọn, gai hơi không đều.
Hoa trắng hay tím, xếp thành chùm ở nách. Quả thẳng, hình liềm, có nhiều lông
mềm, màu vàng lục hoặc xanh nhạt, thắt lại ở giữa các hạt. Có 2-5 hạt, hình cầu
hoặc hình thận, có màu sắc thay đổi tùy theo giống[22].
• Ra hoa vào tháng 6-7, cho quả vào tháng 7-9.[22]
1.1.3. Phân bố, sinh thái
• Cây có xuất xứ từ Trung Quốc[22].
• Trồng phổ biến ở khắp Việt Nam, nhất là các tỉnh Trung du, miền núi phía Bắc:
Lai Châu (Tủa Chùa, Mường Lan, Quỳnh Mai), Lào Cai(Mường Khương, Bắc
Hà), Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang(Lục Ngạn) và các tỉnh miền Đông Nam
Bộ. Ngoài ra, còn được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế
giới, đặc biệt ở Trung Quốc và Hoa Kỳ[20].
1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
Bộ phận dùng : hạt
Hình 2: hạt đậu nành tươi
6
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Trong hạt đậu nành có các thành phần đã biết: Protid 40%, lipid 12-25%, glucid 10-
15%; các muối khoáng như Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F;
các men, sáp, nhựa, cellulose.
Theo GS. Đỗ Tất Lợi[20], toàn cây chứa 12% nước, 16% glucid, 14-15% protein, 6%
muối khoáng và các chất khác không có nitơ.
- Protein.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hạt Đậu nành có giá trị dinh dưỡng rất cao. Thành
phần protein trong hạt Đậu nành chứa 8 loại amino axit thiết yếu : tryptophan,
threonine, isoleuxin, valin, lysin, methionin, phenylalanin và leucin. Hàm lượng của
các chất amino axit này tương đương với hàm lượng amino acid của trứng gà, đặc biệt
là tryptophan, gần gấp rưỡi của trứng[23].
Protein trong hạt đậu nành chứa khoảng trên 38% tuỳ loại. Hiện nay, nhiều giống đậu
nành có hàm lượng protein đặc biệt cao (tới 40-50%). Có những chế phẩm của đậu
nành mang tới 90-95% protein, đây là nguồn protein thực vật có giá trị cao cung cấp
cho con người[24].
Protein của Đậu nành dễ tiêu hoá, không có cholesterol và ít chất béo bão hoà như
thường có ở thịt động vật. Hàm lượng protein của đậu nành cũng cao hơn cả thịt cá và
gần gấp đôi các loại đậu khác[23].
- Vitamin và chất khoáng.
Không chỉ giàu protein hơn bất cứ loại thực phẩm nào, kể cả thịt động vật. Đậu nành
còn rất giàu vitamin và chất khoáng. Theo GS. Đỗ Tất Lợi[20], hạt Đậu nành chứa
trung bình 8% nước, 4-5% chất vô cơ, trong đó Kali 2%, Natri 0,38%, Canxi 0,23%,
photpho 0,65%, Magiê 0,24%, lưu huỳnh 0,45%. Đậu nành chứa các vitamin tan trong
nước như: các vitamin B
1
, B
2
, B
3
, B

6
; vitamin PP và chứa các vitamin tan trong dầu
như: vitamin A, vitamin D, vitamin E (trong Đậu nành ở châu Á và châu Mỹ), vitamin
K, vitamin F không có vitamin C. Các vitamin A và D xuất hiện khi hạt mới chín, sau
7
đó bị men oxy hoá phá huỷ. Trong nhóm vitamin B, Đậu nành chứa lượng vitamin B
1
gấp 3 lượng vitamin B
1
trong sữa bột và trong bột những loại đậu khác. Lượng vitamin
B
2
chứa ít hơn trong sữa bột khoảng 1/3 nhưng lại gấp 6 lần so với một số loại Đậu
khác.
- Chất béo và chất cholesterol.
Đậu nành là thực phẩm nhiều protein nhưng lại ít calorit, ít chất béo bão hoà và hoàn
toàn không có cholesterol[23]. Chất béo chiếm khoảng 15-20%, có khi đạt tới 23%. Tỷ
lệ phần trăm của các glycerid axit béo: linolein 49,3%, olein 32%, linolenin 2%,
panmitin 6,5%, stearin 4,2%, aracgidin 0,7%, lignoxerin 0,1% và 0,5% axit
panmitoleic[20].
So sánh với các loại đậu khác thì đậu nành có hàm lượng acid béo thiết yếu cao hơn.
Tổng lượng chất béo chiếm khoảng 18%, còn thành phần cacbonhydrat chiếm khoảng
31%[22].
- Dầu đậu nành
Dầu Đậu nành thuộc loại dầu khô như dầu hạt lanh, chứa khoảng 14% chất béo bão
hoà, 59% chất béo không bão hoà nhiều nối đôi, 23% chất béo không bão hoà một nối
đôi. Trong số lượng chất béo không bão hoà nhiều nối đôi lại chứa 8% linoleic acid
(omega – 3- fatty acid)[22][25], hiếm có trong các thực phẩm nguồn gốc thực vật[20]
[23]. Ngoài ra, trong dầu đậu nành còn có các phospholipid, chủ yếu là lecitin (1-5%).
Ngoài ra, dầu béo còn có các chất steron như: stigmasteron, sitosteron và một số

sapogenol khác[25]
- Isoflavone
Isoflavone là thành phần hoạt chất chính của đậu nành.
Qua phân tích, cho thấy isoflavone trong đậu nành là một hợp chất phenolic gồm có:
aglycone (daidzein, genistein và glycitein); β – glucosid (genistin, daidzin, glycitin); β
– glycosid kết hợp với nhóm malonyl ( 6
”
- O –malonyldaidzin, 6
”
– O –
8
malonylgenistin và 6
”
– O – malonylglycitin); β- glycosid kết hợp với nhóm acetyl ( 6
”
– O – axetyldaidzin, 6
”
– O - axetylgenistin và 6
”
– O – axetylglycitin) [27].
Trong hạt Đậu nành các aglycone chiếm một lượng nhỏ, là các dẫn xuất malonyl và
dẫn xuất acetyl của β– glycosid. Ngoài ra, còn chứa các aglycone : sissotrin, ononin;
các dẫn xuất acetyl của β – glycosid : 6
”
– acetylsissotrin, 6
”
– acetylononin; các dẫn
xuất malonyl của β – glycosid : 6
”
- malonylsissotrin, 6

”
– malonylononin.
Năm 2006 các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành
phần isoflavone trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt đậu nành. Kết quả nhận được, tổng
tỉ lệ trung bình của isoflavone là 2887μg/g trong phôi, 575μg/g trong hạt, 325μg/g
trong lá mầm, 33μg/g trong vỏ hạt. Các nhà khoa học cũng đã phân tách được 12 đồng
phân isoflavone.
Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng bezen: A và B nối với một dị vòng pyron.
9
Bảng 1: Cấu trúc hóa học của isoflavones
10
Tính chất lý hóa của các isoflavone:
• Lý tính của Isoflavone:
1.Trạng thái:
-Dạng glycosid thường khó kết tinh.
-Dạng genin thường kết tinh, điểm chảy cao.
2.Màu sắc :
Isoflavone: không màu đến màu vàng nhạt
3.Độ hòa tan:
• Độ tan của genin:
-Tan/dung môi phân cực đến phân cực trung bình.
-Kém tan trong dung môi kém phân cực.
-Tan / kiềm loãng, kém tan/ dung dịch acid.
• Độ tan của glycosid:
-Tan trong MeOH, EtOH
-Mạch đường dài/nhiều: có thể tan trong nước nóng.
4.Phổ UV:
Băng II: 245-275 (nm) Băng I: 310-330 (nm)
5.Phổ IR:
-Thường dùng để định danh (so với phổ chuẩn).

-Chú ý các băng trong các vùng:
• 3300-3400( OH linh động )
• 3000( Vòng thơm )
• 1450-1650( Vòng pyron)
• 1050-1150( Carbinol; C-O )
• Hóa tính nhóm Isoflavone:
1.Kiềm phân Isoflavone:
11
Trong môi trường kiềm, các isoflavone có H-5 sẽ bị mất một carbon C-2, tạo
deoxybenzoin và formiat.
2.Hóa tính của nhóm OH:
-Tính acid yếu.
-Tạo glycosid với đường.
-Tạo muối với kiềm loãng: => phenolat kém bền (tăng màu)
-Tạo phức với ion kim loại(Al
+++
, Fe
++
, Mg
++
, Pb
++
, Zn
++
, Zr
++
) => chuyển dịch λmax.
3.Hóa tính của vòng -pyron:
-Tính kiềm: kiềm yếu, với acid tạo muối kém bền.
-Tính oxy hóa khử:

• Tính oxy hóa: vòng -pyron=> vòng -pyrillium (tăng màu, quan trọng/ định
tính)
• Tính khử: tạo OH phenol
4.Hóa tính của các vòng thơm:
Phản ứng thế azoic: tạo màu, dùng định tính.
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
Tác dụng của các hoạt chất chính trong Đậu nành:[25][26][28]
Chủ yếu có tác dụng trên trị triệu chứng mãn kinh, trên xương, trên tim mạch và ung
thư.
1.3.1. Protease inhibitor: Protease inhibitor có tác dụng chống lại sự phát triển mầm
ung thư kết tràng, ung thư phổi, ung thư miệng[24][29]… Ngăn ngừa sự tác động của
một số gen di truyền gây nên chứng ung thư. Nó cũng bảo vệ các tế bào cơ thể không
cho hư hại, gây nên bởi sự tác động của môi trường xung quanh như tia nắng phóng xạ
và các chất có thể tấn công ADN[24][29].
1.3.2. Phytate
Các nhà khoa học đã chứng minh phytate không những có tác dụng ngăn ngừa mầm
ung thư mà còn có khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch.
12
Phytates có tác dụng giống như chất antioxydant, vitamin C, Beta – carotin.
1.3.3. Phytosterol: Phytosterol chỉ có trong các thực phẩm rau, đậu. Phytesterol có tác
dụng ngăn ngừa các bệnh về tim mạch qua việc cạnh tranh hấp thu với cholesterol ở
ruột. Do đó cholesterol không vào máu được mà phải bài tiết ra ngoài, lượng
cholesterol trong máu giảm, mức độ giảm tuỳ từng cá thể.
Phytosterol cũng có khả năng làm giảm sự phát triển các bướu ung thư kết tràng và
chống lại ung thư da.
1.3.4. Saponin Saponin là có đặc tính giống như antioxidant, trực tiếp ngăn cản sự phát
triển ung thư kết tràng đồng thời làm giảm lượng cholesterol trong máu.
1.3.5. Phenolic acid: Phenolic acid có hoạt tính chống oxy hoá và phòng ngừa các
nhiễm sắc thể AND khỏi bị tấn công bởi những tế bào ung thư.
1.3.6. Lecithin: Lecithin đóng một vai trò quyết định trong việc kích thích sự biến

dưỡng ở khắp các tế bào cơ thể. Lecithin có khả năng làm gia tăng trí nhớ bằng cách
nuôi dưỡng tốt các tế bào não và hệ thần kinh, làm vững chắc các tuyến và tái tạo các
mô tế bào cơ thể. Ngoài ra, lecithin có tác dụng cải thiện hệ thống tuần hoàn, bổ xương
và tăng cường sức đề kháng. Khi hệ thần kinh thiếu năng lượng, chất lecithin ở đậu
nành sẽ phục hồi năng lượng đã mất.
1.3.7. Browman – Birk Inhibitor (BBI) : BBI là một chất mới nhất tìm thấy trong
Đậu nành, có khả năng ngăn cản tiến trình phát triển mầm ung thư với hai dạng tinh
chế PBBI và cô đặc BBIC. Theo báo cáo kết quả tường trình tại hội nghị khoa học thế
giới về vai trò của Đậu nành trong việc phòng và trị bệnh (1996) thì PBBI và BBIC đã
kiểm soát được sự phát triển tiến trình ung thư miệng, vú, ruột già, gan, phổi, thực quản
cả các tế bào trong ống thử nghiệm lẫn ở các con chuột bạch và chuột đồng.
Hiện nay BBI đã được dùng trên con người ở vài trung tâm nghiên cứu và kết quả sơ
bộ rất khả quan. BBIC đã được thẩm định là loại thuốc mới bởi cơ quan F.D.A (the
U.S.Food and Drug Administration).
13
1.3.8. Acid béo Omega – 3 : Axit béo Omega – 3 là loại chất béo không bão hoà có
khả năng làm giảm lượng LDL-C, gia tăng lượng HDL-C trong máu, giúp ngăn chặn
sự phát triển của các bệnh tim mạch.
1.3.9. Isoflavone: Các hoạt chất có tác dụng “phytoestrogen” trong hạt Đậu nành gồm
chủ yếu là daidzin, genistin.
Tác dụng của isoflavone Đậu nành trong phòng và điều trị bệnh:
Nghiên cứu thăm dò trên lâm sàng cho thấy những tác dụng có lợi của đậu nành trên
các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavone trong đậu nành làm giảm cường
độ bốc hoả, giảm số lần đổ mồ hôi đêm, mang lại lợi ích hiển nhiên nâng cao chất
lượng sống của phụ nữ sau mãn kinh. Isoflavone đậu nành không gây thay đổi có ý
nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung. Không có người nào phàn nàn
về rối loạn vú, không thấy tăng các tác dụng phụ không mong muốn như estrogen. Vì
vậy, có thể khuyến cáo dùng isoflavone Đậu nành cho phụ nữ nào có chống chỉ định
dùng liệu pháp hormon thay thế hoặc không muốn dùng liệu pháp hormone thay thế vì
lý do cá nhân.

Isoflavone đậu nành còn cho thấy có cải thiện trên quá trình dinh dưỡng da. Tuy
nhiên, không nên dùng liều quá cao để tránh gây ra những tác dụng estrogen không
mong muốn.
1.3.9.1. Tác dụng trên chuyển hoá của xương:
Hiệu lực của isoflavone đậu nành trên quá trình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau
mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về mật độ khoáng ở xương tại các đốt sống L2 –
L4 và làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính của huỷ cốt bào, nên
có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogen của thuốc này.
1.3.9.2. Tác dụng trên tim mạch:
Chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành.
Isoflavone đậu nành có những tác dụng khác nhau chống rối loạn lipid– máu ở người
mãn kinh dẫn đến giảm các nguy cơ tim mạch. Đậu nành và chiết xuất của đậu nành
cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã được sơ kết bởi nhóm các
14
chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ như: làm giảm huyết áp tâm trương, giảm
cholestreron toàn phần, giảm LDL – C, giảm triglycerid, tăng HDL – C, chống kết tập
tiểu cầu, ngăn chặn sự tiến triển của các mảng xơ vữa, cải thiện tính đàn hồi động
mạch, chống oxy hoá, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự lipoperoxy
hoá của lecithin và của LDL – C sản sinh ra các sản phẩm cuối cùng có hại, vì các sản
phẩm này có ái lực rất cao với thành động mạch và gây ra những mảng vữa xơ.
Dựa vào các kết quả trên, cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) Hoa Kỳ đã chấp
nhận từ năm 1999, dùng Đậu nành cùng chế độ dinh dưỡng nghèo acid béo no, nghèo
cholesterol để làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành.
1.3.9.3. Tác dụng trên sỏi thận NXB y học , trang 930 -932,2004.:
Với người mắc bệnh thận hay chức năng thận suy yếu, giảm bài tiết đạm là một
phương thức trị liệu để giảm nặng nhọc cho thận. Khi thay việc cung cấp đạm động vật
bằng đạm thực vật như từ đậu nành thì số lượng protein trong nước tiểu giảm. Điều đó
chứng tỏ việc giảm gánh nặng cho thận. Đậu nành cũng làm giảm nguy cơ bệnh sỏi
thận bằng cách không để canxi thất thoát qua nước tiểu.
1.3.9.4. Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormon:

Các nghiên cứu về thực nghiệm, lâm sàng và về dịch tễ học đã chứng minh hiệu lực
của phytoestrogen làm giảm nguy cơ một số loại u phụ thuộc hormon ( như u ở màng
trong tử cung, vú và buồng trứng ). Tuy kết quả chưa hoàn toàn chắc chắn, có thể do
isoflavone đậu nành chủ yếu kích thích β-estrogen receptor, mà β-estrogen receptor lại
hiếm gặp ở các cơ quan nhạy cảm nhất với estrogen.
1.4. Công dụng:
Thường dùng làm thức ăn để bồi bổ cơ thể, nhất là đối với trẻ em, người bị đái tháo
đường, người làm việc quá sức, thiếu khoáng và làm việc trí óc, người mới ốm dậy,
người bị thấp khớp, thống phong. Người ta thường dùng chế thực phẩm như: đậu phụ,
chao, bột đậu nành, hoặc chế sữa đậu nành, bột đậu nành trộn với bột ngũ cốc, ca cao
dùng làm bột dinh dưỡng cho trẻ sơ sinh.
15
Đạm đậu tương trừ bệnh phong hàn ngoại cảm, sốt không ra mồ hôi, nhức đầu, đau
mắt, thông tiểu, bụng đầy khó chịu, mệt mỏi, ngủ không được, nôn mửa. Ngày dùng
16-20g dạng thuốc bột hoặc thuốc sắc[22].
16
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
- Bột đậu nành: sản phẩm của công ty Sigma Aldrich
2.1.2. Dung môi, hóa chất
- Isoflavone: genistein, daidzein và glycitein độ tinh khiết 99% từ LC Labs.
- Ethanol (96%): của hãng Riedel de Hae
- acid hydrocloric 37% và acid acetic: của hãng Fisher Scientific
- Ethanol tinh khiết (Merck) và methanol (Mallinck-rodt) dùng cho HPLC.
- Nước: cung cấp bởi hệ thống Milli-Q (Millipore)
- Carbon dioxide (CO
2
, 99,9%): từ Beiji ng Analytical Instrument Factory.
- Methanol tinh khiết: Merk

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
-Thiết bị: hệ thống HPLC Agilent 1100 (gồm cả hệ thống tiêm mẫu, máy hút chân
không, hệ thống bơm mẫu tự động và đầu dò UV-DAD), cột pha đảo C18
(Phenomenex, 5µm, 250 x 4,6 mm i.d)
- HPLC phân tích: hệ thống sắc ký (DIONEX, Germany) gồm: bơm HPLC P680,
hệ thống bơm mẫu tự động ASI-100, buồng ổn định nhiệt TCC-100, đầu dò dãy
diode quang PDA-100 và bộ phận ghi nhận tín hiệu Chromeleon.
- HPLC điều chế: bơm Waters 515, đầu dò 2487, phần mềm N2000 (Zhejiang
University, Hangzhou, China).
- Hệ thống chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn: Suprex HA.111-05-20 ( công ty
TNHH Hua An SFE., thành phố Nan Tong, Jiang Su Province, China).
- Cột polymethacrylate 4״ x 70״, Toso Hass CG71.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong hạt đậu nành, isoflavone tồn tại chủ yếu ở dạng glycozid,vì mục đích của nghiên
cứu là phân lập isoflavone dạng aglycone nên cần thiết phải qua giai đoạn thủy phân.
17
Có nhiều phương pháp để thủy phân isoflavone dạng glycozid, trong đó hai tác nhân
thủy phân thường dùng là acid[31] hay enzyme (β-glucosidase)[32]. Ở đây, vì vấn đề
giới hạn về thời gian, nên chỉ khảo sát tác nhân thủy phân, và tác nhân được chọn là
acid vì khả năng thủy phân hòan toàn của nó so với β-glucosidase ( chỉ thủy phân được
glucosyl isoflavone và không có tác dụng với malonyl-isoflavone, hơn nữa hoạt tính
enzyme sẽ bị ức chế bởi một số ion kim loại như là Hg
2+
, Cu
3+
…)[33].
Có nhiều phương pháp để thu được isoflavone dạng aglycone tinh khiết, có thể thủy
phân dịch chiết toàn phần sau đó phân lập từng isoflavone cụ thể[31] hay là phân lập
các isoflvone dạng glycoside, sau đó mới tiến hành thủy phân từng phân đoạn riêng
biệt[34]. Cả hai phương pháp trên lần lượt được khảo sát dưới đây.

2.1.4. Phương pháp 1: THỦY PHÂN ISOFLAVONE TỪ ĐẦU DỊCH CHIẾT TOÀN
PHẦN[31]:
Quy trình chiết xuất gồm 4 bước chính:
Sơ đồ 2: quy trình tổng quát
-Bước 1: chiết xuất isoflavone từ bột đậu nành bằng dung môi hữu cơ:
+ Bột đậu nành được chiết với EtOH 40-99,99% với các tỉ lệ EtOH-bột từ 1:1 đến
10:1 (tt/kl)
Chiết xuất
Thủy phân
Tinh chế
Phân lập
18
+Hỗn hợp thu được đun nóng ở các nhiệt độ khác nhau (40-90
0
C) trong 2-24 giờ, có
khuấy trộn.
+Sau đó, hỗn hợp được lọc qua chân không với màng lọc giấy số 1 (Whatman), để
loại các cấu tử không tan.
-Bước 2: giai đoạn thủy phân, nhằm mục đích chuyển các cấu tử isoflavone dạng
glycosid thành dạng aglycon.
+
Dịch chiết sau khi lọc được thủy phân với acid HCl 37% hay acid acetic tinh khiết,
và pH của hỗn hợp cuối cùng là khoảng 1-5.
+Hỗn hợp được đun nóng ở nhiệt độ 40-90
0
C trong 1-12 giờ, có khuấy trộn.
-Bước 3: giai đoạn tinh chế:
+ Sản phẩm thủy phân được trộn với nước cất với tỉ lệ 1:15 đến 1:1 (ml/ml), khuấy
trộn ở nhiệt độ phòng.
+:Tủa tinh thể được tách bằng cách lọc qua máy lọc chân không, màng lọc 0,2µm

(Millipore). Chất rắn thu được trên màng lọc được làm khô và hòa tan vào EtOH
tinh khiết.
-Bước 4: phân lập bằng hệ thống HPLC chế hóa.
2.2.2. Phương pháp 2: THỦY PHÂN ISOFLAVONE SAU KHI PHÂN LẬP
TỪNG ISOFLAVONE GLYCOSID RIÊNG[34].
Một cách khác để phân lập isoflavone dạng aglycone, thay vì thủy phân dạng
glycoside ngay sau khi chiết bằng cồn,ta có thể dùng sắc ký cột để tách riêng từng
phân đoạn isoflavone trong dịch chiết cồn lúc đầu, sau khi thu được từng isoflavone
dạng glycoside tinh khiết mới tiến hành thủy phân để thu được dạng aglycone
tương ứng.
Cách thực hiện:
Bột đậu nành được chiết bằng cồn ( MeOH hay EtOH)
Dịch chiết bột đậu nành toàn phần được pha loãng với nước cất cho đến khi đạt độ
cồn cuối cùng là 20%. Hỗn hợp thu được được lọc để loại những phần tử không tan.
19
Bước tiếp theo, tiến hành phân lập isoflavone: vì hỗn hợp thu được không chỉ chứa
isoflavone mà còn lẫn các tạp tan trong cồn 20% như là các phenol, protein, các
đường đơn hay đường phức… Nhằm loại được những tạp không mong muốn này,
đồng thời giữ lại các isoflavone, hỗn hợp được nạp lên cột pha đảo
(polymethacrylate hay C-18). Dựa vào cơ chế hấp phụ: các isoflavone có ái lực
mạnh với pha tĩnh sẽ được hấp phụ lại trên cột trong khi những chất ái lực thấp hơn
sẽ bị rửagiải khỏi cột.
Pha động là nước-alcol với các tỉ lệ khác nhau. Hai alcol được ưa chuộng là
methanol và ethanol. Chú ý rằng ta phải tăng dần tỉ lệ dung môi mạnh (ở đây là
alcol, vì đây là cột pha đảo nên dung môi kém phân cực là dung môi mạnh) so với
nước chứ không được làm ngược lại vì nếu một lượng lớn alcol được sử dụng ngay
từ đầu, những isoflavone có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh, thay vì được hấp phụ,
cũng sẽ bị rửagiải khỏi cột cùng với những isoflavone có ái lực thấp hơn và khi đó
việc phân lập sẽ không hiệu quả.
Sau khi thu được các phân đoạn khác nhau, cô thu hồi dung môi từng phân đoạn, ta

thu được các sản phẩm thô.
Bước tiếp theo và cũng là bước cuối cùng trong quy trình là kết tinh và tinh chế các
isoflavone. Đầu tiên, sản phẩm thô thu được từ từng phân đọan ở bước trên được
hòa tan trong một lượng dung môi thích hợp (khoảng 1 mg/ml). Dung môi được ưa
chuộng là methanol, mặc dù vậy ethanol cũng vẫn được sử dụng. hỗn hợp được tẩy
màu bằng than hoạt và được lọc để loại than hoạt. dung dịch thu được được cô thu
hồi dung môi và sau đó kết tinh lại trong methanol ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh).
Tinh thể được lọc qua phểu thủy tinh và làm khô.
Chương 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU:
3.1. Phương pháp 1: THỦY PHÂN ISOFLAVONE TỪ DỊCH
CHIẾT ĐẬU NÀNH TOÀN PHẦN[31]
3.1.1. Chiết xuất:
20
Nhằm mục đích tìm ra điều kiện tối ưu để chiết xuất và phân lập isoflavone từ đậu
nành ta tiến hành thăm dò ở các điều kiện chiết xuất khác nhau gồm loại dung môi, thời
gian và nhiệt độ trong quá trình chiết xuất.
Do bộ phận dùng ở đây là hạt, có chứa nhiều chất béo dự trữ, để loại bớt tạp kém phân
cực, trước khi chiết nên loại chất béo không phân cực trong bột đậu nành bằng cách
chiết bột với chất lỏng siêu tới hạn (CO
2
, 99,9%) trong thiết bị Suprex HA.111-05-
20[35].
Lọai dung môi:
Đầu tiên, cần khảo sát để tìm loại dung môi chiết xuất phù hợp nhằm mục đích thu
được nhiều isoflavone đồng thời hạn chế giá thành sản phẩm. Dung môi được chọn để
chiết xuất isoflavone từ đậu nành là cồn, vì tính thân thiên với môi trường, kinh tế,
cũng là dung môi thường được sử dung để chiết xuất nhóm hoạt chất flavonoid. Ta cần
khảo sát nồng độ cồn tối ưu để cho hiệu quả kinh tế cao nhất.
Các mẫu bột đậu nành lần lượt được chiết bằng EtOH với các độ cồn khác nhau từ 40-
99,99% và với các tỉ lệ EtOH-bột từ 1:1 đến 10:1 (tt/kl). Sau đó, hàm lượng isoflavone

được đánh giá băng hệ thống HPLC.
Kết quả cho thấy: Trong số những dung môi đã sử dụng, dịch chiết từ EtOH tinh khiết
có hàm lượng isoflavone toàn phần cao hơn nhiều so với dịch chiết EtOH-nước (70%)
(chủ yếu là genistein và daidzein dạng malonyl và glycosyl). Trong đó EtOH-nước
96% cho dịch chiết có hàm lượng isoflavone tương tự như EtOH tinh khiết, nên chọn
EtOH-nước 96% làm dung môi chiết xuất mẫu lớn do giá thành rẻ hơn.
Tỉ lệ dung môi:
Trong quá trình chiết xuất, quan sát thấy hàm lượng isoflavone toàn phần phụ thuộc
vào tỉ lệ thể tích EtOH và khối lượng bột đậu nành. Khảo sát tỉ lệ dung môi thích hợp
bằng cách chiết các mẫu bột đậu nành ở nhiệt độ 62
0
C trong 8 giờ với các tỉ lệ dung
môi- bột khác nhau từ 3:1 đến 8:1( Hình 3:A).
Kết quả cho thấy: tỉ lệ dung môi-bột thấp 3:1 cho hàm lượng isoflavone cao hơn và ít
tốn dung môi hơn tỉ lệ 5:1 và 8:1 nên được chọn lựa cho quy trình chiết mẫu lớn.
21
Tiếp tục khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu. Các mẫu lần lượt được chiết ở các khoảng
thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 và 11 giờ, ở nhiệt độ 65
0
C, tỉ lệ dung môi- bột đậu nành
là 3:1
Thời gian chiết xuất:
Khảo sát với tỉ lệ dung môi- bột đậu nành là 3:1, ở nhiệt độ 65
0
C với thời gian chiết
khác nhau lần lượt là 2, 4, 6, 8 và 11 giờ. Kết quả cho thấy luợng isoflanone thu được
tăng theo thời gian chiết. Lúc đầu lượng isoflavone tăng nhiều khi thời gian chiết tăng,
nhưng sau thời gian chiết 8 giờ thì lượng isoflavone gần như đạt cựcđại, khi tiếp tục
kéo dài thời gian chiết thì lượng isoflavone tăng không đáng kể (hình 3: B). Cân nhắc
giữa lượng isoflavone thu được và sự tiêu tốn thời gian, nhân lực… chọn thời gian

chiết là 8 giờ làm điều kiện tối ưu.
Nhiệt độ:
Nhiệt độ cũng ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết.
Khảo sát bằng cách chiết các mẫu bột đậu nành ở các nhiệt độ khác nhau (65-100
0
C), tỉ
lệ dung môi-bột đậu nành là 3:1 trong 8 giờ.
Kết quả cho thấy: Hàm lượng isoflavone tăng lên khi tăng nhiệt độ chiết xuất (hình 3:
C). Lượng isoflavone thu được tối đa khi nhiệt độ chiết xuất là 80
0
C, chiết ở nhiệt độ
cao hơn không cho lượng isoflavone nhiều hơn, thậm chí còn thấy có sự giảm sút về
tổng lượng isoflavone thu được, do đó chọn nhiệt độ 80
0
C làm nhiệt độ tối ưu.
Tóm lại: điều kiện chiết xuất tối ưu được xác định là dung cồn 96
0
, chiết ở nhiệt
độ 80
0
C trong 8 giờ với tỉ lệ dung môi-bột đậu nành là 3:1.
22
Hình 3: kết quả khảo sát quy trình chiết xuất
A: hàm lượng isoflavone (aglycone tương đương) từ đậu nành (µg isolavone/g bột đậu
nành) bằng cách chiết với các tỉ lệ dung môi khác nhau, t
0
=62
0
C, trong 8 giờ.
B: hàm lượng isoflavone với các khoảng thời gian chiết khác nhau, tỉ lệ dung

môi-bột đậu nành là 3:1, nhiệt độ 65
0
C.
C: chiết ở các nhiệt độ khác nhau, tỉ lệ dung môi-bột đậu nành là 3:1 trong 8 giờ.
23
Hàm lượng Glycitein được bỏ qua vì hàm lương trong isoflavone toàn phần quá thấp
(thường dưới 5%).
3.1.2. Khảo sát điều kiện thủy phân:
Thành phần isoflavone trong dịch chiết đậu nành gồm hỗn hợp aglycon, epigenin, và
dạng glycosid ( gồm các β-glycosid, 6״-O-acetyl-β-glycosid, 6״-O-Malonyl-β-
glycosid). Để thu được dạng aglycon, phải qua phương pháp thủy phân. Việc thủy phân
phải đảm bảo sản phẩm thu được không phải là artifact, phải loại được hoàn toàn tác
nhân thủy phân ra khỏi sản phẩm cuối cùng, đồng thời hiệu suất thu được phải là cao
nhất. Do liên quan đến nhiều vấn đề phức tạp như tác nhân thủy phân, thời gian và
nhiệt độ trong quá trình thủy phân nên ở đây ta khảo sát những điều kiện thủy phân
khác nhau nhằm mục đích tiềm ra điều kiện thủy phân tối ưu. Các mẫu lần lượt được
thủy phân dưới những điều kiện khác nhau và ảnh hưởng của các thông số thủy phân
lên lượng aglycon toàn phần được phân tích bằng hệ thống HPLC.
Hàm lượng aglycone ( chủ yếu là genistein và daidzein) có liên quan với nồng độ acid,
thời gian, và nhiệt độ thủy phân (hình 4), trong đó, thông số quyết định là nồng độ acid
và thời gian thủy phân.
Nồng độ acid:
Đầu tiên các mẫu được thủy phân với các nồng độ acid khác nhau, ở nhiệt độ 80
0
C
trong 2 giờ. Tác nhân thủy phân được chọn là acid HCl (37%). Kết quả cho thấy sự
thủy phân không hiệu quả khi sử dụng nồng độ acid thấp, hàm lượng aglycon thu được
tăng theo nồng độ acid sử dụng. Tuy nhiên, nồng độ acid cao gây khó khăn trong quy
trình loại acid dư trong sản phẩm kết tinh, điều nay ảnh hưởng đến độ tinh khiết của
sản phẩm thu được. Từ kết quả khảo sát (hình 4: A), cân nhắc giữa hiệu suất thủy phân

và dư lượng acid trong sản phẩm thu được, chọn nồng độ acid HCl khoảng 0,13 mol/L.
Nhiệt độ thủy phân:
Các mẫu được thủy phân với nồng độ acid là 1 mol/lit trong 2 giờ ở các nhiệt độ khác
nhau 60
0
C, 70
0
C và 80
0
C.
24
Kết quả cho thấy sự thủy phân không hiệu quả ở nhiệt độ thấp (hình 4: B), hiệu suất
thủy phân tăng theo nhiệt độ sử dụng (ở nghiên cứu này chỉ khảo sát tới nhiệt độ
80
0
C) . Do đó, ở đây ta chọn nhiệt độ 80
0
C làm điều kiện thủy phân tối ưu.
Thời gian thủy phân:
Sử dụng nồng độ acid HCl 0,13 mol/L và nhiệt độ 80
0
C để khảo sát thời gian chiết tối
ưu , kết quả cho thấy 6 giờ là thời gian đủ để chuyển hầu hết dạng glycosid sang dạng
aglycone (hình 4:C).
Vậy: điều kiện thủy phân được chọn là nồng độ acid 0,13 mol/lít, nhiệt độ 80
0
C
trong 6 giờ.
25