TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE-PROTEIN TỪ MỘT SỐ NẤM VIỆT NAM VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

TÁCH CHIẾT
POLYSACCHARIDE-
PROTEIN TỪ MỘT SỐ
NẤM VIỆT NAM VÀ XÁC
ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA CHÚNG
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ
PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ



Thời gian thực hiện: 18 tháng ( Từ tháng 07/ 2004 đến
tháng 12/2005)
Cơ quan chủ trì: VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Chủ nhiệm đề tài:
TS. NGUY N CỬU KHOAỄ

Kinh phí
Tổng số: 163.000.000đ


Mục tiêu của đề tài
°
Xác đònh hoạt tính kháng phân bào, là cơ sở
khoa học cho việc sản xuất chế phẩm
Polysaccharide-protein dùng để phòng và điều trò
bệnh ung thư.
°

Xác đònh hoạt tính kháng oxy hóa, để nghiên
cứu ứng dụng trong phòng và chống lão hóa ở cơ
thể con người.
°
Tách chiết Polysaccharide-Protein từ một số
nấm Việt Nam.


°
Đối tượng nghiên cứu:

Nấm Linh Chi – tên khoa học Ganoderma lucidum

Nấm Vân Chi – tên khoa học Trametes versicolor

Nấm Bào Ngư – tên khoa học Pleurotus sajor-caju
°
Hoạt tính sinh học được khảo sát:

Tính kháng phân bào

Tính kháng oxy hóa


Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lónh vực
của đề tài

Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các nhà khoa học Nhật Bản, Mỹ và Trung Quốc đã công bố

nhiều tài liệu về hợp chất của polysaccharide-protein được
tách chiết từ các loài nấm dược (Linh Chi, Vân Chi ) có hoạt
tính sinh học rất cao, có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn,
kháng tế bào ung thư và còn được sử dụng trong điều chế các
vaccine chống virus.

Ngoài ra các cuộc thử nghiệm còn cho thấy các phân đoạn
polysaccharide-protein còn có khả năng kéo dài sự sống của
các bệnh nhân ung thư, trẻ hóa, kéo dài tuổi thọ cho con người.

Trong 5-10 năm gần đây các chế phẩm của polysaccharide-
protein : PSK (Polysaccharide Krestin) và PSP
(Polysaccharide Peptid) đã được bán rộng rãi ngoài thò trường
và đã đứng đầu trong top 10 loại thuốc chống ung thư bán
chạy nhất tại Nhật Bản với doanh số 556 triệu USD (năm
1985) và chiếm 25.2% tổng chi tiêu của người dân Nhật Bản
cho việc chữa trò các bệnh ung thư (năm 1987).



Tình hình nghiên cứu trong nước:

Một loạt các nhà khoa học (GSTS Nguyễn Lân Dũng, PGS.TS
Nguyễn Hữu Đống ) đã có các công trình về trồng nấm tại
nước ta.

Vài nghiên cứu chi tiết thành phần loài và một số đặc điểm
sinh học họ nấm Linh Chi ở Việt Nam và thăm dò hoạt tính
chống oxy hóa của các dòch chiết từ nấm Linh Chi.


Hàng loạt các chế phẩm từ nấm Linh Chi, Vân Chi với các tên
gọi khác nhau( Ling zhi, Ling zhi jing, Naturade Ken Reishi…)
đã được nhập từ Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc

Một số công ty dược phẩm trong nước (dược phẩm 24 hoặc
công ty Khôi Nguyên) cũng có sản phẩm nấm dược, tuy nhiên
mới chỉ ở dạng bột, trà hoặc dòch chiết đơn giản.

Các công trình nghiên cứu về nấm ở Việt Nam mới chỉ dừng ở
mức độ phân loài nấm, kỹ thuật nuôi trồng nấm và nghiên cứu
một số đặc tính sinh học của chúng, chưa có một công trình
nào được nghiên cứu một cách hệ thống về thành phần,
phương pháp tách chiết các phân đoạn polysaccharide-protein
được cho là có hoạt tính sinh học cao của các loại nấm Việt
Nam.


Nội dung nghiên cứu

X ây dựng đề cương tổng q uát và chi tiết.

Thu thập và tổng hợp các tư liệu Polysaccharide-Protein có
liên q uan đến đề tài.

Khảo sát sơ bộ một số thông tin kỹ thuật cơ bản về trồng, thu
hoạch và sơ chế nấm Linh Chi, Vân Chi và Bào Ngư.

Tách chiết Polysaccharide-Protein từ nấm Linh Chi,Vân Chi,
Bào Ngư.


Dùng các phương pháp hóa lý để xác đònh trọng lượng phân
tử của các phân đoạn thu được.

X ác đònh thành phần đường tổng của các phân đoạn thu
được.

X ác đònh thành phần acid amin trong protein của các phân
đoạn thu được.

X ác đònh kháng phân bào của các phân đoạn thu được trên.

X ác đònh hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn trên.


Phương pháp nghiên cứu, cách tiếp cận
vấn đề, kỹ thuật sử dụng

Tách chiết polysaccharide có chứa protein với các dung
môi khác nhau ( H
2
O, MeOH, EtOH, …)

Sử dụng phương pháp đông khô ở nhiệt độ thấp nhằm giữ
nguyên được hoạt tính của Polysaccharide-protein thu
nhận được.

Sử dụng phương pháp sắc ký gel để tách các phân đoạn
có trọng lượng phân tử khác nhau.

Sử dụng các phương pháp sắc ký khí (GC) để xác đònh

các loại đường của Polysaccharide.



Sử dụng phương pháp phenol-sunfuric acid để xác đònh hàm
lượng đường tổng.

Protein: xác đònh bằng phương pháp Lowry và sắc ký điện
di hoặc sắc ký lỏng cao áp kết hợp với khối phổ.

Xác đònh hoạt tính kháng phân bào.

Xác đònh hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp
DPPH.


Thành Phần Hóa Dược Tổng Quát của Linh Chi
Thành phần Hàm lïng(%)
Nước
12 - 13
(trong cao mềm của Việt Nam thì tới 22.32%)
Cellulose 54 - 56
Lignin 13 - 14
Hợp chất Nitơ 1.6 - 2.1
Chất béo (kể cả
dạng xà phòng hóa)
1.9 - 2
Hợp chất Phenol
0.08 - 0.1
(có thể tới 0.4% trong cao)

Hợp chất Strerol
toàn phần
0.11 - 0.16
Saponin toàn phần 0.3-1.23
(Theo Lê Xuân Thám-Nấm Linh Chi, Cây thuốc quý)


Quy Trình Tách Chiết Thô
Quả thể nấm
Chiết với NaOH 5%, ở
30
o
C x 6-12h, lọc
Chiết với Amonium oxalat 1%, đun
hoàn lưu 3h, 5 lần, lọc
Thêm 5 V EtOH,
Lọc
Dòch lọc 4 Cặn 4 Dòch lọc 5 Cặn 5
Dòch lọc 6 Cặn 6
Dòch lọc 7 Cặn 7
F3-2
F2
F3-1
Thêm 5 V EtOH, lọc
Đông
khô
Đông
khô
Đông
khô

AcOH,
pH 5-6,
lọc
Cặn
Dòch lọc 1 Cặn 1
Dòch lọc 2 Cặn 2
F1
Dòch lọc 3 Cặn 3
Chiết với nước nóng 100
o
C x 4h x 5 lần
Lọc
1. Sấy khô ở 80
o
C. Nghiền
2. Chiết với EtOH 85% x 5 lần. Lọc
Thêm 5 V EtOH, Lọc
Đông
khô
Dich lọc


Quy Trình Tách Chiết Tinh
Chiết với NaOH 5%, ở
30
o
C x 12-30h, lọc
Chiết với Amonium oxalat 3%, đun
hoàn lưu 3h, 5 lần, lọc
Thêm 5 V EtOH,

Lọc
Dòch lọc 4 Cặn 4 Dòch lọc 5
Cặn 5
Dòch lọc 6 Cặn 6
Dòch lọc 7
Cặn 7
F3-2
F2
F3-1
Thêm 5 V EtOH, lọc
Đông
khô
Thẩm trích
Đông khô
Đông khô
AcOH, pH 5-6, lọc
Cặn
Dòch lọc 1 Cặn 1
Dòch lọc 2 Cặn 2
F1
Dòch lọc 3 Cặn 3
Chiết với nước nóng 100
o
C x 4h x 8 lần
Lọc
Quả thể nấm
1. Sấy khô ở 80
o
C. Nghiền
2. Chiết với EtOH 85% x 16 lần. Lọc

Thêm 5 V EtOH, Lọc
Đông
khô
Dich lọc
Lọc gel Sepharose
CL-4B với NaOH
0.3M
F2-1
F3-1a
F3-1b
F3-1c F3-1a
F3-2a
F3-2b
Lọc gel


1. Xác đònh trọng lượng phân tử của Polysaccharide bằng:

Sắc ký gel với các cột Standar Dextran

Phương pháp đo áp suất thẩm thấu
2. Xác đònh thành phần của Polysaccharide

Xác đònh hàm lượng đường tổng bằng phương phápPhenol
sulfuric acid

Xác đònh các thành phần đường:
–
Sắc ký khí
–

Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ.
–
Cộng hường từ hạt nhân
3. Xác đònh thành phần Protein

Sắc ký điện di

Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ.

Cộng hường từ hạt nhân 2 chiều Cosy và Tocsy

IR


4. Tính kháng phân bào: do TS Lê Mai Hương thực hiện trên các
dòng tế bào:

Ung thư gan (Hep-G2)

Ung thư màng tử cung (FL)

Ung thư màng tim (RD)
5. Tính kháng oxy hóa:

In vitro:
–
Phương pháp xác đònh hàm lượng Malonyl dialdehyde(MDA)
trong quá trình peroxy hóa Lipid (TBA)
–
Phương pháp Diphenyl-picryl-hydraziyl (DPPH)

–
Phương pháp E.C. Xavron

In vivo: do Trung tâm Sâm thực hiện


Hợp tác quốc tế
Dự kiến hợp tác:
1. Viện Hóa Hữu Cơ Zelenskij (Viện Hàn Lâm liên
bang Nga)
Nội dung hợp tác: Trao đổi tài liệu thông tin.
2. Trung Tâm Sinh Học Công Nghệ Cao (Đại Học
Boston Mỹ)
Nội dung hợp tác :Trao đổi tài liệu thông tin và có thể
thực hiện một số phương pháp phân tích hiện đại


Dạng kết quả dự kiến của đề tài
I II III
Mẫu (Model, market)
Qui trình công nghệ: Qui trình
tách chiết polysaccharide-protein
đối với từng loại nấm: Linh Chi,
Bào Ngư, Vân Chi
Báo cáo phân
tích
Sản phẩm: Các phân
đoạn polysaccharide-
protein
Phương pháp Bảng số liệu

Vật liệu Tiêu chuẩn Tài liệu dự báo
Thiết bò, máy móc Qui phạm Sơ đồ
Dây chuyền công nghệ
Đề án, qui hoạch
triển khai
Giống cây trồng
Luận chứng kinh
tế kỹ thuật
Giống gia súc
Chương trình
máy tính
Khác


Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản
phẩm tạo ra
T
T
Tên sản phẩm và
chỉ tiêu chất
lượng chủ yếu
Đơn vò
đo
Mức chất lượng Dự kiến
số lượng
sản phẩm
tạo ra
Cần đạt Mức chất lượng
Trong nước Thế giới
1 Phân đoạn

polysaccharide -
protein của nấm
Bào Ngư (F1)
gr
Tan trong
nước chứa
khoảng 9,8%
protein
Chưa có 50
2 Phân đoạn
polysaccharide-
protein của nấm
Bào Ngư (F2)
gr
Không tan
trong nước
chứa 20%
protein
Chưa có 50
3 Phân đoạn
polysaccharide-
protein của nấm
Linh Chi (F1)
gr
Tan trong
nước chứa
khoảng 9,8%
protein
Chưa có 50
4 Phân đoạn

polysaccharide-
protein của nấm
Linh Chi (F2)
gr
Không tan
trong nước
chứa 20%
protein
Chưa có 50


T
T
Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng chủ
yếu
Đơn
vò
đo
Mức chất lượng Dự kiến
số lượng
sản phẩm
tạo ra
Cần đạt Mức chất lượng
Trong nước Thế giới
5 Phân đoạn
polysaccharide-
protein của nấm
Vân Chi (F1)
gr

Tan trong
nước chứa
khoảng 9,8%
protein
Chưa có 50
6 Phân đoạn
polysaccharide-
protein của nấm
Vân Chi (F2)
gr
Không tan
trong nước
chứa 20%
protein
Chưa có 50
7 Các bản báo cáo kết
quả hoạt tính kháng
phân bào của 6 phân
đoạn trên
8 Các bản báo cáo kết
quả hoạt tính kháng
oxy hóa của 6 phân
đoạn trên


Phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:

Chuyển giao kết quả nghiên cứu cho một công ty
dược tại Tp HCM (Dược phẩm Bến Thành hoặc
dược phẩm 26).


Hoặc chuyển giao cho Xưởng Thực nghiệm của Viện
Công Nghệ Hóa Học để tiếp tục nghiên cứu giai
đoạn 2 thử nghiệm hoạt tính chống tế bào ung thư
trên chuột, xác đònh LD50 của chế phẩm trên và thử
lâm sàng


Các tác động của kết quả nghiên cứu

Bồi dưỡng, đào tạo cán bộ KH&CN

Kết quả nghiên cứu được sử dụng trong ngành
y-dược.

Nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn dược liệu
Việt Nam

Nâng cao đời sống của người nông dân


Danh sách tổ chức/cá nhân tham gia thực hiện và
phối hợp chính

Cơ quan phối hợp chính:
Viện Sinh Học Nhiệt Đới.
Viện Hóa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên.
Khoa Sinh trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
T
T

Họ và tên Học vò/chức
danh KH
Ngành
chuyên môn
Đơn vò công tác
1
2
3
4
5
6
Hoàng Quốc Khánh
Phạm Cao Thanh Tùng
Hoàng Thò Kim Dung
Trần Ngọc Quyển
Đái Huệ Ngân
Bùi Trọng Đạt
TS
ThS
ThS
CN
CN
ThS
Vi Sinh
Hóa Lý
Hữu Cơ
Hữu Cơ
Hóa Lý
HóaHCTN
Viện Sinh học

nhiệt Đới
Viện Công
Nghệ Hóa Học
Nt
Nt
Nt

Cán bộ phối hợp chính


T
T
Nội dụng các khoản
chi
Tổng số Nguồn vốn
Kinh phí Tỷ lệ(%) NSNN Khác
1 Thuê khoán chuyên
môn
75.000.000 46.0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
59.000.000 36.2
3 Thiết bò, máy móc
chuyên dùng
5.000.000 3.1
4 Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
5 Chi khác 24.000.000 14.7
Tổng cộng 163.000.000
Chi tiết kinh phí thực hiện

XIN CHAÂN THAØNH CAÛM ÔN