Nghiên cứu bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất

Luận văn thạc sĩ
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới người hướng dẫn khoa học tận tâm của
em – TS. Hoàng Thị Kim Dung – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Hóa học − Viện
Khoa học Công nghệ Việt Nam. Cô đã hướng dẫn rất nhiệt tình, động viên tinh thần
trong những thời khắc khó khăn, là một tấm gương trong công việc cũng như đời
thường.
Xin thể hiện sự biết ơn đến tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa − Trường Đại học
Cần Thơ, quý Thầy Cô Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt
Nam, vì đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập.
Vì sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong việc hoàn thành luận văn,
em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Ngọc Quyển, Th.s. Trịnh Thị Thanh Huyền,
KS. Lý Tú Uyên, KS. Nguyễn Hoàng cùng các anh chị Phòng Hoá Hữu Cơ & Polymer
− Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam.
Ngoài ra, em không thể thể hiện sự biết ơn của em đến những người anh, người
chị, người bạn khóa 16 và 17 lớp cao học hóa Hữu cơ – Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ
em trong suốt quá trình học vừa qua.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các quý Thầy Cô trong hội đồng bảo vệ đã
đọc và đưa ra những nhận xét quý báu giúp em hoàn chỉnh cuốn luận văn này.
Cuối cùng, sẽ là thiếu sót to lớn nếu không nhắc đến gia đình em. Đặc biệt là ba
mẹ - người đã luôn theo sát, hỗ trợ em từng phút từng giây trong suốt thời gian qua và
cả sau này!
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2012
Huỳnh Thị Kim Chi
Huỳnh Thị Kim Chi 1
Luận văn thạc sĩ
TÓM TẮT
Diosmin là một loại flavone tự nhiên có tác dụng làm bền thành mạch máu,
chữa suy tĩnh mạch, bệnh trĩ, tiểu đường, ung thư. Trong nghiên cứu này, diosmin
được bán tổng hợp từ hesperidin – là một loại flavanone phổ biến trong họ citrus –
bằng tác nhân iodine, sodium hydroxide trong dung môi pyridine cho hiệu suất cao

(76%). Diosmin được đem đi thủy phân trong môi trường acid sulfuric/acid
acetic/nước tạo thành aglycone của nó là diosmetin (H=87%), từ diosmetin đã tổng
hợp được 3 dẫn xuất: 3
′
,5,7−triacetoxy−4
′
−methoxyflavone (DTA),
3
′
,4
′
,5,7−tetramethoxyflavone (DTM), 3
′
,5,7−triallyloxy−4
′
−methoxyflavone (DTAl).
Các phổ IR, HRMS, HPLC,
1
H−NMR,
13
C−NMR được dùng để xác định cấu trúc của
sản phẩm, khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp đo độ hấp thu DPPH
(1,1 − diphenyl − 2 − picryl − hydrazyl) và gây độc tế bào theo phương pháp SRB
(Sulforhodamin B) trên các dòng tế bào ung thư như MCF-7, NCI-H460 và Hep G2.
Kết quả khảo sát cho thấy khả năng kháng oxy hóa của diosmetin là mạnh nhất
(SC
50
=291µg/mL) , các mẫu diosmin, DTA, DTM và DTAl đều có hoạt tính thấp. Khả
năng gây độc tế bào của DTA trên hai dòng MCF-7 và Hep G2 là mạnh nhất (IC
50

lần
lượt là 85.34 và 73.89 µg/mL), các mẫu khác đều có hoạt tính yếu.
ABSTRACT
Diosmin is a natural flavone having durable effect on blood vessels, varicose
veins, hemorrhoids, diabetes, and cancer. In this study, diosmin was semi synthesized
from hesperidin - a popular flavanone in the citrus family - with iodine and sodium
hydroxide agents in pyridine solvent for high efficiency, yield: 76%. Diosmin was
hydrolysed in H
2
SO
4
/CH
3
COOH/H
2
O mixture forming its aglycone that was diosmetin
(H=87%). Three diosmetin derivatives were semi synthesized, including
3
′
,5,7−triacetoxy−4
′
−methoxyflavone (DTA), 3
′
,4
′
,5,7−tetramethoxyflavone (DTM),
3
′
,5,7−triallyloxy−4
′

−methoxyflavone (DTAl). The IR, HRMS, HPLC,
1
H-NMR,
13
C-
NMR spectra were used to determine the structures. The antioxidant activity was
measured by the absorption of DPPH (1,1−diphenyl−2−picryl−hydrazyl) and the SRB
(Sulforhodamin B) method was used to estimate antiproliferation activity on the
cancer cell lines: MCF-7, NCI-H460, Hep G2. The results showed that antioxidant
Huỳnh Thị Kim Chi 2
Luận văn thạc sĩ
capacity of diosmetin was the best. The antiproliferation ability of DTA was the most
powerful on two lines MCF-7 and Hep G2.
Huỳnh Thị Kim Chi 3
Luận văn thạc sĩ
MỞ ĐẦU
Từ xưa, con người đã biết sử dụng các dược thảo để chữa bệnh rất hiệu quả.
Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định được phần lớn cấu trúc hóa học của các
hợp chất có trong cây cỏ có hoạt tính sinh dược học, giải thích được cơ chế chữa bệnh
trong dân gian của các hợp chất. Từ đó, có thể làm giàu và tăng tác dụng sinh dược
của chúng. Không chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu các hợp chất có cấu trúc từ cây cỏ,
con người còn nghiên cứu tổng hợp ra các dẫn xuất có hoạt tính sinh dược học mạnh
hơn, góp phần vào lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người ngày một nâng cao.
Trên cơ sở hesperidin, một loại flavonoid có trong nhiều cây thuộc họ cam
quýt, chiếm hàm lượng 2–3% trong vỏ quýt, một loại cây có sẵn và trồng nhiều ở Việt
Nam, chúng tôi bán tổng hợp diosmin. Diosmin đã được sử dụng trong hơn 30 năm
như là một tác nhân bảo vệ thành mạch, và gần đây đã bắt đầu được nghiên cứu cho
các mục đích trị liệu khác bao gồm cả ung thư, hội chứng tiền kinh nguyệt, viêm đại
tràng và bệnh tiểu đường(63). Tuy nhiên, giá thành các biệt dược chứa diosmin còn
cao, phải nhập khẩu từ nước ngoài, ngăn cản người dân sử dụng rộng rãi để phòng

ngừa và chữa trị các bệnh suy tĩnh mạch – tiêu biểu là bệnh trĩ.
Bước đầu chúng tôi thủy phân ra diosmetin để tiến hành tổng hợp một vài dẫn
xuất của diosmin sau này, xét nghiệm tính kháng oxy hóa, gây độc trên tế bào của các
hợp chất tìm được. Từ đó làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn
xuất khác tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn.
Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất”.
Huỳnh Thị Kim Chi 4
Luận văn thạc sĩ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Huỳnh Thị Kim Chi 5
Luận văn thạc sĩ
1.1 Flavonoid
1.1.1 Phân bố
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa
rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Cho đến nay đã có khoảng 4000 chất đã được
xác định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavone và flavonol với nhóm thế là OH hoặc
OCH
3
thì theo lý thuyết có thể gặp 38627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu
vàng. Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu.
Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid
nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon.
1.1.2 Cấu trúc hóa học
Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenyl
propane nghĩa là 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, hay
nói cách khác là cấu tạo khung kiểu C6 – C3 –C6. Cấu trúc là một vòng kín hoặc hở.
Cách đánh số tuỳ theo dây C
3
đóng hay hở, nếu dây C

3
đóng thì đánh số bắt đầu
từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B
đánh số phụ. Nếu dây C
3
hở thì đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.
[2,3,4]
OH
1'
6 5
4
3
2
O
B
A
α
β
2'
3'
4'
5'
6'
7
6
5
8
4
3
2

O
1
O
2'
3'
4'
5'
A
B
1
1'
6'
Mạch hở Mạch kín
Thường flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân
A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc
dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D- glucose, kế đó là D-
galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-apipse và acid uronic.[4]
Trong đa số trường hợp thì mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị
vòng C có chứa oxy. Dị vòng C có thể là dihyroxypyrane, γ- pyrone, dihyro γ- pyrone.
Huỳnh Thị Kim Chi 6
Luận văn thạc sĩ
O
O O
O O
Dihydropyran -pyroneDihydro γ
-pyroneγ
Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế một
phần. vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính acid.[3,4]
Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxyl để tạo thành
các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các

oza (dạng glycoside), hoặc protein.[5]
1.1.3 Phân loại flavonoid
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy
hóa của mạch 3 carbon. Gồm có: flavone, flavanone, flavonol, dihydroflavonone,
chalcone. dihydrochalcone, aurone, anthoxyanidin (2−phenylbenzo pyrilium),
leucoanthoxyanidin, isoflavone, rotenoid, neoflavonoid, biflavonoid.
1.1.4 Vai trò của flavonoid
a) Vai trò đối với các phản ứng sinh hoá [6, 7]
Các nhóm phenol có vai trò trong sự hoà tan các chất vì di chuyển dễ dàng qua
các màng sinh học, một số có tác dụng như chất kháng oxy hoá, bảo vệ như acid
ascorbic, một số có tác dụng ức chế enzyme và các chất độc của cây.
2. Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng [8,9,10]
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nhóm chức hydroxyl có vai trò quyết
định về tính kích thích cũng như ức chế khả năng sinh trưởng.
Ví dụ: trong ổi flavonoid có nhóm hydroxyl ở 4’ làm tăng hoạt tính sinh trưởng,
còn flavonoid có nhóm hydroxyl ở cả 3’ và 4’ thì lại có tính ức chế.
3. Vai trò tạo màu [11,12,13]
Flavonoid có khả năng tạo màu cho thực vật để trông hấp dẫn hơn. Các flavone,
flavonol, aurone, chalcone thì có màu vàng. Còn các anthocyanin thì có thể có màu
hồng, đỏ, tím, xanh.
Huỳnh Thị Kim Chi 7
Luận văn thạc sĩ
4. Vai trò bảo vệ cây [14]
Một số flavonoid không màu trong lá có khả năng bảo vệ cây, ngăn động vật ăn
cỏ bằng vị đắng và khó chịu.
5. Vai trò y học [15,16,17,18]
Gốc tự do trong cơ thể là các hợp chất có hoạt tính cao được tạo ra bằng quá
trình trao đổi chất hoặc đưa từ ngoài vào. Các gốc tự do có năng lượng lớn nên có xu
hướng phản ứng làm giảm năng lượng, khi phản ứng với các hợp chất trong cơ thể làm
thay đổi các hợp chất trong cơ thể. Các dẫn xuất flavonoid có tác dụng dập tắt các gốc

tự do như OH
●
, ROO
●
gây ra các bệnh như ung thư, lão hoá….
Flavonoid tạo phức với các ion kim loại mà những kim loại này là xúc tác cho
các phản ứng oxy hoá. Thành phần màng tế bào có các lipid dễ bị peroxide hoá sinh ra
sản phẩm làm rối loạn trao đổi chất và huỷ hoại tế bào.
Flavonoid cùng với các acid ascorbic tham gia quá trình hoạt động của enzyme
oxy hoá- khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase (enzyme này làm tăng
tính thấm của mao mạch). Khi hyaluronidase thừa sẽ gây hiện tượng xuất huyết dưới
da hay còn gọi thiếu vitamin P. Thí nghiệm cho thấy flavonoid có nhóm OH ở 3 , 4 thìꞌ ꞌ
nâng cao tính bền vững thành mạch.
6. Vai trò kháng ox y hoá [19,20]
Flavonoid có đặc tính sinh học mạnh: kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng
viêm…Trong các nghiên cứu in vitro, hoạt tính của flavonoid được khảo sát bằng cách
cho phản ứng với các chất tương ứng, thường là các gốc tự do như ABTS, DPPH,
AAPH, O
●
,
●
OOH,
●
OH….trong các môi trường khác nhau.
Tác dụng kháng oxy hoá của flavonoid là ngăn sự hình thành gốc tự do, làm
sạch gốc tự do và điều chỉnh khả năng kháng oxy hoá của cơ thể. Flavonoid ngăn cản
các enzyme tạo thành gốc tự do phản ứng. Trong môi trường có ion kim loại đồng, sắt
có thể phản ứng oxy hoá khử với H
2
O

2
và protein tạo thành gốc tự do, flavonoid sẽ tạo
phức với ion kim loại ở nhóm catechol của vòng B, vị trí 3,4 của vòng C, vị trí 4,5 của
vòng A.
Huỳnh Thị Kim Chi 8
Luận văn thạc sĩ
1.2 Diosmin
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
a) Các nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 2011, Nguyễn Thị Mỹ Duyên (58) đã nghiên cứu quy trình bán tổng hợp
diosmin từ hesperidn dựa theo nghiên cứu của Lorette et al(30) và sử dụng tác nhân
phản ứng oxone
®
/sodium bromide. Quy trình bán tổng hợp của Lorette được tiếp tục
khảo sát điều kiện tối ưu, hiệu suất toàn phần là 45.8%
7. Các nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về kĩ thuật chuyển đổi hesperidin
thành diosmin bằng các tác nhân phản ứng khác nhau như tác nhân NBS kết hợp
benzoyl peroxide, tác nhân selen dioxide, tác nhân iodine, tác nhân bromo lỏng, tác
nhân postassium iodide…
o Qua trung gian hesperidin octaacetate và tác nhân NBS(30)
Hesperidin được acetate hóa bằng tác nhân natri acetate trong dung môi anhydride
acetic. Sản phẩm acetate được đem phản ứng với NBS và benzoyl peroxide trong dung
môi chloroform. Sản phẩm sau phản ứng được xử lý với ethanol, NaOH và H
2
SO
4
.
O
OH

O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
O
OCCH
3
O
O
OCCH
3
OCH
3
O
OCCH
3
H

3
CCO
O
H
3
CCO
O
OCCH
3
H
3
CCO
H
3
CCO
H
3
C
O
O
O
O
O
O
O
O
CH
3
COONa
(CH

3
CO)
2
O
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
NBS
CHCl
3
O
O
O
O

o Qua trung gian hesperidin octaacetate và tác nhân selen dioxide(31)
Huỳnh Thị Kim Chi 9
Luận văn thạc sĩ
Octaacetate hesperidin được đem phản ứng với SeO
2
trong dung môi isoamyl
alcohol. Hỗn hợp sau phản ứng được lọc nóng để loại Se, sau đó hỗn hợp được xử lý
với NaOH, HCl và ethyl acetate.
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
O
OCCH
3

O
O
OCCH
3
OCH
3
O
OCCH
3
H
3
CCO
O
H
3
CCO
O
OCCH
3
H
3
CCO
H
3
CCO
H
3
C
O
O

O
O
O
O
O
O
CH
3
COONa
(CH
3
CO)
2
O
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO

H
3
C
SeO
2
isoamyl alcohol
o Bằng tác nhân iodine(29)
Hesperidin được đem phản ứng với iodine trong dung môi pyridine trong 9 –
10 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng được đem xử lý lần lượt với alcohol, natri
thiosulfate và NaOH. Diosmin thô được kết tinh trong dung dịch DMF.
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
O

OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
Pyridine
I
2
o Quy trình bán tổng hợp diosmin của Zemplen và Bogner 59
Zemplen và Bogner đã mono bromo hóa acetyl flavanone bằng dung dịch
bromo lỏng trong chloroform với sự có mặt tia cực tím để có được dẫn xuất flavone.
Huỳnh Thị Kim Chi 10
Luận văn thạc sĩ
Bằng cách lấy đi hydrogen bromide và khử acetyl hóa với cồn kiềm. Hiệu suất của quá
trình chuyển đổi được ghi nhận là 37%.
o Theo sáng chế ES459076 (59)
Diosmin được tổng hợp bằng phản ứng bromo hóa và khử bromo hóa

hesperidin acetate trong tetrahydrofuran với 2-carboxy ethyl triphenyl phosphonium
bromide theo sau đó là sự xà phòng hóa với kali butoxide. Sáng chế không nêu rõ hiệu
suất toàn phần cũng như độ sạch của diosmin.
o Theo sáng chế FR2760015 (59)
Khử hydrogen của hesperidin với postassium iodide trong DMSO với sự có mặt
H
2
SO
4
đặc để tạo ra sản phẩm diosmin với hiệu suất 73%.
o Bán tổng hợp Linarin, Acacetin, dẫn xuất 6-Iodoapigenin từ diosmin
[22]

Linarin là hoạt chất chính của một số cây thuốc như Buddleia cordata của
Mexico và Chrysanthemum zawadskii var. latilobum của Hàn Quốc. Gần đây,
linarin đã được nhận ra có trong thảo dược Valeriana officinalis, và lần đầu tiên
được mô tả là có hoạt tính an thần và gây ngủ. Dẫn xuất 6-Iodoapigenin được biết
đến là trung gian quan trọng cho việc dẫn đến một số biflavonoids với hai đơn vị
apigenin kết nối thông qua ít nhất một vị trí thứ 6 chẳng hạn như robustaflavone,
một chất ức chế virus viêm gan B (HBV). Tổng hợp linarin hoặc dẫn xuất 6-
Iodoapigenin từ diosmin yêu cầu loại bỏ các nhóm 3′-hydroxyl trong một chuỗi
hai bước khử loại oxy deoxygenation.
o Các acid và ester của diosmetin
[
2
4]
Tác giả đã tổng hợp dẫn xuất
7-carboxymethoxy-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-2-propylphenyl)-4H-1-be
nzo-pyran-4-one. Nghiên cứu dược tính cho thấy các hợp chất acid và ester của
diosmetin có thể được sử dụng như thuốc chữa bệnh trong điều trị suy tĩnh mạch

mãn tính và các rối loạn khác liên quan đến sự tăng tính thẩm thấu và chứng viêm.
Huỳnh Thị Kim Chi 11
Luận văn thạc sĩ
1.2.2 Các loại cây có chứa diosmin(25-27)
Diosmin được tìm thấy nhiều ở các bộ phận thuộc chi citrus nhất là ở vỏ quả
ngoài, vỏ quả giữa, dịch quả.
Diosmin được phân lập lần đầu tiên vào năm 1925 từ họ mõm chó
(Scrophularia nodos). Nó cũng được tìm thấy trong quả cây phật thủ. Trong cây tề thái
có chứa diosmin và cả hesperidin. Tuy nhiên vẫn chưa thấy tài liệu công bố về hàm
lượng cụ thể của diosmin trong các loại cây này.
Ngoài ra, diosmin còn được phân lập từ chi đậu (Vicia) và cây hương bài
(Hyssopus officinalis) bởi M.N.Ivashev và cộng sự. Cây hương bài được trồng và mọc
nhiều nơi trong nước ta: Nghệ An, Hà Tĩnh… Rễ cây có mùi thơm nhẹ đặc biệt, người
dân vùng Tiền Hải tỉnh Thái Bình trồng để lấy rễ làm hương thắp.
1.2.3 Cấu tạo của diosmin
Tên thường gọi: diosmin, diosmetin-7-rhamnoglucoside,
5-Hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[
[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychro
men-4-one.
Công thức phân tử: C
28
H
32
O
15
Khối lượng phân tử: 608
Công thức cấu tạo
7
6
5

10
9
8
4
3
2
O
1
OH
O
O
1'
6'
5'
4'
3'
2'
OH
OCH
3
1''
O
5''
4''
3''
2''
OH
HO
6''
O

1'''
HO
2'''
3'''
4'''
5'''
O
OH
HO
HO
H
3
C
6'''
Huỳnh Thị Kim Chi 12
Luận văn thạc sĩ
1.2.4 Tính chất vật lý(28)
Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, không mùi. Tan tốt trong dung dịch kiềm,
DMSO, tan ít trong dung dịch DMF. Độ tan (ở 25°C) của diosmin trong các dung môi
đó lần lượt tương ứng là 20.4, 11.9, 1.7 g/100ml.
Khối lượng riêng: 1.68 g/cm3
Nhiệt độ nóng chảy: 277-278°C
1.2.5 Ứng dụng của diosmin
a) Chữa s uy tĩnh mạch (32 -3 5 )
Các biểu hiện đặc trưng của suy tĩnh mạch mãn tính: chân bị đau đớn, nặng nề,
sưng và chuột rút. Một cuộc thử nghiệm quốc tế để đánh giá hiệu quả của flavonoid
trong điều trị bệnh suy tĩnh mạch mãn tính trên 5052 bệnh nhân ở 23 quốc gia trong
vòng 2 năm đã được tiến hành. Bệnh nhân được điều trị bằng 450 mg diosmin và 50
mg hesperidin hàng ngày trong sáu tháng. Các triệu chứng lâm sàng liên tục được cải
thiện trong suốt quá trình nghiên cứu, và đã nâng cao chất lượng cuộc sống cho những

người tham gia. Hỗn hợp flavonoid này cũng có hiệu quả trong giai đoạn điều trị suy
tĩnh mạch mạn tính nghiêm trọng, bao gồm cả loét tĩnh mạch và làm chậm đi quá trình
suy tĩnh mạch. Trong một thí nghiệm ngẫu nhiên để so sánh khả năng điều trị loét tĩnh
mạch bằng hỗn hợp 900 mg diosmin cộng với 100 mg hesperidin so với việc điều trị
không dùng hỗn hợp flavonoid trên đã được tiến hành. Kết quả có 47% bệnh nhân
trong nhóm điều trị bằng bằng hỗn hợp diosmin và hesperidin đã được chữa khỏi hoàn
toàn vết loét so với nhóm không dùng hỗn hợp là 28% ở các vết loét có đường kính
dưới 10 cm.
8. Chữa b ệnh t rĩ( 36-3 8 )
Một số nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh diosmin có hiệu quả trong điều trị
các triệu chứng cấp tính và mãn tính của bệnh trĩ. Một nghiên cứu trong đó 120 bệnh
nhân được kiểm soát bằng giả dược (hỗn hợp 90% diosmin và 10% hesperidin) với
liều 500 mg mỗi ngày trong vòng hai tháng, đã kiểm soát tốt cũng như cải thiện được
các triệu chứng ngứa, đau đớn, chảy nước, phù, ban đỏ và xuất huyết. Đối với những
người đang mang thai, việc sử dụng diosmin trong điều trị bệnh trĩ không ảnh hưởng
Huỳnh Thị Kim Chi 13
Luận văn thạc sĩ
xấu đến thai kỳ, sự phát triển đến thai nhi, cân nặng cũng như sự phát triển của trẻ sau
này. Với những người bị bệnh trĩ cấp tính đang cho con bú cũng như đang mang thai,
việc điều trị được thực hiện tám tuần trước khi sinh và bốn tuần sau khi sinh. Hơn một
nửa số phụ nữ tham gia nghiên cứu đã giảm các triệu chứng từ ngày thứ tư. Diosmin
không gây đột biến cũng như không có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đến chức năng
sinh sản.
9. Chữa sưng phù do rối loạn hệ bạch huyết ( 39-4 1 )
Diosmin hoạt động trên hệ thống bạch huyết bằng cách tăng lưu lượng bạch
huyết. Hỗn hợp flavonoid có chứa diosmin đã được sử dụng để điều trị chứng phù chi
trên thứ cấp do rối loạn hệ bạch huyết. Kết quả cho thấy đã cải thiện được các triệu
chứng và khối lượng chi, khối lượng của chân tay bị sưng giảm trung bình 6.8%.
Ngoài ra, các thông số đánh giá chức năng bạch huyết được cải thiện đáng kể.
Diosmin còn cải thiện đáng kể các vết bỏng và sưng giập phổi.

10.Chữa bệnh tiểu đường( 42-4 5 )
Diosmin được chứng minh là cải thiện các yếu tố liên quan với các biến chứng
tiểu đường. Lượng đường trong máu và áp lực oxy hóa được theo dõi ở các bệnh nhân
tiểu đường tuýp 1 trước và sau khi can thiệp bằng một hỗn hợp flavonoid có chứa
diosmin: lượng hemoglobin A1c giảm đi kèm với sự gia tăng của enzyme thúc đẩy quá
trình oxy hóa glucose, chứng tỏ lượng đường trong máu đã giảm và hoạt động chống
oxy hóa được gia tăng.
Diosmin có thể bình thường hóa tốc độ lọc của mao mạch và ngăn ngừa thiếu
máu cục bộ ở bệnh nhân tiểu đường. Nghiên cứu lưu biến của bệnh nhân tiểu đường
tuýp 1 cho thấy diosmin tạo điều kiện thuận lợi cho việc cải tiến các đặc tính dòng
chảy của máu do sự giảm tổng hợp hồng cầu, dẫn đến giảm ứ đọng máu và thiếu máu
cục bộ.
11.U ng thư ( 46,4 7 )
Những ảnh hưởng của diosmin đối với các dòng tế bào ung thư của con người
trên động vật đã được nghiên cứu và được cho là thuốc phòng ngừa và ức chế sự tăng
Huỳnh Thị Kim Chi 14
Luận văn thạc sĩ
sinh tế bào ung thư. Nhiều nghiên cứu lâm sàng trong lĩnh vực này đã được tiến hành
là để xác định liều lượng có hiệu quả của diosmin đối với các dòng ung thư ở người.
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của chế độ ăn uống có chứa riêng rẽ hoặc kết hợp
hai chất flavonoid diosmin và hesperidin (90% diosmin + 10% hesperidin) trong suốt
thời gian sau khi được nhận azoxymethane (AOM) – chất gây ung thư đại tràng đã
được nghiên cứu trên những con chuột F344 đực. Các chỉ số sinh học chỉ sự phát triển
của tế bào ung thư đã giảm đáng kể, ngoài ra chế độ ăn còn giảm đáng kể các chỉ số 5 -ꞌ
bromodeoxyuridine và số hạt nhân tổ chức trong các tế bào ung thư. Những kết quả
này chỉ ra rằng dùng riêng rẽ hoặc kết hợp diosmin và hesperidin có tác dụng như một
tác nhân chống lại ung thư ruột kết. Hiệu quả của tác dụng đó có thể là do ức chế sự
tăng sinh tế bào ung thư.
Các tác dụng phòng ngừa của hai flavonoid (diosmin và hesperidin) trên N-
butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) – chất gây ra ung thư bàng quang

tiết niệu đã được tiến hành trên những con chuột đực. Khi cho chúng ăn chế độ ăn có
chứa riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai loại flavonoid nói trên (90% diosmin + 10%
hesperidin) đều có hiệu quả trong việc ức chế ung thư bàng quang và ức chế sự tăng
sinh của tế bào ung thư.
1.3 Dẫn xuất của diosmin
a) Tổng hợp diosmetin (ký hiệu DT)
o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
16
H
12
O
6
Khối lượng phân tử: 300.26 g/mol
Công thức cấu tạo
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
Huỳnh Thị Kim Chi 15
Luận văn thạc sĩ
Cấu trúc hóa học của DT
o Tính chất vật lý
Diosmetin dạng bột, màu vàng nhạt, tan nhiều trong acetone, methanol
T
nc
=258−260

°
C
o Phản ứng tổng hợp
Diosmetin được tổng hợp bằng phản ứng thủy phân diosmin trong dung
dịch acid sulfuric – acid acetic – nước (2-65-38 theo tỉ lệ % thể tích), ở nhiệt độ
110
°
C (phản ứng cắt đứt gốc đường).
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
O
OH
HO

O
OH
OCH
3
Diosmin
Diosmetin
H
2
SO
4
/CHOOH/H
2
O
12. Tổng hợp 3
′
,5,7 − triacetoxy − 4
′
− methoxyflavone (ký hiệu DTA)
o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
22
H
18
O
9
Khối lượng phân tử: 426,37 g/mol
Công thức cấu tạo
O
OCCH
3

H
3
CCO
O
OCCH
3
OCH
3
O
O
O
Huỳnh Thị Kim Chi 16
Luận văn thạc sĩ
Cấu trúc hóa học của DTA
o Tính chất vật lý
3
′
,5,7−triacetoxy−4
′
−methoxyflavone dạng tinh thể hình kim, màu trắng,
tan nhiều trong acetone, T
nc
=189−191
°
C
o Phản ứng tổng hợp
DTA được tổng hợp bằng phản ứng ester hoá nhóm hydroxyl của diosmetin bằng
tác nhân acetic anhydride trong môi trường kiềm, ở nhiệt độ 82
°
C (phản ứng thế ái

nhân trên C của nhóm cacbonyl)
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
CH
3
COONa
O
OCCH
3
H
3
CCO
O
OCCH
3
OCH
3
O
O
O
(CH
3
CO)
2
O

Diosmetin
DTA
13. Tổng hợp 3
′
,4
′
,5,7 − tetramethoxyflavone (ký hiệu DTM)
o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
19
H
18
O
6
Khối lượng phân tử: 342.34 g/mol
Công thức cấu tạo:
Huỳnh Thị Kim Chi 17
Luận văn thạc sĩ
O
OCH
3
H
3
CO
O
OCH
3
OCH
3
Cấu trúc hoá học của DTM

o Tính chất vật lý
3
′
,4
′
,5,7−tetramethoxyflavone dạng tinh thể hình kim, màu vàng ánh xanh,
tan nhiều trong acetone, T
nc
= 192−193
°
C.
o Phản ứng tổng hợp
Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp Williamson.
Diosmetin được tiến hành ether hoá trong môi trường K
2
CO
3
, acetone với tác nhân
dimethyl sulfoxide
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
K
2
CO
3

Acetone,t
0
+ (CH
3
O)
2
SO
2
O
OCH
3
H
3
CO
O
OCH
3
OCH
3
+ 2H
2
SO
4
2
Diosmetin DTM
14. Tổng hợp 3
′
,5,7 − triallyloxy − 4
′
− methoxyflavone (ký hiệu DTAl)

o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
25
H
24
O
6
Khối lượng phân tử: 420.45 g/mol
Công thức cấu tạo
Huỳnh Thị Kim Chi 18
Luận văn thạc sĩ
O
OCH
2
H
2
CO
O
OCH
2
OCH
3
CH CH
2
CH CH
2
HCH
2
C
Cấu trúc hoá học của DTAl

o Tính chất vật lý
3
′
,5,7−triallyloxy−4
′
−methoxyflavone dạng bột, màu vàng nhạt, T
nc
=
100−105
°
C.
o Phản ứng tổng hợp
Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp Williamson
Diosmetin được tiến hành ether hoá trong môi trường K
2
CO
3
, acetone với
tác nhân allyl bromide.
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
K
2
CO
3

Acetone, t
0
+
O
OCH
2
H
2
CO
O
OCH
2
OCH
3
CH
2
CH CH
2
Br
CH CH
2
CH CH
2
HCH
2
C
3
+
3HBr
Diosmetin

DTAl
1.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa – gây độc tế bào
1.4.1 Khái niệm
24, 26, 50(64,65,6
6
)
Các chất chống oxy hóa là những chất khử mạnh và có hoạt tính với oxy cao
hơn dược chất mà nó bảo vệ.
Các chất chống oxy hóa là những chất mà khi hiện diện ở nồng độ thấp hơn so
với dược chất mà nó bảo vệ có khả năng làm trì hoãn hay làm giảm quá trình oxy hóa
của dược chất đó.
Huỳnh Thị Kim Chi 19
Luận văn thạc sĩ
Trong cơ thể chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ những chất hóa học từ
những phản ứng oxy hóa có hại bằng cách phản ứng với các gốc tự do hay những dạng
oxy hoạt động khác, vì vậy ngăn cản tiến trình oxy hóa. Tuy nhiên sự cung cấp các
chất chống oxy hóa có giới hạn vì một phân tử chất chống oxy hóa chỉ có thể phản ứng
với một gốc tự do. Vì thế cần có nguồn bổ sung chất chống oxy hóa thường xuyên, có
thể từ nguồn nội sinh hay ngoại sinh.
Nói chung các chất chống oxy hóa phải:
- Có hiệu thế khử càng thấp càng tốt so với dược chất cần được bảo vệ
- Có cấu trúc đã được xác định và có độ tinh khiết cao
- Hóa hợp với oxy dễ dàng hơn so với thuốc cần được bảo vệ
- Dễ trùng hợp hoặc phản ứng với các gốc tự do do phản ứng oxy hóa sinh ra.
Chất chống oxy hóa có khả năng làm chậm tốc độ oxy hóa của những chất tự oxy hóa.
1.4.2 Hệ thống chống oxy hóa
24, 26, 50(67,68,6
9
)
Trong cơ thể có nhiều hệ thống chống oxy hóa nội sinh để chống lại sự sản xuất

của các gốc tự do. Những hệ thống này có thể chia thành 2 nhóm là enzyme và không
enzyme. Những chất chống oxy hóa enzyme bao gồm: superoxid dismutase xúc tác
quá trình chuyển O
2
•−
thành H
2
O
2
và H
2
O; catalase chuyển H
2
O
2
thành H
2
O và O
2
;
glutathion peroxidase chuyển H
2
O
2
thành H
2
O. Những chất chống oxy hóa không
enzyme bao gồm: các vitamin tan trong lipid như vitamin E và vitamin A hay tiền
vitamin A (beta−caroten), vitamin C tan trong nước và GSH. Vitamin E được xem như
chất chống oxy hóa ngắt mạch chính yếu trong cơ thể.

Hệ thống chống oxy hóa enzyme và không enzyme có quan hệ và tương tác mật
thiết với nhau. Cả vitamin C và GSH đều liên quan với sự tái tạo của gốc tự do
alpha−tocopherol. Hơn nữa sự xuất hiện của các dấu vết kim loại như selen, mangan,
đồng, kẽm… cũng đóng vai trò như các yếu tố đồng vận chống oxy hóa. Selen là yếu
tố đồng vận của enzyme glutathion peroxidase, và mangan, đồng, kẽm là yếu tố đồng
vận của superoxid dismutase… Sự tương tác đa dạng của các hệ thống chống oxy hóa
khác nhau là nền tảng cho phương pháp trị liệu dựa trên sự kết hợp của những chất
chống oxy hóa khác nhau, hơn là chỉ sử dụng một chất chống oxy hóa.
Huỳnh Thị Kim Chi 20
Luận văn thạc sĩ
1.4.3 Các kiểu tác động của các chất chống oxy hóa 24,26,50(67,68,69)
Các chất ngắt mạch, như alpha−tocopherol tác động trong pha lipid để bắt giữ
gốc tự do.
Làm giảm các loại oxy hoạt động: như glutathion.
Thu dọn các gốc tự do khơi mào: như superoxid dismutase tác động trong pha
nước để bắt giữ các gốc tự do superoxid.
Các tác nhân chelat hóa tạo phức với ion kim loại (như Fe
3+
,
Cu
2+
, Ni
2+
, Mn
2+
),
các ion này thường khơi mào cho phản ứng oxy hóa.
1.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hoá
48,49,50,5
1

Trong thực nghiệm, hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng khả năng bắt gốc tự
do của phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa với các gốc tự do hoạt động. Dựa
vào cơ chế của phản ứng oxy hóa người ta đã đưa ra nhiều phương pháp đo khác nhau.
+ Đối với phản ứng theo cơ chế chuyển proton (Hydrogen Atom Tranfer),
người ta thường sử dụng các phương pháp sau:
- ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): phương pháp dựa vào khả năng
hấp thụ các gốc tự do của oxygen.
- TRAP (Total−Trapping Antioxidant Parameter): phương pháp đo hoạt tính
kháng oxy hóa tổng cộng.
- LDL oxidation (Low Density Lipoprotein oxidation): phương pháp dựa vào sự
oxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp.
- TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity): phương pháp đo khả năng làm
sạch sự oxy hóa tổng cộng.
+ Các phương pháp đối với cơ chế chuyển electron (Single Electron Tranfer):
- FRAC (Ferric Reducing Antioxidant Power): phương pháp khử sắt.
- TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity): phương pháp đo hoạt tính
kháng oxy hóa đương lượng Trolox.
- DPPH (2,2-diphenyl−1−picrylhydrazyl): phương pháp đo khả năng bắt gốc tự
do DPPH. Gốc tự do DPPH (1,1−diphenyl−2−picrylhydrazyl) là gốc tự do bền
do có hiệu ứng liên hợp trong toàn phân tử, cho màu tím trong ethanol và có độ
hấp thu cực đại tại 517 nm.
Huỳnh Thị Kim Chi 21
Luận văn thạc sĩ
Đồ thị 1 biểu diễn màu của phương pháp DPPH
Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng và áp dụng cho từng loại chất oxy
hóa. Thông thường, người ta thường dựa vào các điều kiện như: khả năng phòng thí
nghiệm, tính khả thi trong các hệ thống sinh học, mức độ đơn giản của phương pháp,
cơ chế phản ứng, loại chất kháng oxy hóa, thời gian, … để chọn phương pháp nghiên
cứu hoạt tính phù hợp.
a) Tìm hiểu về DPPH

52,53,54,5
5
DPPH: 1,1−diphenyl−2−picrylhydrazyl (α,α−diphenyl−β−picrylhydrazyl) là
gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dime hóa như một số gốc tự do khác.
Khi DPPH phản ứng với chất có khả năng cho nguyên tử H, nó sẽ chuyển về
dạng khử có màu vàng nhạt (màu của nhóm picryl). Phản ứng được thực hiện như sau:
1,1−diphenyl−2−picrylhydrazyl 1,1−diphenyl−2−picrylhydrazine
15.Dung môi và pH của phản ứng
52,53,54,5
5
Trong nghiên cứu ban đầu của Blois, ông dùng hệ dung dịch đệm acetate ở pH
5,0−6,5 trong dung môi nước. Tuy nhiên, qua kết quả của nhiều nghiên cứu gần đây,
Huỳnh Thị Kim Chi 22
NO
2
NO
2
N NO
2
N
+
RH
NO
2
NO
2
H
N NO
2
N

+
R
Luận văn thạc sĩ
các nhà khoa học nhận thấy rằng methanol và ethanol là 2 dung môi tốt nhất và không
cần điều chỉnh pH trong dung môi methanol hay ethanol đang dùng.
16. Đo độ hấp thu
52,53,54,5
5
Giá trị các bước sóng hấp thu cực đại khi tiến hành đo mẫu theo mỗi tác giả có
sự khác nhau, nhưng trên thực tế kiểm nghiệm thì đỉnh hấp thu cực đại nằm ở bước
sóng khoảng 515−520 nm.
17.Thời gian phản ứng
52,53,54,5
5
Thời gian phản ứng phụ thuộc vào hàm lượng tác chất đem phản ứng. Theo kết
quả khảo sát trên nhiều tác chất khác nhau, thời gian tốt nhất là 30 phút sau khi phản
ứng đã thực hiện xong.
18.Kết quả tính toán
52,53,54,5
5
Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa, người ta thường dùng thuật ngữ: ″Phần
trăm ức chế Q″. Q được định nghĩa như sau:
Q=((A
0
−A
c
)/A
0
)×100%
Trong đó: A

0
là độ hấp thu DPPH khi không có mẫu (mẫu trắng).
A
c
là độ hấp thu của dung dịch phản ứng.
Ngoài ra kết quả thử kháng oxy hoá theo phương pháp DPPH được quy về giá trị IC
50
−
50%, EC
50
−50% hoặc SC
50
−50%. Thông số này được định nghĩa là nồng độ tác chất
phản ứng làm giảm 50% hàm lượng DPPH. Vậy ứng với một giá trị nồng độ DPPH
xác định, giá trị IC
50
, EC
50
hoặc

SC
50
càng nhỏ thì khả năng kháng oxy hoá càng cao.
1.4.5 Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRB
(Thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử – Bộ môn Di truyền,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP.HCM)
Huỳnh Thị Kim Chi 23
Luận văn thạc sĩ
Hình 1 a) Tế bào ung thư vú; b) Tế bào ung thư phổi; c) Tế bào ung thư gan
a) Nguyên tắc

Sử dụng phương pháp Sulforhodamin B (SRB) là một
phương pháp nhuộm màu đơn giản và nhạy để xác định độc
tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện
âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương
của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng
protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB
liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ
quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào.
Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của chất thử.
19.Xử lý kết quả
- Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD
492
và
OD
620
)
- Tính giá trị OD = OD
492
- OD
620
(1)
- Tính OD
492
(hoặc OD
620
) = OD
tb
- OD
trắng

(2)
- Tính phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào theo công thức:
%100)1(%
×−=
OD
OD
C
TN
I
Với: - OD
tb
: giá trị OD của giếng có chứa tế bào
Huỳnh Thị Kim Chi 24
O
S
S
NN
C
2
H
5
C
2
H
5
C
2
H
5
C

2
H
5
OH
O
O
O
O
O
Sulforhodamin B
Luận văn thạc sĩ
- OD
trắng
: giá trị OD của giếng trắng
- OD
TN
: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)
- OD
C
: giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)
Ghi chú: Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng hàm STDEV trong phần
mềm tính toán Excel của Microsoft Office để xử lý số liệu, tính toán giá trị trung bình
và độ lệch chuẩn giữa các lần thí nghiệm lặp lại.
Kết quả trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
Huỳnh Thị Kim Chi 25