tiểu luận bộ môn hóa phân tích chủ đề định lượng protein trong huyết thanh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y – DƯỢC HUẾ
KHOA DƯỢC
BỘ MÔN : HÓA PHÂN TÍCH
CHỦ ĐỀ : ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG HUYẾT THANH
Nhóm thực hiện
LÔ VĂN ĐẠI
Lớp D2A
HOÀNG CÔNG CHIẾN
Lớp D2B
ĐINH MINH CHUNG
Lớp D2A
NGUỒN GỐC VÀ VAI TRÒ CỦA
PROTEIN TOÀN PHẦN ĐỐI VỚI CƠ THỂ:

Nguồn gốc của protein:
Protein trong máu gồm 3 thành phần là albumin
chiếm 50 - 55%, globulin chiếm 39 – 45%,
fibrrinogen chiếm 4 – 6%. Protein toàn phần trong
huyết tương cao hơn huyết thanh vì có thêm
fibrinogen .
Albumin và fibrinogen được tổng hợp duy nhất bởi
gan. Globulin do các tế bào có thẩm quyền miễn
dịch sản xuất ra (tuỷ xương, lách, tế bào lympho,
tế bào Kuffer của gan).

Protein huyết tương có các vai trò sau:
- Tham gia cấu tạo nên cơ thể.
- Tạo áp lực keo có vai trò trong quá trình vận
chuyển và trao đổi muối nước.
- Tham gia thành phần hệ thống đệm góp phần
giữ cân bằng pH cho máu.

- Bảo vệ cơ thể: globulin là yếu tố miễn dịch có
vai trò bảo vệ cơ thể hơn nữa fibrrinogen tham
gia vào quá trình đông máu giúp cầm máu khi bị
xây xước, chấn thương.
- Vận chuyển hormon và các enzym, protein còn
làm nhiệm vụ vận chuyển thuốc như thuốc kháng
sinh, coumarin, salycylate, thuốc ngủ.
Các bậc của protein.

Cấu trúc bậc 1
Cấu trúc bậc 1 biểu thị trình tự các gốc amino acid trong
chuỗi polypeptide, cấu trúc này được giữ vững bằng liên kết
peptide (liên kết cộng hóa trị). Cấu trúc bậc 1 là phiên bản của
mã di truyền, việc xác định được cấu trúc bậc 1 là cơ sở để
tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hoá học hoặc
bằng biện pháp công nghệ sinh học.

Cấu trúc bậc 2 Biểu thị sự xoắn của chuỗi polypeptide, là
tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau
trong mạch polypeptide. Nói cách khác, là dạng không gian
cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide. Cấu trúc này
được làm bền nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa
các liên kết peptide ở gần nhau.

Cấu trúc bậc 3
Biểu thị sự xoắn và cuộn khúc của chuỗi polypeptide thành khối, đặc
trưng cho protein dạng cầu, là tương tác không gian giữa các gốc amino
acid ở xa nhau trong mạch polypeptide. Trong nhiều protein dạng cầu có
chứa các gốc cysteine tạo nên liên kết disulfur giữa các gốc Cys xa nhau
trong mạch polypeptide làm cho mạch bị cuộn lại. Ngoài ra, cấu trúc bậc

3 còn được giữ vững bằng các loại liên kết khác như liên kết kị nước, lực
Van der Waals, liên kết hydro, liên kết tĩnh điện giữa các gốc amino acid.

Cấu trúc bậc 4
Biểu thị sự kết hợp của các chuỗi có cấu trúc bậc 3 trong phân tử
protein. Những phân tử protein có cấu trúc từ 2 hay nhiều chuỗi protein
hình cầu, tương tác với nhau sắp xếp trong không gian tạo nên cấu trúc
bậc 4. Mỗi một chuỗi polypeptide đó được gọi là một tiểu đơn vị, chúng
gắn với nhau nhờ các liên kết hydro, tương tác Van der Waals giữa các
nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị để làm bền cấu trúc bậc 4.

Tính chất hóa học của protein.
- Protein có thể bị thủy phân bởi enzyme hoặc bởi một số yếu tố khác
như acid hoặc base đặc (nồng độ 6N) ở nhiệt độ cao và trong nhiều
giờ để tạo thành các sản phẩm dở dang hoặc sản phẩm cuối cùng là
các amino acid.
- Protein cho phản ứng biurea (đặc trưng của liên kết peptid).
- Các gốc amino acid trong phân tử protein cũng cho các phản ứng
đặc trưng của amino acid tự do tương ứng.
- Phân tử protein có nhóm a-NH2 ở đầu N-tận cùng và a-COOH ở
đầu C-tận cùng, ngoài ra chúng còn có thể có thêm một số nhóm
-NH2 và COOH của các gốc amino acid nằm giữa chuỗi polypeptid.
Do vậy, protein có thể cho hoặc nhận proton (H+) để thể hiện tính
acid hoặc base. Nhờ đặc điểm này cho nên protein là một hệ đệm góp
phần duy trì pH của cơ thể động vật tương đối ổn định.

Do Protein cho phản ứng Biurea (phản
ứng đặc trưng của liên kết peptid).
Vì vậy trong thí nghiệm này chúng
ta. Dùng tính chất này của proten dể

định lượng protein trong huyết
thanh. Để chận đoán bệnh xơ gan cổ
chướng.
I. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG
Protein trong huyết thanh tác dụng với ion
Cu+2 trong môi trường kiềm (thuốc thử Biure) tạo
thành phức hợp màu xanh tím.
Đậm độ màu của phức hợp tỷ lệ thuận với nồng độ
protein trong huyết thanh và được xác định mật độ
quang ở bước sóng 546nm bằng phép đo điểm cuối.
II - CHUẨN BỊ
1. Dụng cụ
- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch,
- Giá ống nghiệm
- Ống nghiệm to, nhỏ
- Quả bóp to nhỏ
- Pipet nhỏ giọt
- Máy quang kế (bước sóng 530 - 560nm) cóng 1cm
- Pipet 10ml (1)
- Máy li tâm
- Micropipet 0,1ml (1)
Bộ dụng cụ lấy máu tĩnh
mạch.
Bộ dụng cụ
Pipet
Giá để ống nghiệm và ống nghiêm
Quả bóp
Micropipet 0,1ml
Máy li tâm và máy

đo quang
Máy li tâm
Máy đo quang
2.Hóa chất:
- Đồng sulfat (CuSO4.5H2O) (g)
- Natri Kalitactrat: muối seignette
(NaKC4H4O6.4H2O) (g)
- Na2 CO3 (g).
- NaOH (g).
- Nước cất.
- Protein mẫu có nồng độ 64 g/l.

Háo chất
Nươc cất
III. QUY TRÌNH TIẾN HÀNH ĐỊNH LƯỢNG
1. Lấy huyết thanh tĩnh mạch:
Vị trí lấy máu: thường ở nếp gấp khuỷu tay.
- Người cho máu ngồi thoải mái, đặt tay nằm
ngang trên bàn. Xác định
vị trí lấy
chọc kim rồi tiến hành
sát trùng vị trí đó bằng
bông có tẩm cồn 70°.
Chờ cồn khô rồi mới
tiến hành lấy máu.
Chú ý: Không được dùng
dây garo vì máu ứ lại làm
cho nồng độ protein tăng
lên nhiều.
Vị trí lấy máu tĩnh mạch

- Cầm bơm kim tiêm hợp với cẳng tay 1 góc khoảng 30°. Chọc
kim nhanh, dứt khoát vào vị trí dưới vị trí lấy máu khoảng 1-
2mm rồi từ từ luồn kim tiêm vào tĩnh mạch.Khi nào thấy có
máu chảy vào đầu kim tiêm thì lúc đó kim tiêm đã được luồn
vào tĩnh mạch.
- Phải giữ chặt kim, không di chuyển khỏi vị trí mạch máu.
-
Một tay giữ chặt bơm tiêm, sao cho vị trí kim tiêm không
thay đổi. Tay kia từ từ rút pít tông của bơm tiêm về phía
sau.
Lưu ý: tránh rút pít tông quá nhanh gây xẹp tĩnh mạch, giảm
lượng máu vào kim.
- Hút vào bơm tiêm khoảng 3ml máu.
- Tay giữ bơm tiêm. Lấy bông có tẩm cồn 70° đặt nhẹ lên vị trí
lấy máu. Một tay rút kim tiêm ra dứt khoát và ngay sau đó tay
kia ấn chặt bông lên vị trí lấy máu để cầm máu.
- Sau đó để bơm tiêm để chếch
với thành ống nghiệm đựng máu 1 góc
khoảng 45°. Bơm từ từ máu theo thành ống
nghiệm để tránh làm vỡ hồng cầu rồi đậy nắp
ống nghiệm.
- Sau đó ly tâm máu lấy huyết thanh
Ly tâm lấy huyết thanh.
Cho máu vào máy ly tâm để lấy
huyết thanh.
2. Pha chế thuốc thử Biure.

Dung dịch làm xét nghiệm có thể mua sẵn hoặc tự pha thuốc thử
Biuret theo Gornall.
o

Thuốc thử: dựng bộ kít hóa chất mua sẵn gồm:
reagent A – protein và standard – protein
o
Thuốc thử biure tự pha theo Gornal làm như sau:
- Cân 5g CuSO4.5H2O hòa tan trong 495 ml H2O cất được dung
dịch A (dd 5g CuSO4.5H2O 1%)
- Cân 10g KNaC4H4O6 .4H2O Hòa tan trong 490 ml H2O cất .
Được dung dịch B (dd KNaC4H4O6 .4H2O 2%)
- Cân 20.5 g Na2CO3 và 4g NaOH hòa tan trong 1000ml H2O
Được Dung dịch C (dd Na2CO3 2% trong NaOH 0.1 N)
-
Lấy 1ml dd A + 1ml dd B + 98ml dd C được thuốc thử Biure.

Pha chế thuốc thử Biure
Công thức pha thuốc thử Biure

Phản ứng tạo Biure và Phản ứng với protein.

Dạng phức hợp trên ( vơi 4 nuyên tử N tham gia
liên kết phối trí ) thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại
ở bước sóng 520-535nm) trong trường hợp chỉ có 2
hay 3 nguyên tử N tham gia liên kết phối trí thì phức
có màu tím hoạc có màu xanh hấp thụ cực đại ở các
bước sóng tương ung là 540- 580 nm và 615-670
nm.

Vì thế thông thường phản ứng của các polypeptit sẽ
thay đổi khác nhau tử xanh tím đến đỏ tím.phản ứng
Biure thường được ứng Dụng để định lượng Protein
(1,3,6,9)


Thuốc thử biure có màu xanh nhạt. Thuốc thử biure
không dùng được trong môi trường có NH4+ vì NH4+ tạo
Phức với Cu2+ không màu,
bền nên không tạo phức được với protein

Thuốc thử có thể dùng trong phân tích định tính và định
lượng. Trong một phản ứng tiêu biểu một phần thể tích
của mẫu được trôn với 2 phần thể tích của thuốc thử, tỉ số
tối giản phủ thuộc vào nồng độ tối đa của protein mà ta
muốn phát hiện, sự xuất hiện của protein được tìm với
bước sóng hấp thụ khoảng 550nm – 555nm, thường thì
hay tìm với bước sóng 546 nm.

Dung dịch thuốc thử biure vừa pha được lắc
kỹ bảo quản trong lọ màu, nút kín để trong tối
ngay để tránh thuốc thử bị biến tính, bỏ đi khi
có cặn. Tốt nhất là chỉ pha ít một để dùng.

Nghĩa là để riêng dung dịch đồng sulfat và
dung dịch NaOH 10% khi cần mới trộn lẫn
theo như công thức qui định.

Bắt đầu pha thuốc thử với huyết thanh và dd Protein
mẫu:
-Hút 500 µL thuốc thử Biure vào 3 ống: trắng (Tr), mẫu (M),
thử (T)
- Hút 10µL protein mẫu vào ống mẫu
- Hút 10µL huyết thanh vào ống thử
- Lắc đều, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng

Ống nghiệm
Thuốc thử
Ống Trắng (Tr) Ống Mãu (M) Ống Thử (T)
Protein mẫu có nồng độ
64g/l (µl)
10
Huyết thanh (µl 10
thuốc thử Biure (µl) 500 500 500

Sau khi pha được dung dịch Đo máy ở bước sóng 546 nm,
phương pháp đo điểm cuối.
5
4
6
Cho dung dịch vào máy
đo quang đo ở bước sóng
546 nm.
Máy do quang