công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các phương pháp và ứng dụng của Công nghệ sinh học thực vật

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
Giảng viên hướng dẫn: …….
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011
1
CHƢƠNG IV: CÁC PHƢƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG
CNSH THỰC VẬT (8 TIẾT)
BM CNSH TV – Khoa CNSH
4.1 Giới thiệu khái niệm và các lĩnh
vực của CNSH TV
4.2 Giới thiệu các cơ sở và kỹ thuật
sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào
thực vật, các ứng dụng cụ thể
4.3 Kỹ thuật chuyển gen vào thực
vật và các hướng ứng dụng
9/3/2011
2
KHÁI NIỆM CHUNG
Khái niệm CNSH Thực vật:
– Tất cả kỹ thuật để nâng cao và cải lương sản lượng, phẩm chất
cây trồng nông nghiệp (nghĩa rộng).
– Sử dụng các cơ quan, mô, tế bào với thao tác mức độ phân tử,
xúc tiến sự sản sinh thực vật, sản xuất vật chất có ích và cải
lương giống thực vật.
Các lĩnh vực của CNSH thực vật:
– Nuôi cấy mô, tế bào thực vật
– Công nghệ tế bào thực vật
– Công nghệ gen thực vật.
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011

3
ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Nuôi cấy hạt phấn, tiểu
bào tử
- Sản xuất cây đơn bội
- Sản xuất các dòng lưỡng bội đồng hợp tử , nhờ đó mà giảm thơì gian lai
tạo
- Tạo đột biến ở mức đơn bội
Thụ phấn In vitro
- Tạo con lai mà khó tạo ra được bằng kỹ thuật cứu phôi.
Nuôi cấy cơ quan
- Bất kỳ cơ quan bộ phận nào của cầy đều có thể sử dùng làm vật liệu khởi
đầu cho nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy đỉnh sinh
trƣởng (meristem)
- Sản xuất cây sạch bệnh virus
- Sản xuất công nghiệp các kiểu gen mong muốn.
- Bảo quản in vitro nguồn gen
Phân hoá phôi vô tính
(Somatic
embryogenesis)
- Là đường hướng tái sinh chủ yếu
- Nhân nhanh
- Sản xuất hạt nhân tạo
- Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng sinh phôi
- Cho phép cơ khí hoá quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor
9/3/2011
4
BM CNSH TV – Khoa CNSH

Phân hoá cơ quan
(Organogenesis)
- Là đường hướng tái sinh chủ yếu
- Nhân nhanh
- Bảo quản nguồn gen
Nuôi cấy tế bào
- Tạo đột biến ở mức độ tế bào.
- Tạo tế bào trần để lai vô tính.
- Biến nạp gen.
- Nuôi cấy tế bào đơn
Nuôi cấy Callus
- Một số trường hợp, quá trình tái sinh qua phôi vô tính hoặc cơ quan bắt
buộc phải trải qua giai đoạn tạo mô sẹo.
- Tạo các biến dị soma có ích (biến dị kiểu gen hoặc kiểu hình)
- Cung cấp protoplast và nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù
- Sản các chất đồng hoá
- Chọn lọc in vitro
- Tạo phôi đơn tính.
Sản xuất in vitro các
hợp chất đồng hoá
thứ cấp
- Sản xuất các phức hợp hữu ích như dược phẩm, hương liệu, sắc tố, mùi
vị mà không cần phá huỷ cây mẹ
- Sản xuất các hợp chất đồng hoá mới không có trong cây
- Ứng dụng trong chuyển gen và nghiên cứu các cơ chế đồng hoá trong
cây
ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT
9/3/2011
5
Nuôi cấy tế bào và

chọn lọc in vitro ở mức
tế bào
- Sản xuất phôi vô tính, các cơ quan hình thái hay toàn bộ cây
- Sản xuất các hợp chất thứ cấp
- Sản xuất các hợp chất sơ cấp
- Cảm ứng và chọn lọc các đột biến ở mức tế bào về tính kháng bệnh, chống chịu
stress và chất lượng dinh dưỡng với thời gian ngắn, diện tích hẹp
Đột biến soma
- Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng
mong muốn
- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp
- Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bện, chống chịu stress tốt hơn
- Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú
Đột biến in vitro
- Cảm ứng tạo đa bội để tăng sinh khối hoặc năng suet
- Tạo biến dị di truyền , chọn lọc và nhân nhanh các đột biến có lợi
- Là công cụ để nghiên cứu di truyền phát triển và các quá trình sinh hoá
Tách, nuôi cấy và dung
hợp tế bào trần
- Sản xuất con lai xa, các dạng lai nhân và lai lai tế bào chất
- Tái tổ hợp các cơ quan tử
- Chuyển CMS
- Cung cấp vật liệu cho chuyển gen
- Tạo các biến dị di truyền
BM CNSH TV – Khoa CNSH
ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT
9/3/2011
6
Biến nạp di truyền
Chuyển AND lạ để tạo các tổ hợp di truyền mới

- Chuyển các gen mong muốn vào cây trồng
- Nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen
- Cảm ứng lông rễ hoặc dạng chồi để sản xuất các hợp chất thứ
cấp
- Tạo các sản phẩm dồng hoá mới không có trong cây mẹ ban đầu
Cảm ứng ra hoa in vitro
- Rút ngắn chu kỳ sinh trưởng dài ở các cây lâu năm như cây tre
- Cung cấp hoa, quả, hạt trái mùa
Vi ghép
- Khắc phục tính không tương thích khi ghép thông thường
- Nhân nhanh các dòng ưu tú
- Nhân nhanh và cứu ccs loài khó ra rễ
- Tạo cây sạch virus
BM CNSH TV – Khoa CNSH
ỨNG DỤNG CỦA CNSH THỰC VẬT
9/3/2011
7
BM CNSH TV – Khoa CNSH
CƠ SỞ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY
MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
9/3/2011
8
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Giới thiệu về tÕ bµo thùc vËt
Học thuyết tế bào: Schleiden và Schwann (1839)
đã độc lập đưa ra kết luận:
Cơ thể thực vật và động vật đều do các tế bào hợp thành và
tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của tất cả mọi
cơ thể sống.
9/3/2011

9
BM CNSH TV – Khoa CNSH
TẾ BÀO THỰC VẬT
9/3/2011
10
BM CNSH TV – Khoa CNSH
1.TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo
• Haberlandt (1992), lần đầu tiên đã quan niệm rằng: mỗi tế bào bất
kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để
phát triển thành một cá thế hoàng chỉnh.
• Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã
phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và
đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế
bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh . Đó là tính
toàn năng của tế bào.
• Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở
lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
9/3/2011
11
BM CNSH TV – Khoa CNSH
2. Sự phân hoá và phản phân hoá
• Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitro
thực chất là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào.
• Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất
bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có
nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế
bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh.
• Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh
thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng
khác nhau.

Ví dụ:
– Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp,
– Mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ,
– Nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ,
– Mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng.
9/3/2011
12
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Sự phản phân hoá tế bào:
Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng
không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình.
Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,
chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế
bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào.
2. Sự phân hoá và phản phân hoá
9/3/2011
13
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá
Phản phân hoá tế bào
Tế bào dãn
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
9/3/2011
14
BM CNSH TV Khoa CNSH
3. Môi tr-ờng nuôi cấy
Môi tr-ờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố
quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi

cấy. Có nhiều loại môi tr-ờng nuôi cấy cho các loại
thực vật khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau.
Môi tr-ờng th-ờng bao gồm các thành phần chính sau
đây:
Nguyên tố đa l-ợng
Nguyên tố vi l-ợng
Nguồn các bon hữu cơ
Các vitamin
Chất điều tiết sinh tr-ởng thực vật
Các hỗn hợp chất tự nhiên
Chất làm đông môi tr-ờng
9/3/2011
15
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011
16
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Các chất điều tiết sinh trưởng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường
quyết định kết quả nuôi cấy.
• Auxin và xytokinin được sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy in vitro.
• Auxin kích thích hình thành mô sẹo và tạo rễ bất định, kích thích sự dãn
của tế bào. Các auxin thường sử dụng là 2,4 – Dicloro phenoxy axetic axit
(2,4D), -naphtylaxetic axit ( - NAA), Indolaxetic axit (IAA). Nồng độ sử
dụng: 10
-5
-10
-7
M/l
• Xytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi.
Các Xytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA), Kinetin, 2

isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (một chất tự nhiên). Nồng độ sử dụng:
10
-5
-10
-7
M/l
• Tỷ lệ Auxin/Xytokinin quyết định sự phân hóa của mẫu cấy theo hướng tạo
rễ, chồi hay mô sẹo.
9/3/2011
17
BM CNSH TV – Khoa CNSH
MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA AUXIN VÀ CYTOKININ
9/3/2011
18
BM CNSH TV – Khoa CNSH
TỔ CHỨC PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ
TẾ BÀO THỰC VẬT
9/3/2011
19
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Văn phòng
làm việc
Phòng chuẩn
bị môi trƣờng
Bồn rửa, nồi
hấp, tủ sấy, máy
cất nước (40 –
60 m
2
)

Phòng cấy
mẫu
Kho (Hóa chất,
dụng cụ thí
nghiệm)
Phòng phân tích.
Các thiết bị phân
tích tế bào, sinh
lý, sinh học, di
truyền. (30-40 m
2)
Phòng nuôi
cây
Giàn giá nuôi
cây, hệ thống
điện
Vƣờn ƣơm cách ly (nhà lưới, nhà kính) 500 m
2
SƠ ĐỒ HỆ THỐNG PHÒNG THÍ NGHIỆM
NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO
9/3/2011
20
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Phòng chuẩn bị môi trƣờng
Được bố trí liên hoàn cho
các khâu:
- Rửa và thanh trùng
dụng cụ;
- Pha chế và khử trùng
môi trường nuôi cấy;

- Chuẩn bị sơ bộ mẫu vật
trước khi cấy.
9/3/2011
21
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Phòng cấy vô trùng
9/3/2011
22
Buồng nuôi cây
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Là buồng đặt các mẫu nuôi cấy.
Buồng này cần đảm bảo các
điều kiện:
Nhiệt độ ổn định trong khoảng
25-28
0
C.
Ánh sáng: Cường độ ánh sáng
trắng tối thiểu đạt 2000-3000
lux.
(Chế độ nhiệt và ánh sánh hoàn toàn có
thể điều khiển được theo ý muốn.)
9/3/2011
23
Phßng nu«i c©y (ViÖn Sinh häc N«ng nghiÖp)
9/3/2011
24
9/3/2011
25