Nghiên cứu, chọn lọc cá thể f2 của một số tổ hợp lúa nếp chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm, waxy bằng chỉ thị phân tử DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





ĐỀ CƯƠNG
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu, chọn lọc cá thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp
chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm, waxy
bằng chỉ thị phân tử DNA
Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Phan Hữu Tôn
Ths. Nguyễn Văn Hùng
Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng
Khoa Công nghệ sinh học - Trường
ĐHNN HN
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thanh Phong
Mã sinh viên : 540341
Lớp : CNSH A- K54
HÀ NỘI - 2013
ii
PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trên thế giới cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong 3 cây lương thực
quan trọng nhất không thể thiếu được trong đời sống hàng ngày của con
người. Lúa là loại cây phổ biến được gieo trồng ở tất cả các châu lục và
khoảng trên 100 nước, nhưng tập trung chủ yếu ở châu Á (chiếm 90 % về
diện tích).

Ở Việt Nam, cây lúa được coi là cây lương thực quan trọng nhất trong
nền sản xuất nông nghiệp. Năm 2012, theo số liệu sơ bộ của Bộ Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn, diện tích gieo trồng lúa là 7.750.000 ha chiếm trên
90% tổng diện tích đất trồng cây lương thực có hạt, với sản lượng là 43 triệu
tấn được trồng tập trung chủ yếu ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng sông
Cửu Long. Hơn nữa, lượng gạo xuất khẩu năm 2012 đạt 7,75 triệu tấn,
kim ngạch xuất khẩu đạt 3,23 tỉ đô la Mỹ, tăng 15,4% về lượng và 21,2% về
giá trị so với năm 2011 ( theo số liệu của Hiệp hội Lương thực Việt Nam
(VFA) – tháng 10/ 2012).
Trong đó, lúa nếp là một trong những nhóm lúa đặc sản lâu đời
của nhân dân Việt Nam và được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như:
nấu xôi, làm các loại bánh cổ truyền, bánh chưng, bánh dày, bánh dẻo, làm đồ
uống như rượu và nhiều loại đồ ăn khác. Và các sản phẩm từ lúa nếp đã góp
phần làm nên hương vị độc đáo, giàu tính nhân văn của văn hóa ẩm thực
Việt Nam. Lúa nếp chiếm khoảng 10 % diện tích sản xuất lúa và khoảng 10%
lượng gạo được tiêu dùng của người Việt Nam.
Lúa nếp có giá thành cao, tuy nhiên các dòng lúa nếp Việt Nam
khá nghèo nàn, có thể chia thành 2 nhóm:
- Giống nếp địa phương: Nếp cái hoa vàng, nếp cau, nếp hoa trắng…
chất lượng gạo tốt, cơm thơm, dẻo và ngon, nhưng năng suất thấp, cây cao dễ
đổ.
1
- Giống lúa nếp mới chọn tạo như TK90, 315, 415…năng suất khá,
thấp cây nhưng chất lượng gạo kém,một số giống không thơm, cơm ít dẻo đặc
biệt dễ bị nhiễm bệnh đạo ôn, bạc lá và rầy nâu.
Trong đó, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzea là loại bệnh
gây hại nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây lúa. Có nhiều biện pháp
để phòng trừ bệnh bạc lá trong đó ưu việt hơn cả là chọn giống kháng bệnh
vừa cho hiệu quả kinh tế cao, vừa cho sản phẩm sạch, lại không gây ô nhiễm
môi trường. Nhiều gen đã được nghiên cứu ứng dụng trong chọn tạo giống

lúa kháng bệnh bạc lá và những giống lúa mang một trong các gen này có
mức độ kháng cao, phổ kháng rộng.
Như vậy, việc đánh giá nguồn gen lúa nếp đặc biệt là gen thơm, gen
waxy, gen kháng bạc lá không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống
lúa đặc sản mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa
chất lượng cao. Đặc biệt với công tác chọn tạo giống hiện nay, việc lai tạo
nhiều dòng bố mẹ có gen mục tiêu mong muốn để tạo con lai có sự phối trộn
nhiều gen hữu ích đã trở nên dễ dàng hơn. Các con lai thế hệ F2 luôn mang
các phẩm chất quý: kháng sâu bệnh, chống lốp đổ…ngày càng phổ biến.
Đồng thời, với sự phát triển của các kỹ thuật chỉ thị phân tử DNA đặc
biệt là kỹ thuật PCR thì việc tìm và phát hiện một đoạn DNA liên quan đến
một tính trạng nào đó trở nên đơn giản và chính xác. Có thể đánh giá ngay ở
giai đoạn cây non tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức.
Xuất phát từ cơ sở trên, để chọn tạo các dòng giống lúa nếp chất lượng
cao, kháng bệnh bạc lá, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu, chọn lọc cá
thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm,
waxy bằng chỉ thị phân tử DNA”.
2
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
- Khảo sát các đặc điểm nông sinh học của tập đoàn giống lúa nếp
nghiên cứu.
- Khảo sát, đánh giá gen mùi thơm, gen waxy.
- Khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá và khả năng mang gen kháng
bạc lá Xa4, Xa5, Xa7 trong tập đoàn mẫu giống lúa nếp.
- Tuyển chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và những
mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao
1.2.2 Yêu cầu
- Sử dụng chỉ thị phân tử xác định gen chính quy định mùi thơm, gen
waxy và gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, Xa5, Xa7 của các thế hệ F2 dòng/

giống lúa nếp.
- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính, năng suất, chất lượng
và khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng/giống lúa nếp.
3
PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng
2.1.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng trên thế giới
2.1.2 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng ở Việt Nam
2.2 Chỉ thị phân tử
2.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen mùi thơm
2.4 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen waxy
2.5 Nghiên cứu về bệnh bạc lá trên lúa nếp
2.5.1 Nguyên nhân gây bệnh
2.5.2 Triệu chứng
2.5.3 Tác hại của bệnh bạc lá lúa
2.5.4 Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bạc lá
4
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Khu ruộng thí nghiệm và phòng thí nghiệm phòng sinh học
phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học, trường
Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: từ 01/ 2013 đến 06/ 2013.
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu
- 50 giống lúa nếp địa phương và giống đối chứng là TK90.
- Các isolate vi khuẩn bạc lá được phân lập và bảo quản tại phòng thí
nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng trường ĐHNN Hà Nội.

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Thí nghiệm đồng ruộng
a. Bố trí thí ngiệm ngoài đồng ruộng
+ Thời vụ: Vụ xuân năm 2013
+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống
+ Các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại
+ Mỗi giống cấy 5 m
2
+ Hàng cách hàng 20 cm
+ Cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh
+ Bón phân và chăm sóc như đại trà
b. Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học
Tiến hành theo phương pháp của IRRI.
* Thời kì mạ
- Gieo riêng từng dòng, cắm thẻ ở mỗi dòng, che nilon chống rét và
chống chuột.
5
- Khi mạ được 3 lá thì bắt đầu đánh dấu số lá: lá thứ 3 đánh dấu một
chấm sơn trắng, lá thứ 5 đánh dấu 2 chấm, lá thứ 7 đánh dấu 3 chấm, theo
dõi đến khi ra lá đòng ghi số liệu số lá/ thân chính.
- Mỗi dòng đánh dấu 20 cây, chọn cấy 10 cây để theo dõi.
- Theo dõi khả năng đẻ nhánh của cây mạ ở mỗi dòng.
- Theo dõi màu sắc lá mạ ở mỗi dòng.
- Theo dõi tình hình nhiễm sâu bệnh trên ruộng mạ, ghi tên sâu hoặc
bệnh, cho điểm để đánh giá mức độ gây hại.
- Theo dõi khả năng chịu rét của cây mạ trên đồng ruộng.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây mạ thông qua chỉ
tiêu: chiều cao cây mạ, chiều rộng gân mạ.
* Thời kì lúa
 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng

- Tuổi mạ: được tính từ khi gieo đến khi cấy
- Ngày hồi xanh
- Ngày bắt đầu đẻ
- Ngày kết thúc đẻ
- Ngày trỗ (có 1 cây có 1 bông nhô ra ngoài bẹ lá đòng 3-5 cm) ghi là
ngày bắt đầu trỗ. Nếu là ngày cây phân ly sớm hẳn thì ghi lại và bỏ cây phân
ly.
- Ngày trỗ 10%, 50%, kết thúc trỗ.
- Ngày chín vàng : >95% hạt chín vàng.
- Ngày thu hoạch.
 Theo dõi số lá/ thân chính
Cây đánh dấu ở ruộng mạ được cấy liên tục trên một hàng. Hàng tuần đến
đánh dấu các lá theo số lẻ mới xuất hiện, khi ra lá đòng thì ghi số liệu của cả
10 cây, cộng và chia trung bình.
 Mô tả đặc điểm hình thái
Trong quá trình sinh trưởng, mô tả trong sổ theo dõi đồng ruộng hàng
tuần.
Ở các thời điểm chính sau phải mô tả :
- Đẻ rộ mô tả : +Khả năng đẻ: Khoẻ, yếu, trung bình.
6
+ Kiểu đẻ: Xoè, gọn, chụm.
- Đứng cái mô tả : + Màu sắc lá
+ Kiểu lá
- Trỗ : + Mức trỗ nhanh - chậm, trỗ thoát - nghẹn.
+ Bông : To - nhỏ- trung bình.
+ Hạt: To - nhỏ- trung bình.
+ Màu vỏ hạt: Vàng- nâu- sọc,…
+ Mỏ hạt: Tím- vàng
+ Râu: Có - không- màu râu.
+ Xếp hạt/ bông: Thưa - sít- trung bình.

 Theo dõi sâu bệnh tự nhiên.
Hàng tuần đi quan sát, thấy dòng nào xuất hiện sâu bệnh gây hại, ghi tên
sâu, bệnh- mô tả mức độ sau 3 ngày quan sát lại nếu thấy mức độ tăng lên thì
phun thuốc phòng trừ - ghi loại thuốc, nồng độ - thời gian ngừng gây hại sau
phun - chỉ tiêu nào cho điểm thì ghi điểm.
 Đánh giá độ thuần và kiểu hình:
Khi lúa trỗ xong tiến hành đánh giá:
- Đếm số cây phân ly:
+ Thời gian trỗ sớm muộn,
+ Cao - thấp
+ Kiểu lá
+ Kiểu đẻ nhánh
+ Kiểu bông.v v
- Cho điểm kiểu hình theo IRRI
 Phân loại và tuyển chọn dòng tốt.
- Phân loại theo thời gian từ gieo đến trỗ.
< 60 ngày
61- 70 ngày
71- 80 ngày
81- 90 ngày
91- 100 ngày
101- 110 ngày
7
111- 120 ngày
> 120 ngày
- Phân loại theo chống chịu sâu bệnh : Nhẹ - trung bình- nặng.
- Phân loại theo độ thuần và kiểu hình.
Cuối cùng chọn ra khoảng 10-20 dòng tốt. Các dòng này được lấy mẫu để
theo dõi các chỉ tiêu.
 Theo dõi các dòng có triển vọng.

Sau khi đánh giá tuyển chọn, tiến hành thu mẫu mỗi dòng 10 cây nhổ cả gốc,
buộc thep bó, đo đếm các chỉ tiêu:
* Đo các chỉ tiêu :
- Chiều cao cây : Đo từ mặt đất đến hạt đỉnh bông cao nhất, không kể râu.
- Chiều dài cổ bông : Đo từ cổ lá đòng đến đốt cổ bông.
+ Nếu cổ bông vươn ra ngoài cổ lá đòng ký hiệu dấu +
+ Nếu cổ bông nằm trong bẹ lá ký hiệu dấu -
- Chiều dài lá đòng : Đo từ gối lá đến mút đầu lá
- Chiều rộng lá đòng : Đo từ mép lá bên này đến mép lá bên kia chỗ rộng
nhất.
- Số bông hữu hiệu : Đếm tất cả các bông có hạt chắc và lép.
- Số hạt /bông trung bình : Tuốt hạt cả khóm, đếm tổng số hạt (chắc và lép),
tính tỷ lệ lép, chia tổng số hạt cho số bông.
* Tỷ lệ hạt lép (%)
* Tính khối lượng 1000 hạt : Phơi khô đến độ ẩm 13% , cân 3 lần, mỗi lần
500 hạt. Nếu độ sai số giữa các lần cân không quá 0,5% thì cộng 3 lần cân rồi
chia cho 3 tính được khối lượng trung bình 500 hạt. Đem kết quả nhân với 2
để tính khối lượng 1000 hạt. Nếu độ sai số giữa các lần cân vượt quá 0,5% thì
tiến hành đếm và cân lại.
* Mô tả mầu hạt : màu sắc vỏ trấu, mỏ hạt, râu.
* Tính tỉ lệ gạo lật, gạo sát, gạo nguyên
* Đo chiều dài, chiều rộng hạt gạo lật.
8
 Các công thức sử dụng
- Năng suất tiềm năng: Tính theo công thức
NSTN= (AxBxCxD) x 10
-4
(tạ /ha).
Trong đó:
A: số bông hữu hiệu/ khóm.

B: Số hạt chắc/ bông chính.
C: Khối lượng 1000 hạt.
D: Mật độ cấy (số khóm/m
2
).
Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
- Công thức tính giá trị trung bình:
X
=
n
Xi
- Công thức tính phương sai: S
2
=
1
)(
2
1
−
−
∑
=
n
XXi
n
i
- Hệ số biến động: CV(%) =
X
S
x100

Trong đó:
n: là số mẫu quan sát
X
: là giá trị trung bình của tính trạng quan sát
S
2
: là phương sai mẫu
Xi: là giá trị thực của tính trạng quan sát ở tính trạng thứ i
c. Đánh giá các chỉ tiêu mùi thơm
Theo Sood và Siddiq (1978), mùi thơm được đánh giá cảm quan như
sau:
Mùi thơm trên lá
Thu 10 lá của mỗi mẫu giống ở giai đoạn lúa đẻ nhánh rộ. Lấy 1g lá,
cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với 5ml dung dịch
9
KOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Mức độ thơm
được chấm điểm bởi 5 người cho theo 3 mức rồi lấy trung bình.
Điểm 1: không thơm, Điểm 2: hơi thơm, Điểm 3: thơm
Mùi thơm của gạo
Lấy 10 hạt của mỗi giống, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ, làm trắng rồi
nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi giống được cho vào một ống chứa 500µl KOH
1,7%, đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi thơm cũng
bằng phương pháp ngửi của 5 người rồi cho điểm như trên.
d. Đánh giá hàm lượng amylose, độ dẻo của cơm các giống lúa
* Nhiệt hoá hồ
Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri.
Cho vào mỗi đĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ở
nhiệt độ 30
o
C. Nhiệt trở hồ được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốt

của gạo sau khi xử lý (theo phương pháp của Little và cs). Đánh giá nhiệt hoá
hồ và độ phân huỷ theo thang điểm IRRI (1996).
*Phân tích hàm lượng amylase
Định lượng amylose theo phương pháp của H. Seko, 2003: hạt lúa
được bóc vỏ, xát trắng, nghiền nhỏ. Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào
1ml Ethanol 95%, 9 ml NaOH 1N. Đun sôi ở 100
o
C trong 10 phút và định
mức cho đủ 100 ml. Lấy 5 ml dung dịch hoà tan, cho thêm 1 ml CH
3
COOH
1M, 2 ml dung dịch iodine. Định mức cho đủ 100 ml, giữ ấm ở 30
o
C trong
thời gian 20 phút rồi đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy đo quang phổ và
đọc giá trị. Đối chiếu bảng quy đổi tìm ra hàm lượng amylose. Phân nhóm
hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn IRRI (1988).
e. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
10
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae được nuôi cấy trên môi trường
Wakimoto.
Thành phần môi trường gồm:
+ Khoai tây: 300g
+ Đường saccarose: 15g
+ Pepton: 5g
+ Agar: 17g
+ Na
2
HPO

4
.12H
2
O: 2g
+Ca
2
(NO
3
)
2
.4H
2
O: 0.5g
+ Nước cất: 100ml, pH= 6.8-7.0
Môi trường Wakimoto được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong ống
nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt phẳng nghiêng.
Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn được cấy bảo quản trong môi
trường sữa ở -30
0
C, được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28
0
C sau
48-72h, sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng đạt được
nồng độ 10
8
CPU/ml để gây bệnh.
* Phương pháp lây nhiễm
Lây nhiễm theo phương pháp cắt đầu lá: dùng kéo đã khử trùng nhúng

vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá ( mỗi chủng vi khuẩn dùng một
kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2-5 cm và lây nhiễm vào
giai đoạn lúa làm đòng-trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các
lá xanh trên đó.
Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năng
duy trì độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách
lây thử trên dòng mẫn cảm IR24. Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đi
chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có độc tính có thể dùng để lây nhiễm được.
* Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
11
Sau khi lây nhiễm được 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theo
phương pháp do giáo sư Satoru Taura đề xuất.
Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của các giống
như sau:
+ Chiều dài vết bệnh < 8cm: kháng bạc lá (R)
+ Chiều dài vết bệnh từ 8-12cm: nhiễm vừa (M)
+ Chiều dài vết bệnh >12cm: nhiễm nặng (S)
3.2.2.2 Thí nghiệm trong phòng
a. Chiết tách DNA
Quy trình chiết tách DNA tổng số theo Zheng và cs (1995) có cải tiến.
+ Bước 1: thu ngắt mẫu lá khoẻ dài khoảng 2 cm bỏ vào ống nghiệm có
dung tích 1.5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào tủ lạnh.
+ Bước 2: các mẫu lá được cắt nhỏ 0.5 cm rồi bổ vào cối sứ sạch.
+ Bước 3: nhỏ 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối rồi lấy chày
nghiền nhỏ mẫu lá.
+ Bước 4: nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu
xanh đen chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
+ Bước 5: đổ thêm 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào và trộn lẫn rồi
chuyển dung dịch đó vào ống nghiệm đã đánh số.
+ Bước 6: đổ và ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol: chlorofom:

isoaminalchohol (25:24:1). Sau đó li tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút.
+ Bước 7: đổ vào ống nghiệm 400 µl (2 chlorofom: 1 isoaminalchohol).
+ Bước 8: cho 800 µl ethanol (96%) trộn đều sau đó ly tâm 5 phút với tốc
độ 13000 vòng/ phút. Đổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa dưới
đáy ống nghiệm.
+ Bước 9: rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ
phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
12
+ Bước 10: hoà tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt
độ -20
0
C hoặc 4
0
C.
Bảng 3.1 Thành phần dung dịch chiết tách
Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd
làm việc
Hỗn hợp 50ml dd
chiết tách
Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2.5ml
EDTA pH=8 0.5M 0.25mM 2.5ml
NaCl 5M 300mM 3.0ml
SDS 10% 1% 5.0ml
H
2
O 37.0ml
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch TE
Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm
việc
Thể tích 50ml

Tris-HCl 1M 10Mm 0.5ml
EDTA 0.5M 1Mm 0.1ml
H
2
O 49.9ml
b. Tiến hành nhân PCR
Quy trình phản ứng PCR: sau khi cho đủ các thành phần phản ứng và
DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này được đánh số thứ tự theo các giống
lúa) sau đó cho vào trong máy nhân gen để chạy phản ứng PCR. Đặt chu kỳ
nhiệt cho phản ứng.
* Gen mùi thơm
- Sử dụng cặp mồi (theo Bradbury và cs., 2005)
ESP: 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG-3’
IFAP: 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen thơm
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 2 giây
2 94 5 giây
13
3 58 5 giây
4 72 5 giây
5 Lặp lại 30 lần từ bước 2
6 72 5 phút
7 4
* Gen waxy
Sử dụng cặp mồi (Ayres et al., 1997)
F 484: 5’-CTT TGT CTA TCT CAA GAC AC-3’
R 485: 5’ TTG CAG ATG TTC TTC CTG ATG-3’
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Waxy
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 94 5 phút
2 94 45 giây
3 55 1 phút
4 72 1 phút
5 Lặp lại 35 lần từ bước 2
6 72 7 phút
7 4
*Gen kháng bạc lá Xa4, Xa5, Xa7
Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S. Taura và
cộng sự đề xuất.
Thành phần nhân PCR:
Bảng 3.Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, xa5, Xa7
Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cần lấy(µl)
H
2
O 13,3
PCR buffer (có chứa Mg
2+
) 10X 2,0
dNTP 2,5mM 1,6
14
Primer Forward 10 pmol/µl 1,0
Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0
DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1
Tổng thể tích cocktail 19,0
DNA mẫu 1 µl 1,0
Tổng thể tích 20 L
Nếu PCR không chứa Mg
2+
thì phải bổ sung thêm Mg ở nồng độ cuối

cùng bằng 0.5- 1.5 mM.
Các Primer dùng trong PCR:
Gen Chỉ thị NS
T
Trình tự mồi Tài liệu
Xa4
Npb
181
11
F5'- ATC GAT CGA TCT TCA CGA
GG-3'
Yoshida et
al.1992
Npb 78 R5'- GTG CTA TAA AAG GAC TTC
GGG-3'
xa5 RG556 5
F5’-TAG CTG CTG CCG TGC TGT
GC-3’
R5’-AAT ATT TCA GTG TGC ATC
TC-3’
Xa7 P3 6
F5'- CAG CAA TTC ACT GGA GAT
GTG GTT-3'
Taura et
al.2003
R5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT
ATC GGA- 3'
Chu kỳ nhiệt
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 94 4 phút
2 94 1 phút
3 56 1 phút
4 72 2 phút
5 Lặp lại 34 lần từ bước 2
15
6 72 8 phút
7 4
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen xa5
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 4 phút
2 94 1 phút
3 60 1 phút
4 72 1 phút 50 giây
5 Lặp lại 34 lần từ bước 2
6 72 7 phút
7 4
c. Chạy điện di
- Chuẩn bị gel chạy điện di: cân 1.5g agarose cho vào 50ml dung dịch
TAE và 50ml nước cất đem đun sôi trong lò vi sóng, sau đó lấy đem ra khuấy
từ từ cho tới khi dung dịch trong suốt.
- Đổ dung dịch agarose 1.5% vào khuôn gel cho tới khi đông đặc thì rút
lược ra. Đổ đầy dung dịch TAE vào bể điện di sao cho ngập giếng.
- Trải một màng parafin, nhỏ 1 µl loading dye, trộn với 8 µl dung dịch
PCR, sau đó trộn đều và nhỏ hỗn hợp vào giếng. Nhỏ theo thứ tự của các
giống DNA của các giống đã được đánh số.
- Cắm nguồn điện một chiều (75V) chạy điện di trong khoảng 25 đến
50 phút. DNA mang điện tích âm sẽ chạy về cực dương của nguồn điện.
- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng ethilium bromide
nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.

- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di.
16
PHẦN IV
KẾ HOẠCH, DỰ KIẾN
4.1 Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Tuyển chọn được một số dòng giống chất lượng từ nguồn vật liệu địa
phương.
- Trong nguồn vật liệu đánh giá.
4.2 Tiến trình thực hiện đề tài
STT Thời gian thực hiện Nội dung công việc
1 2012 Tìm tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu
2 12/1/2013 Nhận đề tài thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
3 12/1 – 29/1/2013
Làm đề cương, hoàn chỉnh và nộp đề cương.
4 29/1 – 9/2/2013
+ Soạn giống, gieo mạ, theo dõi chăm sóc mạ.
+ Chuẩn bị đất bố trí thí nghiệm.
5 9/2 – 25/2
+ Bố trí cấy, định cây theo dõi, dặm lúa, chăm sóc
lúa thí nghiệm.
17
+ Đọc tài liệu viết tổng quan
6 25/2 – 25/4
+ Theo dõi thí nghiệm định kỳ các chỉ tiêu
+ Đọc tài liệu, viết xong tổng quan nộp thầy hướng
dẫn
7 25/4 – 5/5
Theo dõi lúa trỗ.
8 5/5 – 5/6
+ Theo dõi chín và lấy mẫu, thu hoạch.

+ Tổng kết số liệu sinh trưởng, sâu bệnh, đặc điểm
hình thái, năng suất, ưu thế lai,
9 5/6 – 20/6
Viết xong báo cáo nộp thầy hướng dẫn.
PHẦN V
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Đức Thành, Đặng Thị Minh Lụa, Nguyễn Minh Phương,
Lê Thị Bích Thủy, Phân tích đa dạng di truyền các dòng lúa tú lệ và
một số giống nếp đặc sản dựa vào các gen và chỉ thị liên quan đến chất
lượng hạt gạo. Tạp chí Sinh học, T9/2008.
2. Phan Hữu Tôn, Tống Văn Hải, Sàng lọc các giống lúa có gen mùi thơm
bằng chỉ thị phân tử. Tạp chí Khoa học & Phát triển, tập 8,số 4, 2010.
3. J. S. Bao Æ H. Corke Æ M. Sun, 2006, Microsatellites, single
nucleotide polymorphisms and a sequence tagged site in starch-
synthesizing genes in relation to starch physicochemical properties in
nonwaxy rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet (2006)
113:1185–1196.
18
4. Bùi Trọng Thuỷ, Phan Hữu Tôn (2004), Khả năng kháng bệnh bạc lá
của các dòng lúa chỉ thị (Tester) chứa đa gen kháng với một số chủng
vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv oyzae gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở
miền Bắc Việt Nam, tài liệu online.
5. Bùi Trọng Thuỷ, Phan Hữu Tôn, A. Yoshimura, N.Furuya, S. Taura
(2004), Đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá của 9 dòng, giống
lúa lai Trung Quốc với 7 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
Oryzae phổ biến ở miền Bắc Việt Nam, tài liệu online.
6. Phan Hữu Tôn (2004), Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc
lá ở miền Bắc Việt Nam, tài liệu online.
7. Phan Hữu Tôn (2005), Phân bố, đặc điểm gây bệnh các chủng vi khuẩn
bạc lá lúa và phát hiện nguồn gen kháng bằng kỹ thuật PCR, tạp chí

Khoa học công nghệ và phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, tập 1,
tr.311-325.
19