luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens

Li cm n

MC LC
TRANG
PHN I. M U 1
1.1. t vn 1
1.2. Mc ớch ca ti 2
Page 1 of 55
Li đầu tiên trong bản khoá luận này tôi xin gửi lời cảm ơn
sâu sắc tới các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học
Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôi
học tập tại tr ờng và đã sắp xếp chu đáo nơi thực tập tốt nghiệp để tôi
hoàn thành bài luận văn này một cách tốt nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Huy Hàm Viện tr
ởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình h ớng dẫn và dìu dắt tôi
trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn. Cảm
ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào
thực vật Viện Di truyền Nông nghiệp đặc biệt là TS. Phạm Thị Lý
Thu, TS. Nguyễn Thị Khánh Vân, Ths. Vũ Văn Tiến và CN. Phạm
Thị H ơng đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tạo điều kiện và nhiệt
tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và
những ng ời thân đã luôn động viên, sát cánh bên tôi, giúp đỡ tôi
những khi gặp khó khăn.

Hà Nội, ng y 19 tháng 5 năm 2009
Sinh viên

1.3. ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza 4

2.1.1 Hệ thống phân loại 4
2.1.2 Đặc điểm hình thái của bèo tấm 5
2.1.3 Phương thức sinh sản 5
2.1.4 Phân bố của bèo tấm 6
2.2. Các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới đời sống bèo tấm… 7
2.3. Các phương pháp chuyển gen vào thực
vật 9
2.3.1. Phương pháp chuyển gen trực
tiếp 10
2.3.2. phương pháp chuyển gen gián tiếp 12
2.4. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens 12
2.4.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 13
2.4.2. Cấu truc và chức năng của đạn T-
DNA 14
2.4.3. Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A.tumefaciens 15
2.4.4. Hệ thống vectơ chuyển gen 16
2.5. Tình hình nghiên cứu xây dung hệ thống chuyển gen
vào bèo tấm 18
2.5.1. Tình hình nghiên cứu thế giới 18
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 20
PHẦN III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
Page 2 of 55
3.1. Vật liệu nghiên cứu 22
3.1.1. Vật liệu thực vật 22
3.1.2.Vật liệu vi khuẩn và plasmid 22
3.1.3. Hoá chất và máy móc thiết bị phục vụ cho nghiên cứu 23
3.2. Phương pháp nghiên cứu 24
3.2.1. Xây dựng hệ thống chuyển gen vào bèo tấm S. polyrrhiza 24
3.2.2. Quan sát và xác định tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus…………… … 27

3.2.3. Phương phỏp tỏch chiết DNA bèo tấm……………………………….…27
3.2.4. Phương pháp phân tích PCR…………………………………………….28
3.3. Nội dung nghiên cứu 29
3.4. Các chỉ tiêu đánh giá 31
PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào bÌo tấm S. polyrrhiza 32
4.1.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho các thí nghiệm chuyển
gen ở bèo tấm SP nguyên cây và
callus 32
4.1.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của
gen gus ở SP nguyên cây và callus 34
4.1.3.Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm
thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 35
4.1.4. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen
gus ở bèo tấm SP nguyên cây và callus 36
4.2. Chuyển gen bền vững vào callus bèo tấm Spirodela polyrrhiza
thông qua vi khuẩn Agrobacterium 39
4.2.1. Kết quả nuôi cấy phục hồi sau khi đồng nuôi
cấy 39
Page 3 of 55
4.2.2. Kết quả chọn lọc sau diệt khuẩn 39
4.2.3. Kết quả tách chiết DNA và phân tích PCR các dòng bèo
tấm chuyển gen 42
PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Đề nghị 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46


BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Page 4 of 55
ADN Deoxyribo Nucleic Acid
AS
Acetosyringone
Bp
base pair
CH
Casein hydrolysate
Cs
cộng sự
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetace Acid
Et-Br
Ethidium Bromide
gus β-glucuronidase gene= gen mã hoá β- glucuronidase
MCS
Multi-Cloning Site
NOS
Nopaline Sythetase
NOS-p
Nopaline Sythetase promotor
NptII
Neomycin phosphotransferase gene
OD600
Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR
800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter
PCR Polymerase Chain Reaction
SP
Spirodela polyrrhiza
T-DNA

Transferred – DNA = DNA chuyển
Ti-
plasmid
Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật
X-gluc
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β -D-glucuronic acid
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt
bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là
tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính mới nh chống chịu sâu,
bệnh, kháng thuốc diệt cỏ…Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn
cầu đã đạt 125 triệu ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn
Page 5 of 55
mới như: chịu hạn, chịu mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng
cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến,
tăng cường hoạt chất sinh học…đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào
ứng dụng trong sản xuất (James, 2008).
Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là
sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin,
các dược chất, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng
nguyên, kháng thể, interferon, vaccine…(Mason & cs, 1998).
Có nhiÒu hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích
khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi
khuẩn, nấm men…Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng
để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động
vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà
khoa học là tìm kiÕm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử
dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống
đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong

việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất thông qua kỹ thuật
di truyền được gọi là “Vaccine sản xuất bằng thực vật” (Rowlandson &
Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới
dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể
được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng
đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và
miễn dịch toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003).ý tưởng sử
dụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đó lôi cuốn
các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa
qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).
Page 6 of 55
Spirodela polyrrhiza là loài bèo tấm có tốc độ sinh sản vô tính nhanh.
Thời gian nhân đôi sinh khối của chóng trong vòng 36 - 48 giờ. Bèo S.
polyrrhiza dễ nuôi trồng với các thiết bị và thao tác đơn giản, môi trường dinh
dưỡng không phức tạp, tạo ra các cây bèo đồng nhất, hệ số nhân sinh khối lớn
trong thời gian ngắn, hàm lượng protein cao với thành phần axit amin phong phó
(Landolt,1986). Vì vậy việc sử dụng bèo tấm nói chung và Spirodela polyrrhiza
nói riêng làm đối tượng chuyển gen để sản xuất các loại protein tái tổ hợp có giá
trị cao với giá thành thấp là một hướng nghiên cứu triển vọng.
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, chúng tôi
thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm
Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens “.
1.2. Mục đích của đề tài
Xây dựng quy trình chuyển gen vào callus và bèo tấm nguyên cây Spirodela
polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens .
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
*Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về
khả năng tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vào loài bèo tấm
Spirodela polyrrhiza.
* Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào bèo tấm

Spirodela polyrrhiza nhằm sản xuất protein tái tổ hợp.
Page 7 of 55
PHẦN II . TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza
2.1.1 Hệ thống phân loại
Bèo tấm gồm 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffia, Wolffiella
thuộc họ Lemnaceae với khoảng 40 loài khác nhau (Landolt, 1998; Les & cs,
2002; /> Spirodela polyrrhiza thuộc:
Giới : Thực vật (Plantae)
Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheobionta)
Liên ngành: Thực vật có hạt (Spermatophyta)
Ngành: Ngọc lan (hạt kín) (Magnoliophyta)
Lớp: Một lá mầm (Liliopsida)
Phân lớp: Ráy (Arecidae)
Bộ: Ráy (Arales)
Họ: bèo tấm (Lemnaceae)
Chi: Spirodela

a. Bèo trong vại nuôi b. Hình thái bèo tấm S.polyrrhiza
Hình 2.1: Bèo tấm Sprirodela polyrrhiza
Page 8 of 55
a
b
S. polyrrhiza thuộc chi Spirodela, chi này gồm 2 loài: S. intermedia và
S. polyrhiza. Chi Spirodela là chi nguyên thủy nhất trong họ Lemnacea và có
kích cỡ genome nhỏ nhất (Landolt, 1986).
2.1.2 Đặc điểm hình thái của bèo tấm
Bèo tấm nói chung không có dạng thân, lá điển hình mà cơ thể gãi gọn
trong một cấu trúc gọi là cánh bèo (frond). Chúng có hình dạng và kích thước rất
đa dạng, từ,1 mm đến 10,0 mm, từ hình cầu đến hình trứng méo, hình ovan; từ

không rễ tới có một rễ và nhiều rễ. Mặc dù tổ chức cơ quan của chóng bị suy
giảm so với các loài thực vật điển hình nhưng hầu hết các loài bèo tấm có đầy đủ
các mô và cơ quan tương tự nhiều loài thực vật hạt kín lớn hơn như: rễ, hoa, quả,
hạt, Sự suy giảm về tổ chức cơ thể có thể quan sát thấy bắt đầu ở chi Spirodela,
tiếp đến là chi Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986).
Bèo tấm S. polyrrhiza có hình dạng giống chiếc lá, hình trứng méo, cơ
thể dạng bản mỏng, dài 1,5 – 10,0 mm, rộng 1,5- 8,0 mm. Mặt trên cánh bèo có
màu xanh nhờ sự tập trung của diệp lục, đôi khi có một chấm nâu ở vùng nút
(node) cánh. Mô biểu bì gồm nhu mô quang hợp xen kẽ bởi các gian bào khí lớn,
nhờ các gian bào khí này mà bèo tấm trôi nổi được trên mặt nước. Mặt dưới (mặt
bụng) có màu nâu đỏ, thường gặp khi bèo hoá già hoặc sống trong môi trường
thiếu chất dinh dưỡng. Phần phía dưới nút có hai túi bên do vảy mành tạo thành.
Các cánh bèo con được hình thành từ mô phân sinh tại điểm nút nằm trong hai túi
màng này. Mỗi cánh bèo có 7-21 rễ mọc ra tại vùng nút phía ngoài hai tói
(Landolt, 1986).
2.1.3 Phương thức sinh sản
Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nòi giống: sinh sản hữu
tính và sinh sản vô tính. Sinh sản hữu tính được thực hiện thông qua sự ra hoa và
tạo hạt tương tự như các loài thực vật hạt kớn khỏc. Không chỉ có kích thước cơ
thể nhỏ mà hoa và hạt của bèo tấm cũng rất nhỏ bộ, chớnh vì thế mà bèo tấm
Page 9 of 55
được xem là loại thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong thế giới thưc vật (Landolt,
1986).
Bèo tấm sinh sản vô tính thông qua hình thức nảy chồi, các cánh bèo con
được sinh ra từ vựng mụ phân sinh nằm sâu trong cánh bèo mẹ và chúng tách
khỏi cánh bèo mẹ khi trưởng thành ở hầu hết các loài. Khi các cánh bèo con được
hình thành thì bản thân chỳng đó mang sẵn các thế hệ cánh bèo tiếp theo đang
được hình thành ở mô phân sinh của chúng (Landolt, 1986).
Trong tự nhiên, sinh sản vô tính là phương thức chủ yếu giúp cho quần
thể bèo phát triển nhanh chúng, cũn phương thức sinh sản hữu tớnh giỳp cho

quần thể bốo cú sự đa dạng về di truyền và chỉ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ, độ ẩm
và chất dinh dưỡng thớch hợp với sự ra hoa, thụ phấn và kết trái. Hạt của bèo
tấm có sức chống chịu lớn với cỏc điốu kiện nóng, lạnh và khô hạn nên có thể tồn
tại qua nhiều năm trong bùn, đất và các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Ladolt,
1986).
2.1.4 Phân bố của bèo tấm
S. polyrhiza nói riêng và bèo tấm nói chung, sống ở các vùng nước ngọt
như ao hồ hay đầm lầy Đặc điểm của các vùng nước này là tĩnh lặng hoặc có
dòng chảy chậm. Chúng cũng có thể sống ở các vùng nước lợ nhưng rất hiếm
thấy (Landolt, 1986).
S. polyrhiza phân bố rộng rãi trên toàn thế giới trừ vùng cực Bắc, cận
Bắc cực, những vùng rất ẩm ướt hay rất khô với mùa hè ấm, phia Đông và phía
Nam của Nam Mỹ, New Zealand và một số đảo khác, hiếm gặp ở cỏc vựng cú
khí hậu Địa Trung Hải (Landol, 1986).
Page 10 of 55
Hình 2.2. Phân bố của bèo tấm S. polyrrhiza (Landol, 1986)
2.2. Các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới đời sống bèo tấm
a) Thành phần môi trường: Cây trồng nói chung và bèo tấm nói riêng sinh
trưởng và phát triển tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường.
Cho đến nay người ta tìm ra được nhiều loại môi trường dinh dưỡng cơ bản như:
Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962), môi trường LS (Laismener &
Shoog, 1963), môi trường Knop (Knop, 1974), môi trường B5 (Gamborg, 1986),
môi trường H (Hutner, 1953) Mỗi đối tượng cần có một môi trường thích hợp
với sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Đối với S. polyrrhiza nói riêng và các
loài bèo tấm nói chung, một trong các môi trường nuôi nhân tạo thích hợp nhất
thường được sử dụng là môi trường khoáng Hutner, 1953 (Landolt, 1986).

Page 11 of 55
Bảng 2.1. Thành phần các chất dinh dưỡng cần thiết cho Spirodela polyrrhiza
(Theo Eyster, 1966) (Đv: mM)

Nguyên tè Lượng tối thiểu Lượng thích hợp Lượng tối đa
N (NO
3
-
)
N (NH
4
+
)
P
S
K
Na
Ca
Mg
Cl
Fe
Mn
Zn
B
Mo
Cu
< 0,5
< 0,5
0,005
0,001
0,005
< 0,00001
0,2
0,01

0,0001
0,0005
0,00001
0,002
< 0,00001
< 0,000001
< 0,00001
10 -30
2,5- 5
0,2 – 1
0,5 – 20
1 – 20
0 – 60
0,5 – 10
0,2 – 4
0,01 – 1
0,01 – 0,1
0,001 – 0,06
0,02 – 0,5
0,1 – 1
0 – 0,3
0,001
100
75
50
50
50
> 60
50
50

> 10
1
1
5
10
3
0,1
b) Các yếu tố khác
* Nhiệt độ
Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật. dối với bèo tấm thì nhiệt độ thích hợp cho hầu hết các loài là
khoảng 21 – 30 °C tùy thuộc vào cường độ chiếu sáng và hàm lượng chất dinh
dưỡng. theo Rẹmankova & cs (1986) thì S. polyrrhiza sinh trưởng tốt nhất ở 31
°C.
Page 12 of 55
Tuy nhiên ta có thể tìm thấy bèo tấm S. polyrrhiza ở những nơi có khí
hậu khá lạnh (12 – 13,5 °C) hay những nơi có nhiệt độ cao (34 – 38°C).Ở nhiệt
độ khắc nghiệt, bèo tấm ngừng sinh trưởng và hình thành chồi ngủ (turion) chỡm
sõu xuống mặt nước, đến khi nhiệt độ thích hợp thì chồi ngủ nảy mầm, hồi phục
trở lại (chồi ngủ của S. polyrrhiza có thể sống sót ở - 4oC trong ít nhất 3 tháng và
45 °C trong vòng một tuần) (Jacob, 1947).
* Ánh sáng
Về bản chất, ánh sáng có mối liên hệ mật thiết với nhiệt độ. Thông
thường trong tự nhiên, khi cường độ chiếu sáng cao thì nhiệt độ cũng tăng lên.
Bèo tấm sinh trưởng và phát triển được cả ở những nơi có nắng chiếu trực tiếp và
nơi bóng râm, tuy nhiên nơi bóng râm thường thích hợp hơn cho sự sinh trưởng
và phát triển của chúng. Bèo tấm cũng có thể sinh trưởng hoàn toàn trong bóng
tối nếu các chất hữu cơ như các loại đường có mặt trong môi trường nuôi
(Landolt & Kandeler, 1987).
* Độ pH

pH ảnh hưởng đến khả năng hút chất dinh dưỡng của cây. Bèo tấm có thể
sinh trưởng và phát triển trong môi trường có dải pH từ 3,5 – 10,4.
2.3. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh
vật nói chung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid
tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt
động tổng hợp nờn cỏc protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới
của cơ thể chuyển gen (GS. TS Nguyễn Quang Thạch, 2004).
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân thành
hai nhóm chính: Phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen
Page 13 of 55
gián tiếp. Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào
thực vật qua mét sinh vật trung gian, thường là vi khuẩn, virus. Còn ở phương
pháp chuyển gen trực tiếp, gen được đưa trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua
những thiết bị và thao tác nhất định mà không phải nhờ tới các sinh vật trung
gian(GS. TS Nguyễn Quang Thạch, 2004).
2.3.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp
a) Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào các tế bào trần. Sau khi thu
được tế bào trần, tạo huyền phù tế bào trần với các plasmit tái tổ hợp mang gen
mong muốn và gen chọn lọc. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong
huyền phù tế bào trần 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20kHz theo từng
nhịp ngắn 110 mili giây. Tổng thời gian tác động khoảng 500 - 900 mili giây. Sau
đó đem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc
để tách các tế bào trần đã nhận được DNA. Nuôi cấy tái sinh cây.
b) Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation)
Kỹ thuật này áp dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Người ta
chuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmit tái tổ hợp mang gen mong
muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200 - 600

V/cm trong khoảng thời gian ngắn 4 - 5 phần nghìn giây. Kết quả làm cho màng
tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời có đường kính khoảng 30 ηm, mà
qua đó các DNA biến nạp ở bên ngoài có thể xâm nhập vào trong tế bào. Sau quá
trình điện xung, tế bào trần được nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi
trường chọn lọc để tách các tế bào trần đã thu nhận DNA. Sau đó các tế bào trần
này được nuôi cấy tái sinh cây và tiếp tục chọn lọc.
c) Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide
Page 14 of 55
Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất.
Sợi silicon carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 µm và dài khoảng 10 - 80
µm. Khi lắc một huyền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tổ hợp mang gen mong
muốn và gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các
tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập vào. Sau đó các tế bào này
được nuôi cấy tạo mô sẹo, tái sinh cây và chọn lọc để tách ra những cây mang
gen chuyển.
d) Chuyển gen bằng súng bắn gen
Chuyển gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là các
phần tử kim loại nặng có kích thước hiển vi và có tỷ trọng cao để đạt được gia
tốc cao. Dưới tác dụng của một lực nén chúng có thể xuyên qua vỏ và màng tế
bào, đưa líp DNA bọc ngoài vào tế bào và tiếp cận với bộ máy di truyền của tế
bào. Tách các mô tế bào đó nuôi cấy tái sinh thành cây (Sanford & cs., 1987;
Nguyễn Đức Thành, 2003).
e) Biến nạp bằng hoá chất PEG (polyethylene glycol)
Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp
chuyển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần. Ở
nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa mà
kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ
cao của Ca2+ hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tế
bào trần.
Ngoài ra còn có các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: Phương

pháp vi tiêm ( sử dụng các thiết bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen
trực tiếp vào tế bào, thường áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như
hạt phấn, phôi non); Phương pháp vĩ tiêm (sử dông kim tiêm có đường kính lớn
Page 15 of 55
hơn đường kính tế bào để đưa DNA vào tế bào, thường áp dụng cho những đối
tượng có bầu nhụy lớn, dễ thao tác); Phương pháp sốc nhiệt, (Nguyễn Đức
Thành, 2003).
2.3.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
2.3.2.1. Chuyển gen nhờ virus
Virus được sử dụng làm vectơ chuyển gen cho cây trồng do rất dễ thâm
nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng có
mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy nhiên hiện
nay, việc chuyển gen nhờ virus rất Ýt được sử dụng, do virus về nguyên tắc
không truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải
tiến hành bằng phương pháp vô tính. Điều này không phải thực hiện được với tất
cả các loài cây. Đây chính là một nhược điểm lớn của phương pháp chuyển gen
bằng virus.
2.3.2.2. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
Dựa vào cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens, người ta đó
dựng vi khuẩn đất để chuyển các gen mong muốn cho mỡnh trờn cơ sở thiết kế
lại hệ thống Ti – plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo được chức năng
chuyển gen nhưng không mang các gen gây độc cho cây. Người ta đã tạo ra các
dạng vector mới để chuyển gen là những vector liên hợp và vetor nhị thể. Các hệ
thống vetor mới đượ tạo thành này đều được dựa trên cơ sở cải tiến Ti – plasmid.
Phần T-DNA củ Ti-plasmid sẽ bị cắt bỏ những gen gây u và gen tổng hợp opine,
thay thế vào đấy là các gen mong muốn kèm theo gen chỉ thị và gen khởi động.
2.4. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã được áp dụng thành
công trên nhiều đối tượng cây trồng đặc biệt là cây hai lá mầm nh: khoai tây, cà
Page 16 of 55

chua, thuốc lá, đu đủ… Sự chuyển nạp nhờ vi khuẩn vào cây một lá mầm khó
thành công do cây một lá mầm nh hoà thảo thường không có phản ứng với sự
thương tổn. Vết thương không dẫn đến sự phản phân hoá tế bào lân cận. Mặt
khác, vi khuẩn khó gắn kết với thành tÕ bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm,
hoạt động của vùng vir bị ức chế.
Gần đây phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã thành công ở
một số cây hoà thảo nh: lúa (Hiei & cs., 1994; Khanna & cs., 1999; Khanna &
cs., 2003), ngô (Ishida, 1996). Trong trường hợp này người ta dùng tế bào phôi ở
dạng huyền phù làm đối tượng chuyển nạp trong môi trường nuôi cấy có bổ sung
chất dẫn dụ acetosyringone.
2.4.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid (tumor inducing = Ti) được phát hiện ở tất cả các chủng A.
tumefaciens gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30
o
C. Đây là một
phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép
độc lập (hình 1.2), dài khoảng 200kb và có trọng lượng phân tử bằng 3 - 5% so
với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Phân tích di truyền cho thấy,
Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng
tương đồng, trong đó vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng VIR), liên quan trực
tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho
việc sao chép plasmid và chuyển nạp.

Page 17 of 55
Vïng g©y khèi u
Vïng g©y khèi u


(Onc)
(Onc)

T-ADN
Vùng phân
Vùng phân
giải nopaline
giải nopaline
Vùng tái bản
Vùng tái bản
Vùng tiếp hợp
Vùng tiếp hợp
plasmid
plasmid
Vùng
Vùng
gây độc
gây độc
vir
vir
A
B
C
D
pTiC58
(Nopalin)
Hình 2.3. Cấu tróc Ti-plasmid
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn sang hệ
gen của cây chủ và tồn tại bền vững ở đó. Tuy nhiên, vùng này không mã hoá
những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA mà cần có sự trợ giúp
đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi
khuẩn (gen chv).
2.4.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA

Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau
cho thấy, T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp gần như hoàn toàn dài
khoảng 25bp, gọi là đoạn biên (hình 1.3). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá
trình chuyển T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật.

Hình 2.4. Cấu trúc T-DNA
ở đoạn biên phải (Righ Boder-RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho
quá trình chuyển T-DNA. Đoạn biên trái (Left Boder-LB) gián tiếp tham gia vào
quá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường
(Negrotto & cs., 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).
Các gen trên T-DNA gồm 2 nhóm: (1) Nhóm gen mã hóa các enzyme
cho các quá trình sinh tổng hợp opine - là sản phẩm được vi khuẩn A.
tumefaciens sử dụng làm nguồn năng lượng cung cấp Cacbon và Nitơ; (2) Nhóm
gen gây khối u mang các gen tms1, tms2 mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, tmr mã
Page 18 of 55
LB RB
TGGCGGATATATATGTGGTGTAAAC
TGACAGGATATATGGCGGGTAAAC
Tms2
1
Tmr
Tms1
2


Vïng g©y khèi
Vïng g©y khèi


u

u


(Onc)
(Onc)
nos
hóa cho enzyme liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin (PGS. TS Khuất Hữu
Thanh, 2003).
2.4.3. Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào ở cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất của phenol như:
Acetosyringon, hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng dẫn dụ của các hợp chất
này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào cây chủ. Protein VirA
nằm trên thành tế bào vi khuẩn Agrobacterium sẽ nhận biết sự có mặt và tương
tác với các phân tử acetosyringon, có mặt các phân tử đường. Tiếp đến VirA sẽ
phosphoryl hoá protein VirG làm cho VirG trở thành dạng hoạt động. Đến lượt
VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE cũng như
tăng cường mức độ phiên mã của gen virG (Mclean & cs., 1994) bằng cách tương
tác với trình tự điều hoà của VIR box. Tiếp theo đó, tại vùng T – DNA kể cả 2
biên, 1 đoạn DNA mạch đơn tách ra khỏi Ti-plasmid và chuyển vào tế bào thực
vật với đầu 5’ đi trước (Janofsky & cs, 1986). Đoạn DNA mạch đơn còn lại trên
Ti-plasmid sẽ làm khuôn để tổng hợp mạch DNA bổ trợ mới. Gen VirD mã hoá
cho một số endonuclease cắt T-DNA ở vị trí giữa nucleotid thứ 3 và 4 của trình
tự biên. Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T,
sợi T được chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5’ đi trước (Wie và cs., 2000).
Đầu 5’ của sợi T được liên kết đồng hoá trị với protein VirD2 ở vị trí axit amin
tyrosine 29 (Gelvin, 2003).
Trong quá trình di chuyển, protein VirE2 gắn với sợi T tạo thành phức
hợp T dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác
động của các enzym thuỷ phân và các enzym endonuclease có trong dịch bào của
tế bào cây chủ. Protein VirB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khuÈn và tế bào cây

chủ giúp cho sợi T có thể được vận chuyển sang tế bào cây chủ (Zupan & cs.,
2000). Protein VirD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trò là tín hiệu nhận biết
Page 19 of 55
trong hệ thống vận chuyển này (Hooykaas và Schilperoot, 1992). Sau khi T-DNA
qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật ở
những vị trí ngẫu nhiên (hình 1.4).
Hình 2.5. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật (Zhu & cs., 2000)
Tại đó nhờ sự điều khiển của gen thực vật mà các gen trên T-DNA bắt
đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái
quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Wie & cs., 2000; Lê
Thị Thu Hiền, 2003).
2.4.4. Hệ thống vectơ chuyển gen
Ti-plasmid ban đầu ở Agrobacterium không được sử dụng làm vectơ
chuyển gen do chúng có kích thước lớn gây khó khăn cho việc sao chép ở mức
phân tử và chuyển nạp gen; mặt khác chúng lại chứa các gen tổng hợp opine
không cần thiết cho cây mà chỉ cần cho vi khuẩn và các phytohoocmon gây nên
khối u ở cây bị xâm nhiễm; chúng có nhiều vị trí nhận biết của một enzym giới
hạn do dã mét enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều điểm
khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho
Page 20 of 55
hoạt động của một số enzyme giới hạn; ngoài ra các gen onc được dùng làm chỉ
thị chọn lọc có tính trội, nhưng chúng lại cản trở quá trình tái sinh bình thường ở
thực vật. (Lê Trần Bình & cs., 2003; Lê Thị Thu Hiền, 2003)
Với những lý do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến như: cắt bỏ
các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng đa nhân dòng
(MCS), tạo hai hệ thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ nhị thể (binary vector)
và vectơ liên hợp (co-integrate vector). Nhờ vậy, cây trồng được biến nạp bằng
Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát
triển bình thường (Hajdukiewicz & cs., 1994).
2.4.4.1. Hệ vectơ nhị thể

Trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một plasmid
với vùng T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-DNA
vào hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vectơ nhị thể
trong đó vùng T-DNA và vùng VIR nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong
cùng một chủng A. tumefaciens (hình 2.6).
Hình 2.6. Sơ đồ cấu trúc vectơ nhị thể
Cã hai loại vectơ được sử dụng trong hệ thống vectơ nhị thể là vectơ
chuyển gen và vectơ bổ trợ. Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacterium,
khi các gen trên vectơ bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới
Page 21 of 55
đoạn T-DNA trên vectơ chuyển gen dẫn đến việc chuyển đoạn T-DNA sang tế
bào thực vật (Lê Thị Thu Hiền, 2003).
2.4.4.2. Hệ vectơ liên hợp
Vectơ liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương
đồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vectơ của E. coli) với vùng T-DNA trên Ti-
plasmid của A. tumefaciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng
mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-
plasmid (hình 1.6).
Hình 2.7. Sơ đồ cấu trúc vectơ liên hợp
Có 3 loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp đó là: Ti-plasmid;
vectơ trung gian và vectơ trợ giúp (Walkerpeach & Velten, 1994).
2.5. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Có rất nhiều các nghiên cứu về hệ thống phân loại, sinh lý, sinh hóa, hình
thái, cấu tạo, sinh sản đã được tiến hành trên các loài bèo tấm khác nhau
(Landolt, 1986; Landolt & Kandeler, 1987), tuy nhiên các nghiên cứu về chuyển
gen vào bèo tấm thì còn hạn chế.
Năm 2001, Yamamoto & cs đã áp dụng qui trình tạo callus trên đối
tượng L.gibba G3 của Moon và Stomp (1997) để xây dựng quy trình chuyển gen
Page 22 of 55

thông qua Agrobacterium tumefaciens vào bèo tấm L.gibba G3 và L.minor 8744
và 8627. Tác giả đã thu được 1 dòng bèo chuyển gen thuộc loài L.gibba G3 và 3
dòng bèo chuyển gen của L.minor 8627 (2 dòng) và L.minor 8744 (1 dòng). Gen
được chuyển là gen gus được điều khiển bởi promotor CaMV35S. Kết quả phân
tích lai ADN cho thấy tất cả các dòng bèo chuyển gen đều thấy sự có mặt gen
gus (Yamamoto & cs., 2001).
Còng trong năm 2001, Boehm & cs. đã xây dựng hệ thống chuyển gen
nguyên cây vào bèo tấm Wolffia columbiana nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens LBA4404 chứa plasmit p35SGUSINT. Hiệu quả chuyển gen ban đầu
chỉ đạt 3,9%, nhưng khi quá trình biến nạp được diễn ra trong điều kiện chân
không hoặc xử lý với corodum đã làm tăng hiệu quả chuyển gen lên 15 - 20% số
cánh bèo có biểu hiện màu xanh chàm của gen gus (Boehm & cs., 2001).
Trên thế giới, trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu chuyển
gen để sản xuất hoạt chất bằng bèo tấm. Các nhà khoa học Mü, Israel, Pháp đã sử
dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt
chất khác nhau, trong đó có vaccine. Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tài
trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích ứng dụng công nghệ sinh
học trên đối tượng bèo tấm (www. lemnagene. com).
Mới đây, Rival & cs. đã áp dụng quy trình nuôi mô và chuyển gen vào
bèo tấm Spirodela oligorrhiza của Edelman & cs. (1998) và Li & cs. (2004) để
chuyển thành công gen mã hoá aprotinin, một loại chất ức chế protease serin
được dùng trong sản xuất dược phẩm nhằm làm giảm phản ứng viêm nhiễm và
giảm sự mất máu trong giải phẫu tim và gan. Bên cạnh gen mã hoá cho aprotin
trưởng thành, tác giả còn thiết kế thêm một trình tự peptit đóng vai trò là tín hiệu
tiết do promoter CaMV35S điều khiển. Nhờ trình tự tín hiệu tiết này mà protein
tạo ra từ 25 dòng bèo tấm chuyển gen được tiết thẳng vào môi trường nuôi cấy
Page 23 of 55
với tỷ lệ 3,7% và được phát hiện nhờ phân tích northern, western và xác định
trình tự axit amin (Rival & cs., 2007).
2.5.2. Tình hình nghiên cứu về bèo tấm trong nước

ở nước ta bèo tấm tồn tại phổ biến ở hầu hết mọi nơi. Tuy chưa có
một nghiên cứu đầy đủ về phân loại học thực vật các loài bèo tấm Việt Nam
nhưng qua đặc điểm hình thái chúng tôi thấy rằng ở Việt Nam có mặt rất nhiều
loài của cả 5 chi thuộc họ Lemnaceae. Nhiều loài được sử dụng rộng rãi trong
chăn nuôi. Một số loài trước kia được sử dụng làm thức ăn cho người ở một số
vùng nônng thôn như các loài chi Wolffia.
Các nghiên cứu liên quan đến bèo tấm ở Việt Nam chỉ hạn chế ở việc sử
dụng làm thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm. Tại Đại học Nông lâm thành phố
Hồ Chí Minh, các nhà khoa học thử nghiệm bổ sung bèo tấm cho 200 con gà
giống Tàu Vàng, kết quả gà tăng trọng nhanh và chi phí thức ăn giảm 10 –
15%/kg thịt. Thí nghiệm trên gà mái đẻ, trứng cho lòng đỏ đậm và hương vị thơm
hơn.
Đại học Huế cũng đó cú một số nghiên cứu ứng dụng họ bèo tấm
Lemnacae trong việc cải tạo môi trường nước. Kết quả cho thấy bèo có khả năng
hấp thụ NH4+ khá cao từ 90 – 100%, trong đó bèo Nhật bản hấp thụ từ 93 –
100%, bèo tấm hấp thụ 90 – 93,33% và bèo cái hấp thụ 90 – 99,99%. Bèo cũng
có khả năng hấp thụ PO4+ cao từ 35 – 58,6%, trong đó hấp thụ cao nhất là bèo
Nhật Bản từ 40 – 58,6%, bèo tấm hấp thụ 42,22 – 50% và bèo cái hấp thụ từ 35 –
53,44% ().
Tại viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam, quy trình chuyển gen mã hoá
virus Gumboro VP2 (gây bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng ở gà) vào callus
và bèo tấm nguyên cây (Lemna sp. và Wolffia sp. ) bằng súng bắn gen và
Page 24 of 55
Agrobacterium đã được xây dùng và cải thiện trên cơ sở tối ưu hoá các yếu tố
chính ảnh hưởng đến quá trình bién nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ AS, thời gian
đồng nuôi cấy,…Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen
đã được phân tích bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southem) đã
nhận được 06 dòng bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2. Protein VP2 đã
được tách chiết từ các dòng bèo tấm chuyển gen. Thử nghiệm bước đầu cho thấy
01 dòng bèo tấm chuyển gen có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà. (Báo

cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam,
2008).
Page 25 of 55