luận văn công nghệ sinh học Sàng lọc và tuyển chọn chủng nấm Le85, 8514, L43 có khả năng diệt rệp đào hại cải cao

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGSTS Quyền Đình Thi, Phó Viện
trưởng, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm,
sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, ThS
Lê Thị Thùy Dương, ThS Nguyễn Hữu Quân cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh
học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm
khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học
Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt
quá trình học tập.
Hà nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên
Nguyễn Đức Thuận
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức Thuận
Danh mục chữ viết tắt
Chữ viết tắt Tên đầy đủ
PDA Potato dextrose agar
PDB Potato dextrose broth
LB Luria-Bertani
EDTA Etylene diamine tetra acetic acid
PCR Polymerase chain reaction
TBE Tris base Boric acid EDTA
TE Tris EDTA
OD Optical density
w/v Weight/volume
M Marker
Kb Kilo base

Bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
v/v Volume/volume
LT
50
Thời gian gây chết một nửa số rệp thí nghiệm
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1.Giới thiệu chung về rệp 2
ựcvt 4
1. 2 . Tình hình rệp hại và sử dụng nấm diệt côn trùng trê 4
thiới 4
1. 2 .1. Tình hình rệp hại trê 4
đaghoành hành 5
1. 2 .2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn 5
06oettel et al. , 2008) 8
. 8
1. 3 . Tình hình rệp hại và sử dụn 8
nấiệt côn trùng tại Việt Nam 8
1. 3 8
mậộ cao vào tháng 4-5 và tháng 9-10 9
1. 3 .2. Tình h 9
rùgvà rệp cây khác 12
(Vu et al. , 2007) 12
in đã tối ưu 16
(Vu et al. , 2008) 16

16
C hư 16
nh vtgốc, Viện v 16
Các hóa chất sử dụng t 17
ợc thực hiện theo 18
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
vi sn đều được khử trùng ở 18
iết bị chính sử 19
ng trong thí nghiệ được liệt kê ở bảng 2.1 19
2.2.P 19
p hếtbởi nấm, làm cơ sở đánh giá khả nă 19
eotd, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại 23
2.2 . 3 23
quan sát tỷ lệ nảy mầm của bào 25
ử 25
Chương 3: KẾT QẢ VÀ THẢO LUẬN 25
à nghiên cứu sản xuất bào tử trên môi trường lên(A) men xốp. 29
Hình 3.2. Rệp khi phu(B)n đối chứng 0,05% Tween 80 , rệp chết bởi nấm (C)t29
n lá rau cải , rệp chết bởi nấm, chụp với kính hiển vi 10X 29
.2 29
ìh ự đạn gene 28S rRNA của chủng 8514 có độ dài 600 bp 31
3 .3 . Ả nh hư 31
g mộtsố yếu tố lên men xốp lê 31
ó ,cchất này được s 32
ọn ựđể bổ sung vào 33
sảut tương ứng 35
chứsố lượng bào tử được sinh ra tương ứn 36
là 1,2x19 và 9x10 8 /g 36
3.3 . 5 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 36

Bảng 3.2 . Ảnh hưởng của chất hoạt độn 36
. D ung dịch 0,02% Tw 37
4 ở các nhiệt độ 38
Viegas 44
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
MỞ ĐẦU
Rệp là loài côn trùng gây hại rất lớn đối với cây trồng. Trong đó, rệp đào Myzus
persicae, rệp hại bông Aphis gossypii, rệp hại ngô Maydis aphid là một trong những loài
gây hại phổ biến trên nhiều cây trồng. Hàng năm, trên thế giới sản lượng nông nghiệp bị
tổn thất do nạn rệp gây ra lên tới hàng tỷ đô la. Trong vòng 4 năm trở lại đây, tốc độ tăng
trưởng của rệp rất nhanh, kéo theo vùng gây hại của chúng ngày càng mở rộng.
Ở Việt Nam, cây trồng bị rệp tàn phá diễn ra với mức độ cao. Rệp gây hại trên nhiều
loại cây trồng như ngô, cà phê, sầu riêng, cây bông, làm ảnh hưởng đến năng suất cây
trồng và chất lượng nông sản, gây thiệt hại lớn về kinh tế đối với người sản xuất. Rệp
đang là mối đe dọa nguy hiểm đối với các loại rau, lương thực. Ở nước ta, cây rau cải
xanh và cây bí được trồng rất phổ biến ở nhiều vùng, là loại rau lương thực được sử dụng
thường xuyên trong bữa ăn hàng ngày của người dân. Do được trồng nhiều và thường
được trồng thành những khu vực tập trung chuyên canh, nên khả năng bị rệp gây hại cục
bộ là rất lớn, gây thiệt hại cho nhà sản xuất.
Trên thế giới, có nhiều chế phẩm diệt rệp có nguồn gốc hóa học. Một trong những tồn
tại lớn của sản xuất nông nghiệp hiện nay là việc sử dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực
vật có nguồn gốc hóa học. Tình trạng này nếu cứ tiếp diễn sẽ đi ngược lại mục tiêu xây
dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn mà chúng ta đang nỗ lực tiến tới. Theo
đó, các nhà khoa học đang rất quan tâm nghiên cứu để tìm ra thuốc bảo vệ thực vật có
nguồn gốc vi sinh vật. Các chế phẩm được sản xuất từ nấm kí sinh côn trùng, trong đó có
chế phẩm diệt rệp, châu chấu có nguồn gốc từ bào tử của chủng Lecanicillium spp. trên
thị trường đã có sản phẩm thương mại như Vertalec và Mycotal diệt côn trùng. Tuy
nhiên, giá thành của các sản phẩm này còn cao đối với nhà nông. Vì vậy, việc nghiên cứu
tạo ra một chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật có giá thành thấp, đồng thời

cho hiệu quả diệt rệp cao, là rất cần thiết và cấp bách ở nước ta.
Xuất phát từ những nhu cầu thực tế, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu
sau: i) tuyển chọn chủng nấm có khả năng diệt rệp đào mạnh; ii) tối ưu các điều kiện lên
men xốp để sản xuất cao sản bào tử bởi chủng nấm diệt rệp mạnh trên môi trường lên
men xốp.
1
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về rệp
Rệp là loài côn trùng thân mềm, có kích thước thay đổi từ 1-10 mm, cơ thể màu xanh
lá cây, đen, nâu, hồng hoặc không màu. Rệp có một lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng
màng) hoặc không cánh. Rệp sinh sản bằng hai hình thức: đơn tớnh và hữu tính (là sự kết
hợp giữa các cá thể khác nhau tạo ra trứng để tồn tại qua mùa đông). Một con rệp cái
trong mùa xuân có thể đẻ tới hàng nghìn con cháu. Ví dụ, loài rệp vừng bắp cải
(Brevicoryne brassicae) có thể tạo ra tới 41 thế hệ con cháu. Trong môi trường ấm áp,
như ở vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp có thể sinh sản vô tính tron nhiều năm.
Một số loài sinh ra con cái có cánh trong mùa hè nhằm đáp ứng lượng thức ăn khan hiếm.
Ví dụ, rệp táo (Aphis pami) sau khi sinh ra nhiều con cái không cánh sẽ tồn tại trên cây
chủ, chúng sẽ gia tăng lượng có cánh và bay đến cây cỏ hoặc cây ngô để kí sinh
( />Rệp trên thế giới rất đa dạng về loài. Ước tính trên thế giới có khoảng 4000 loài rệp
đã được miêu tả. Trong số này, có khoảng 250 loài gây hại cho cây trồng (Blackman,
Eastop, 2000). Các loài thuộc họ rệp muội gây hại mạnh trong nông nghiệp, như rệp đào
(Myzus persicae) gây hại trên cải, rệp bông (Aphis gossypi) gây hại trên cây bông, rệp
muội (Phenacoccus solenopsis), rệp muội hại ngô (Aphis maydis)…
Chế độ ăn của các loài rệp là khác nhau, có loài đơn thực (chỉ ăn được một loài thực
vật), có loài đa thực (sử dụng nhiều loài thực vật). Rệp đào (Myzus persicae) có một phổ
vật chủ rộng hơn, bao gồm hơn 100 họ thực vật, có thể gây ra thiệt hại lớn đến mùa màng
(Blackman, Eastop, 1984
Trong số các loài rệp gây hại, những loài thuộc họ rệp mội g ây ảnh hưởn lớn , thường

xuyên đến cây trồng nói chung và cây lương thực nói riêng. Chúng đã gây thiệt hại hàng
tỷ đô la Mỹ mỗi năm do cây cho nng s uất kém hoặc mất mùa. Mặtkhác , thế giới mỗi
năm cũng phải chi nhiều tỷ đô la Mỹ để khống hế rệp m uội phá hại cây trồng. ệp m uội
gây hại bốn mùa, đặc biệt từ mùa xuân đến mùa thu, nhất là vào thởi điểm thời tiết râm
mát, độ ẩm trong không kí
2
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
ao .
Rệp đào thuộc họ rệp muội, chúng là rệp hại đáng kể nhất của cây họ đào và một số
cây lương thực khác như cải, hồ tiu, ớt , chúng hút nhựa cây từ lá cây, chồi non làm giảm
sinh trưởng của cây, làm xoăn lá và gây chết mô tế bào. Rệp đào được tìm thấy trên toàn
thế giới, mặc dù nó ít chịu được khí hậu lạnh và trải qua mùa đng th ông qua giai đoạn
trứng c
nó.
Rệp đào tồn tại dưới 2 hìn thc : l oại hình g
cánh
có cơ thể dạng hình trứng, màu xanh hoặc đỏ hoặc vàng nhạt, dài từ 1,31,9mm , v òi
chích hút màu đen, kéo dài tới đốậu
chn
u ,
râu
đầu 6 đốtmàu đ ống
bụng
màu đen, trên lưng, khoảng giữa 2 ống bụng có một mảnh màu đen hơi nổi to; loại
hình có cánh có chiều dài thân từ 1,6-2 mầu v
ngực
màu nâu đen, bụng màu vàng hoặc xanh, đi khi đỏ , giữa mặt lưng của bụng có một
đốm to mà nâ đen , r âu đầu 6 đố mà đen , v òi chích hút kéo dài đến đốt chậu hângiữa , ố
ng bụng

3
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
( />%20persicae%20%286%29.jpg).
Hình 1.1: Rệp đào Myzus persicae
àu đen.
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, rệp đào có vòng đời thay đổi
đáng kể, phụ thuộc vào thời tiết. Chúng phát triển nhanh chóng, thường là 10-12 ngày
cho một thế hệ hoàn chỉnh, và có thể có khoảng 20 thế hệ trong năm nếu thời tiết thuận
lợi. Rệp cái sinh thế hệ mới sau từ 6 đến 17 ngày, với tuổi sinh sản trung bình là 10,8
ngày. Trung bình rệp sinh 1,6 ấu trùng trong mỗi ngày. Rệp đào có cánh dường như
muốn xâm chiếm hết bề mặt cây. Chúng thường để lại một số ấu trùng nhỏ trên cây và
bay đến chỗ khác. Khả năng phát tán cao này của rệp giúp nó trở thành một trung gian
truyền virus vào( />ựcvt .
1. 2 . Tình hình rệp hại và sử dụng nấm diệt côn trùng trê
thiới
1. 2 .1. Tình hình rệp hại trê
thế giới
Trên thế giới, rệp đang được coi là kẻ thù nguy hiểm đối với cây trồng. Rệp gây hại
tại nhiều quốc gia và không cố định trong một vùng nhất định. Những thiệt hại do rệp gây
ra đang ngày càng nghiêm trọng và diễn ra trên
4
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
ện rộng.
Tại Châu Á, rệp gây thiệt hại nghiêm trọng một số loại cây trồng, đặc biệt là dưa
chuột, hạt tiêu, và cà chua. Các rệp đào Myzus persicae thường phát triển nhanh chóng
trong mùa vụ và phát triển nhanh chóng đến tuổi trưởng thành và tăng nhanh v số lượng .
Ước tính thiệt ại hàng t ỷ đô la Mỹ mỗi năm do nạn rệp hoành hành. Tại ba tỉnh phía
Nam Thái Lan, nạn rầy nâu hại lúa, rệp hại cây trồng đã băng phát mạnh và gây thiệt hại

khoảng 7,5 ngn
mỗi vụ .
Theo nghiên cứu của các nhà côn trùng học Úc, ngành du lịch nước này đã thiệt hại
75 triệu USD/năm do nạn rệp hoành hành. Tình trạng nạn rệp lan tràn ở xứ sở này chỉ là
một phần của đại dịch toàn cầu với số lượng rệp trên thế giới đã tăng lên gấp đôi mỗi
năm. Các nhà côn trùng học cho biết, nguyên nhân là việc thay đổi biện phá(không dùng
thuốc xịt mà dùng mồi)p diệt côn trùng và do sự gia tăng đáng kể lượng du khách đến từ
các nước đang phát triển, nơi rệp vẫn ò
đaghoành hành .
1. 2 .2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn
ùng trênthế giới
Trong h ờ đại gày nay , v ới vi ệc tuốc hóa hc đan g â ảnhhư ởg ấu đ ế s ức k hỏ e co
n gười vàôi tr ờng sốn, c ùng v ới sự ti ếộ của khoaọc v i ệctìm ra m ộtchế pm có tá d ụgk
i ểm soá ơn tr ùn cao, k h ông g ây h ạới sức khỏe conng ư ời là (trong đó có rệp đào)cần
thiết . Rệp muội và bọ cánh trắng là những côn trùng gây hại cây trồng rất nghiệm trọng
trong nhà kính trên toàn thế giới. Chúng gây thiệt hại nặng nề trên nhiều loại cây trồng,
đặc biệt trên các cây như dưa chuột, hồ tiêu, ớ, rau cải và cà chua . Chúng tăng số lượng
rất nhanh và truyền virus từ cây bện
sang cây khỏe mạnh.
Để kiểm soát chúng, nông dân đã áp dụng liều cao của thuốc trừ sâu. Các thuốc trừ
sâu hóa học sử dụng quá mức đã dẫn đến hậu quả là côn trùng kháng thuốc, và để kiểm
soát nông dân phải sử dụng liều cao hơn so với ban đầu. Dư lượng thuốc trừ sâu hóa học
5
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
trong môi trường và sản phẩm nông nghiệp cũng đang được người tiêu dùng rất quan tâm
chú ý, vì họ muốn dựng những sản phẩm nông nghiệp, sạch, an toàn, và không còndư
ượng thuốc trừ sâ u.
Mặt khác, do phải sử dụng liều lượng cao hơn nên lượng hóa chất còn dư trên mặt đất
và ngấm xuống mạch nước ngầm là rấtlớn. Thuốc hóa học là m nhiễm bẩn nghiêm trọng

tới môi trường sống, ản hưởng lớn đến sức kh ỏe của người, gia súc và các loại sinh vật
khác, đặc biệt là các loại động vật sống trong nước như cá, tụm, cua, và các loài thủy sinh
khác. Do đó, rất nhiều nước đang cố gắng làm giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa
học trong nông nghiệp. Hơn nữa, kiểm soát sinh học đang là một phương pháp thay thế
hiệu quả, bao gồm việc dựng(tức là sử dụng tác nhân gây bệnh là nấm để tiêu diệt các
loài côn trùng) ký sinh côn trùng
(Bartlett, Jaronski, 1988a
k, St Leger, 1994)
.
Một số chủng nấm diệt côn trùng mạnh như Beauveria sp., Metarhizium sp.,
Paecilomyces sp., Nomuraea sp., Verticillium sp., đã được sử dụng làm chất trừ sâu sinh
học ở một số nước trên thế giới. Ở các nước như Liên Xô cũ, Mỹ, Anh chi nấm Beauveria
dựng để sản xuất chế phẩm có tên Beauverin, ở Việt Nam có tên thương mại là
Beauveriừ củng Beauveria sp . . B ào tử của nấm M . anisopliae đã được phối chế tạo sản
phẩm có tên gọi thương mại là “BioBlast” được sử dụng để kiểm soát mối,, côn trùng hại
(Rath, 1995)
. Cho đến nay, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng một số chủng nấm thuộc hai loài nấm
Beauveria sp. và Metarhizium sp. có tiềm năng rất mạnh để gây bệnh, diệt côn trùng,
bướm gây hại ở cây trồng trên đồng ruộng. Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng chế
phẩm nấm này dựng để diệt côn trùng trên đồng ruộng thì rất ít. Việc sử dụng bào tử nấm
ký sinh côn trùng để xử lý đất trồng cây, để kiểm soát côn trùng có cány hại đã được đề
cập
6
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
(Dimbi et al.2
3; Vu et al. , 2006)
.
Hiện nay, các nghiên cứu về các chủng nấm Lecanicillium spp. được sử dụng để kiểm
soát côn trùng gây hại cây trồng cũng ã và đang được nhiều nhà kh oa học trên thế giới

nghiên cứu bởi khả năng diệt
n trùng của chúng rất cao.Vi nấm Lecanicillium spp. ký sinh trên nhiề loại côn trùg
bao gồm b ộ cánh đều, b ộ cánhg, cánh thẳng và bướm
(Hall, Burges, 1979; Hall, 1981a, b; Jackson et al. , 1985; Milner, Lutton, 1986;
Johnson et al. , 1988; Gopalakrishnan, 9; Khachatourians, 1992)
. Việc sử dụng bào tử nấm Lecanicillium spp. đã rất được quan tâm để kiểm soát côn
trùng và sâu bệnh hại cây trồng. Bên cạnh đó, giun tròn nang gây hại đậu tương, nấm
mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc cũng có thể được soát bởi
loại nấm này
(Whipps, 1993; Verhaar et al. 996; Meyer et al. , 1997)
. Ngoài ra, nấm Lecanicillium spp. có thể được sử dụng với hỗn hợp của một số
thuốc trừ sâu hay thuốc diệt nấm trong các chương trình điều khiển dịch hại cây trồng
tích hợp để có một hiệu ứng hiệp đồng
(Hall, 1981a; l
. A., 181; Hall, 1983)
.
Hơn nữa , Lecanicillium spp. đã được chứng minh có độc tính rất ạnh đối với một
(Myzus persicae)số loài rệp (Aphis gossypii)m uội như rệp đào , rệp bôvà Macrosiphum
euphorbiae
7
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
(Askary et al. , 1998; Alavo et a, 2001; Km et al. , 2001)
, do đó t ại Anh, Mỹ và một số nước khác đã nghiên cứu và có chế phẩm thương
mạihư Vertalec® từ bào tử nấm L . longsporum diệt các loài rệpmuội, rệp chích hút nhựa
cây . Ngồ i ra, Lecanicillium spp. cũng đã được chứng minh rằng, nó có các hoạt động
chống nấm mốc gây bệnh phấn t trên nhiều loại cây trồng
(Askary et al. , 1998; Dik et al. , 1998; Verhaar et al 1998; Millner et al. , 2004)
, diệt các ký sinh rùng hại cây trồng như sâu , bọ
(Kim et al. , 2005; Lee et a,

06oettel et al. , 2008)
.
1. 3 . Tình hình rệp hại và sử dụn
nấiệt côn trùng tại Việt Nam
1. 3 .
Tình hình rệp hại tại Việt Nam
Theo số liệu thống kê ở Việt Nam nếu mỗi năm côg tác phòng trừ dịch hạ khôngt ốt
thì bị hao hụt từ 3-
0 % s ản lượng nông sản dự trữ.
Theo nghiên cứu và điều tra của các nhà khoa học, nước ta chịu sự tấ công của hơn
250 loài rệp khác nhau . Các loài gây hại thường gặp: rệp đào, rệp bụn,rệp cờ ngơ, rệp
huố lá, rệp cam, rệp đậ, rệp cải . T ại Đồng bằng sông Cửu l ong cây sầu riêng bị sự tấn
công từ rệp sáp, một số cây trồng ăn quả tại Tp. Hồ Cí Minh và vùng phụ cận bị ảnh
hưởng t ừ những loài rệp muội làm mất năng suất và thiệt hại về kinh tế. Cây cà phê tại
một số vùng tại Tây Nguyên cũng đa(huyện Đác Mil hơn 350 ha, huyện Đác Song hơn
8
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
150 ha)ng gặp phải vấn nạn rệp sáp và rệp bông . (Vĩnh Phúc)Ở 3 huyện Trà Ơn, Tam
Bình và Vũng Liêm , diện tích ngô bị nhiễm rệp muội từ 2-7%, như vậy nếu tính trên cả
nước tì
hiệt hại gây bởi rệp mui là rất lớn .
Trong những năm gần đây , thống kê cá loài gây hại cho cây trồng tại nước ta, r ệp
đào đang là mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với sự ra tăng nhanh chóng về diện tích
và số lượng cây trồng bị hại. Chúng có thể gây hại trên 300 loài cây trồng khác nhau,
trong đó thường thấy(cải trắng, cải củ, cải xanh, cải bắp) trên các cy như: các loại rau họ
thập tự mộ số câ y ăn quả như đà, hồng, lê, mận . T rong điều kiện nước ta , rệp đào có
thể xuất hiện và gây hại quanh năm, trong đó tập tung nhiều khi thời tiết dịu mát, độ ẩm
cao . Trong mt năm rệp đào có thể có tới 15-17 vòng đời , phát sinh và(vụ đông xuân)
gây hại nặng v(vụ thu đông)ớ

mậộ cao vào tháng 4-5 và tháng 9-10 .
1. 3 .2. Tình h
h sử dụng nấm dệt côn trùng tại Việt Nam
Tại Việt Nam, t rong những năm gần đây, việc sử dụng biện pháp sinh học hòng
chống sâu hại cây trồng như sử dụng k í sinh, thiên địch, mới được đi sâu nghiên cứutuy
nhiên việc sử dng biện pháp vi nấm k í sinh đối với rệp m uội là một vấn đề đang còn
mới mẻ trong nông nghiệp. Sử dụng nấm kí sinh côn trùng gây hại không ảnh hưởng đến
nguồn nước, môi trường sống, con người và vật nuôi. Việc sử dụng thuốc trừ
u sinh
c có những đặc tính nổi bật sau:
Ưu điểm
- Không tạo nên tính kháng thuố
của sâu hại cây trồng, nếu dựng liều cao.
- Không độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không
ảnh hưởng đến chất lượng nông
n, không tác dụng tiêu cực đến đất trồng.
9
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
- Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp
lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho t
hệ tiếp theo, nên rất tiết kiệm chi phí.
- Không ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên vi
nh vật đất, các loài thiên địch hữu ích.
Nếu sử dụng hợp lý, đúng
thuật sẽ
ng lại hiệu quả kinh tế cao.
Nhược điểm
- Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi
sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể

u thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày.
- Hiệu quả của thuốc ban đầu
hông cao, phổ tác dụng của thuốc còn hẹp.
- Một vài loại thuốc trừ sâu vi sinh bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết như độ ẩm
không khí, gió, ánh nắng mặt trời. Nếu như phun trừ sâu sinh học không đúng kỹ
thuật, phun trong điều ki
không thích hợp sẽ khó đạt hiệu quả cao.
- Khả năng bảo quản các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học không cao nên dẫn tới
khó khăn trong việ bảo quản, lưu thông
phân phối và sử dụng . Giá thuốc còn cao.Tại Việt Nam, quy trình sử dụng vi nấm M.
anisopliae và B. bassiana đã được nghiên cứu khá thành công và được sản xuất th(Viện
lúa ĐBSCL)ành một số chế phẩm. Theo Nguyễn Thị Lộc cho biết việc triển khai sản
xuất bào tử nấm đến hộ nông dân và sử dụng nấm để kiểm soát rầy nâu đã góp phần làm
giảm chi phí và tăng thu nhập cho người trồng lúa. Chế phẩm từ 2 loại nấm này giúp bảo
vệ môi trường và tạo thêm một số mô hình kinh tế mới như trồng lúa kết hợp nuôi tôm.
Sử dụng biện pháp sinh học này giúp việc kiểm soát rầy nâu giảm
b( />chi phío với dựng huốc trừ sâu hóa học .
10
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Vi nấm M . anisoplia e cũng có hiu lực cao đối với rệp sáp giả Dysmi
o
ccus sp . hại na.
Phun nấm với nng độ 9x10 8 bào tử/ ml đã kiể soát được 82 % rệp sáp giả sau 5 ngày xử
lý . Tuy nhiên, hiệu quả trừ rệp sáp giả của nấm M. anisopliae trên cây na ở điều kiện
đồng ruộng ở ngoại ô Tp. Hồ Chí Minh thấp hơn so vớphòng thí nghiệm, nhưngng đạt
56-78%
(Vị Thị Thu Oanh, 2008)
. Chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2B có nguồn gốc từ nấm B. bassiaa ược thử
nghiệm kiểm srầy nâu hạiú a

(Phạm Văn Mạch 1998)
. Các chủng B . thuringiensis được ch ọn lọc ừ tự nhiên ở Việt Nam và nướcngoài
cũng đã đư ợc nghiên cứu tạo chế phẩm, c hế phẩm Bt do Viện Công nghệ sau thu hoạch
sản xuất có hoạt tính diệt sâu cao đối với côn trbộ cánh vảy hại rau quả, nông sảảo
uản
(Nguyễn Thuỳ Châu et al. , 2000)
.
M. anisopliae Ma5 đã được phối trộn với chất phụ gia sinh học tạo thành chế phm
thuốc trừ sâu sinh học có tên i
tazimm 95DP , sản phẩm của công ty Trường An .
Thuốc trừ sâu vi sinh BT do Viện Công nghiệp Thực phẩm (D. punclatus)Hà Nội sản
xuất, có hiệu quả giết sâu róm thông . Thuốc không độc đối với người và gia súcvà không
gây ô nhiễm môi trường,hơn các loạ i thuốc disâu róm thông khác (Đào Xuân Trường,
1992)
. Một chế phẩm khác từ Metarhizium diệt trừ được các loại sâu xanh, bướm trắng,
sâu khoang ăn lá, bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, một số loại côn trùng hại
bồ đề, cây điều, cây ăn quả; sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu khoang hạ
cà chua cho kết quả diệt trừ sâu bệnh hơn 70%
11
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Thuốc trừ sâu vi sinh (Abamectin từ Streptomyces avermitilis)MVP 10FS, Delfin WG
32BIU, Aztron, Tập Kỳ 1,8EC có hiệu lực diệt sâu tơ Plutella xylostella và sâu khoang
Spodoptera litura khá cao, hiệu lực dài. Đặc biệt thuốc Tập kỳ 1,8EC có hiệu lực rất cao
đối với sâu tơ và sâu xanh bướm trắng, thuốc có mùi dễ chịu và dựng với lượng rất nhỏ
trên một ha, cần đưa vào chương trình quản lý dịch hại tổng hợp IPM. Bốn loại thuốc trừ
sâu vi sinh này được xếp loại ưu tiên lựa chọn để phòng trừ sâu tơ và sâu khoang hại rau
họ thập tự bắp cải, súp lơ, su hào và các loại rau cải. Bên cạnh đó Thuốc VBt acterin BT
cũng có hiệu lực di
âu tơ cao

(Nguyễn Văn Sơn et al. , 2001)
Có thể thấy, xu hướng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc là sinh học trên
thế giới vàViệt Nam ngày càng nhiều và càng được quantâm , trong đó c xu hướng sử
dụng nấm kí sinh . Tuy nhiên, ở V iệt Nam chưa có chưa có nghiên cứu nào về khả năngd
t côn trng của chủng nấm Lecanicillium spp .
Trái lại , trên thế giới, chủng nấm này có độc lực cao đi với rệp đào đã được khẳng
định. Chẳng hạn, v i nấm Lecanicillium spp. được phân lập ừ rệ đào có khả năng diệt
100% rệp Aphis goss ypii , hại dưa cà, bông sau 3 đến 5 ngày trong điều in phòng thí
nghiệm và trên 78trong điều ki ệ n nhà kính sau 14 gày. Bào t ử của vi nấm Lecanicillium
spp. cũn g có khả năng diệt 100% rệp đào hại rau cải, rau diếp, ớt sau 4-5 ngày phun
trong điều kiện phòng thí nghiệm, ngà ra bào tử của nấm này có khả ndiệt được m ộ t sốn
rùgvà rệp cây khác
(Vu et al. , 2007)
.
1. 4 . Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp
Đối với việc kiểm soát sinh học bằng tuốc diệt côn trùng sinh học cần ột lượng lớn
bào tử . Trong những năm gần đây, các n ghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm kí sinh diệt
12
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
côn trùng đã chứng minh rằng số lượng và chất lượng của bào tử phụ thuộc vào nhiều
yếu tố, chẳng hạn như phân lập, chất dinh dưỡng, mật độ và điều kiện môi trường. Sự
thành công của kiểm soát rệp bằng biện pháp sinh học không chỉ phụ thuộc vào đặc điểm,
cách ly và gây bệnh mà còn phụ thuộc vào nồng độ bào tử của chủng nấm. Việc nâng cao
lượng bào tử nấm kí sinh diệt côn trùng với mong muốn giảm lượng nấm trong sử dụng
để kiểm soát rệp. Phát triển và tối ưu điều kiện lên men để sả xuất bào tửcho số lượng lớn
tronời gian ngắn bằ ng lên l ỏnghoặc lên men rắn
(Roussos et al. , 1993)
. Cả h ai hệ thống lên men xốp và lên men lỏng đã được sử dụng để sản xuất hàng
loạt các chất bảo vệ cây trồng có nguồn gốc từ vi sinh vật. Tuy nhiên, lên men trạng txốp

cho phép sản xuất bào cứn và khỏe mạnh hơn
(Bartlett, Jaronski, 1988)
. C ách khả thi nhất là nuôi nấm trong môi trường lỏng sau đ(Burges và Hussey,
1981)ó
út dịch có bào tử sang nuôi cấy trong môi trường rắn .
Một trong những quan tâm quan trọng nhất trong việc thiết kế một quy trình sản xuất
hàng loạt bào tử là khả năng tương thích của sản phẩm với chất phụ gia sinh học trong
quá trình phối chế trước khi phun và quy trình phun sản phẩm trên đồng ruộng. Ví dụ,
việc sử dụng các công thức dầu cho việc phối chế tạo chế phẩm siêu nhũ để phun ngoài
đồng ruộng, thì bào tử được sản xuất từ lên men xốp là thích hợp, vì bào từ được tạo ra là
dạng kị nước nên dễ tạo độ nhất trong dầu hơn là bào tử tạo ra từ lên men l
(Bartlett, aronski, 1988; Jenkins, Thomas, 1996)
. Tuy nhiên lên m en lỏng có thể áp dụng cho việc phối chế sau này không dùng dầu.
Bào tử trần được sản xuất trong quá trình lên men lỏng, ưa nước và hoạt tính của bào tử
mất khá nhanh, khả năống sót giảm tương đối nhanh ng
13
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
hi gian bảo quản
(Kleespies, Zimmermann, 1992)
.
G ần đây, nhu cầu hệ thống lên xốp tăng, đã mở ra cơ hội cho ngành công nghiệp
trong việc nghiên cứu, thiết kế, sản xuất thiết bị đặc biệt này, hệ thống lên men xốp hiếu
khí được gắn với các thiết bị điều khiển tự động cơ bản giống với lên men lỏng. Điều này
làm giảm chi phí lao động và cho phép kiểm soát chặt chẽ và tiêu chuẩn hoá của quá trình
sản xuất. Tuy nhiên, ở các nước nghèo, hoặc đang phát triển, nơi lao động tương đối rẻ,
kinh tế còn nhiều khó khăn, do đó nó có thể cản trở sự phát triển thống lên men xốp tự
động này
(Roussos et al. , 1993)
. Vì vậy, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tền trong lên men xốp sẽ giúp các

nước này giảm thiểu chi phí . Trên thế giới, có rất nhiều nhà sản xuất bào ấm diệt côn
trùng gây i, đặc biệt là âu Mỹ La tinh
(es, Pereira, 1989)
và Trung Quốc
(Feng et al. , 1994)
, họ có thể cung cấp đủ số lượng sản phẩm cho thị trường trong nước ngay lập tức.
Hệ thống sản xuất bào tử bằng lên xốp ở đây khá đơn giản như dựng khay, bình nhựa, túi
và thường cần nhiều lao động phổ thông, vì ở các quốc gia này chi phí lao động khá thấp
và thị trường của sản phẩm tương đối nhỏ nên qui mô sản xuất bằng cách này có
ể đáp ứng nhu cầu và giải quyết việc làm cho người lao động.
Lên men xốp được coi là hệ thống thích hợp cho sản xuất hàng loạt bào tử nấm để
sửdụng trong việc tạo chế phẩm siêu nhũ khi phun trên đồng ruộng . Lên men xốp cũng
có lợi thế bổ sung khi so sánh với quá trình lên men lỏng như: thao tác đơn giản, đòi hỏi
14
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
vốn đầu tư thấp, có năng suất cao, tiết kiệm năng lượng, các thông số quá trình lên men
không bị yêu cầu quá nghiêm ngặt, sử dụng ít nước và nước thải thải ra môi trường rất ít,
dễ dàng kiểm soát nhiễm khuẩn, máy móc vật t giá thành rẻ hơn, chi phí thấp cho quá
trình thu hồi sản phẩm
(d
A., 1994; Feng KC, Liu BL and Tzeng YM., 2000; uim, 2008)
.
Việc sản xuất bào tử trần chủng Lecanicillium sp p . , một loại nấm độc lực cao, bằng
lên men xốp đã được sử dụng như một chất kiểm soát sinh học. Trong số nhiều môi
trường xốp từ sản phẩm công nông nghiệp thì gạo hấp tạo ra lượng bào tử cao nhất. Các
điều kiện tối ưu cho sản xuất bào tử nấm trần được xác định là : 28,5% độ ẩm trong gạo,
nhiệt độ nuôi cấy là 25°C, pH gạo bằng 6, độ ẩm x
n
quanh là 75%, nấm nuôi cấy trên môi

trường lỏng 4
g
y 0,6 KNO 3 , thời
g
ian ủ là 12 ngày. Bào tử nấm tăn từ 5,7x10 9 / g lên
18,2x10 9 bào /
15
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
in đã tối ưu
(Vu et al. , 2008)
.
C hư
g 2: VẬT LIỆU V PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
21 Chủn nấm
Các chủng nấm L e85, 8514 L43, 85K 1014 và 1 305 thuộ c b chủng của Phòn Công
nghệ Sinh họcE nzyme,Viện C ông nghệ S inh học, Viện K hoa học và C ông ngh ệ Việt
N am. Các chủng này được phân lập từ ác mẫu đấ, á (1037, 1039)cây, côn trùng chết từ
các vùng địa lí khác nhau . Chủng V TC C được cung cấpbởi Bảo tàng chủng v
nh vtgốc, Viện v
sinh và Công nghệ S inh học, ĐHQG Hà nội .
2.1. 2 . Hóa chấ(Bảng 2.2)t
Bảng 2.2. Hóa chất chính dùng trong thí nghiệm
Tên hóa chất
Hãng sản xuất
Agar
Việt Nam
Agarose
Bio Basic Inc (Mỹ)

Boric acid Bio Basic Inc (Mỹ)
16
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Peptone Bio Basic Inc (Mỹ)
Tween 20 BioBasic Inc (Mỹ)
Tween 80 BioBasic Inc (Mỹ)
Yeast extract (cao nấm men) Bio Basic Inc (Mỹ)
Calciumchloride Dihydrate Merck (Đức)
Natrium dihydrogenphosphate dihydrate Merck (Đức)
Natriumacetate-trihydrate Merck (Đức)
Ammonium chloride China
Ammonium nitrate China
Kali chloride China
Maganesium sulfate heptahydrate China
Triton X-100 Sigma (Mỹ)
Các hóa chất sử dụng t
ng thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết .
2.1.3. Dung dịch và đệm
Các dun dịch hóa chất và đệm sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở b ảng 2.3.
Thành phần hóa chất, nồng độ, cáh ph
Bảng 2.3. Các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Nồng độ, chất hóa học
Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8
Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS
Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic
protease K 20 μg/ml protease K
RNase 10 μg/ml Rnase
Amp gốc 100 mg/ml ampicillin
Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide

Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8
Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) Xylene
xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
17
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Dung dịch isopropanol 99%
Chloroform:isoamylalcohol 24:1
ợc thực hiện theo
ướng dẫn của các b(PD)ài bá đã được cơn g bố .
2.1.4. Môi trường
(w/v)
Potatoes de(w/v)xtrose lỏng : 20% dịch chiết khoai tây, 2% glucos(w/v)e
0,6% KNO3 . PD(LB) rắn, môi t(w/v)ruờng PD lỏng đ(w/v)ược bổ sung 2%
ag(w/v)ar .
Luria-Bertani lỏng : 1% peptone, 0,5% cao nấm men, 1%(w/v) NaCl, pH 7,5. LB
rắn, môi trường LB lỏng được bổ sung 2% agar . Đối với việc chọn ch
g mang plasmid, môi trường được bổ sung 100 µg ampicillin/ml.
Tất cả các môi trường lỏng,
ặ
dùng cho nuôi ấ
vi sn đều được khử trùng ở
hử trùg 121 o C trong 15 phút .
2.1. 5 . Thiết bị thí nghiệm
Các t
Bảng 2.1. Các thiết bị dùng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt Trung Quốc
Box cấy LB-1234 Việt Nam

Cân phân tích BL 150S Sartorius (Thụy Sĩ)
Hệ thống chụp ảnh gel Wealtec (Mỹ)
Hệ thống điện di ngang
Mupid α (Nhật Bản)
Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)
Máy PCR Eppendorf (Đức)
Máy chuẩn pH 827 pH Lab Metrohm (Thụy Sĩ)
Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)
18
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4°C, -20°C, -84°C
Toshiba, Sanyo (Nhật Bản)
Kính hiển vi Trung quốc
Máy li tâm lớn Hitachi
iết bị chính sử
ng trong thí nghiệ được liệt kê ở bảng 2.1.
2.2.P
ơng pháp
2.2.1. Sàng lọc ch ủng nấm có khả năng diệt rệp đà o
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA, sau 7 ngày tiến hành thu bào tử bằng
dung dịch 0,05% Tween 80 để tách bào tử ra khỏi sợi ấm. Rệp đào ở giai đoạn 2-3 ngày
tuổ được
u
ôi trên lá cảhả
o
đặt vào tron hp ích thước 30x20 x20 cm 3 duy t(3x10
8

/ml)rì ở
23 - 27 o C và độ ẩm 8 0- 85 %. 15 ml dung dịch bào tử nấm pha trong 0,05% Tween 80,
được phun dạng sương lên lá cải đã có 25con rệp, với khoảng cách từ rệp đến miệng vùi
phun khoảng 25 đế n 30 cm. Lô đối chứng chỉ phun 15 ml dung dịch 0,05% Tween 80.
Lá cải có rệp sau khi được phun (quan sát trong 7 ngày)đặt vào trong hộp. Hàng ngày
theo dõi số lượng
p hếtbởi nấm, làm cơ sở đánh giá khả nă
diệt rệp của nấm.
2.
.2 . Các p hương pháp sinh học phân tử
Tách chiết DNA°tổng số
Chủng nấm 8514 được nuôi cấy trong môi trường PDB ở 25 C, lắc 200 vòng/phút
trong 5 ngày. Dịch nuôi được li tâm ở 6000 vòg/phút trong 5 phút, ở 4°C. Bỏ dịch, thu
thể sợi rồi nghiền nh anh trong nit ơ lỏng, bổ sung 600 µl đệm phá tế bào, lắc nhẹ và
thêm 65 l dung dịch lysozyme, ủ ở 37°C trong 30 phút. Sau đó hỗn hợp đư ợc bổ sung 5
µl (24:1)protease K ủ 2 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol với tỷ lệ 1:1
và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên được thu sang
19
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa thu được
sau khi ly tâm 12000 vòng/phút, ở 4°C trong 15 phút được làm khô dưới ánh sáng đèn và
bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm ở
12000 vòng/phút trong 10 phút, được làm khô và hòa tro40
l đệm TE và bả
quản ở -20°C
(Sandgren et al. , 2003)
.
Khuếch đại PCR
Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mỹ

Kar(PCR)ry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm vào năm
1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu
của 2 mồi oligonucleotide gắ
vào 2 sợi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.(5'-GCA TAT
CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')Để khuếc(5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-
3')h đại đoạn gene
8S rRNA từ chủng nấm 8514 cặp mồi NL1 và NL4 được sử dụng.
Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp ph
n
ứng PCR gồm:1 µl mồ
mỗi loại; 2 l dNTP; 2,5 µl 25 mM MgCl 2 ;
2
5 µl đệm 10x PCR ; 0,35 µl Taq ; 1
khuôn DNA và bổ ung H 2 O cất tiêm đến tổnhể tch(95°C/1’; 52°C/1’; 72°C/1’) 25
µl.
hn
20
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
ng được thự c hiện ở điều kiện: 9

Hình 1.2. Vector nhân dòng pJET1/blunt.
C/5 ’ , 35 x ; 72°C/10 ’ .
Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2
Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 được thực hiện theo
chỉ dẫn của Fermentas. Hỗn hợp gồm 5 µệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme
blunting; 2,5 µl H 2 O và hỗn hợp
ư
ợc ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và
0,5

l T 4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C
ạo plasmid tái tổ hợp.
Biến nạp plasmid vào tế bào hả biến
Plasmid được biến np
o tế bào khả biến E. coli D 5α theo phương pháp sốc nhiệt .
Chuẩn bị tế bào khả biến: K huẩn lạc E. coli được cấy chuyển vào 3 ml môi trường
LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. 100 ml môi trường LB được tiếp giống với 1
ml
dịch t
ế bào qua đê(khoảng 2-3 giờ nuôi cấy)m, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi
OD 600nm đạt 0,4-0,6 , dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở
4°C với 6000 vòng/p
ú
t. Tủa tế bào được hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl 2
lạnh và vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tânhư trên. Tủa tế bào lại được hòa đều trong 40 ml
21