luận văn công nghệ sinh học So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác định hàm lượng vitamin B1 trong gạo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN
ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B
1
TRONG GẠO
Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo
DS. Trần Cao Sơn
Sinh viên thực hiện: Lê Thị Khánh Loan
Lớp: CNSH 06-04
Hà Nội 2010
LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành khó luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Lê Thị Hồng Hảo -Viện phó Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn
Thực Phẩm Quốc Ga , DS. Trần Cao Sơnv à KS. Lê Thị Thý , h ững g ười
đã r ực i ếph ướngd n , i úp đỡtĩ i. Đồng h i ,tơ i xin hõ n h ànhc ảmơ n banl
ãnh đạo i ện i ểm Ngi ệmV ệ Sinh An o àn h ực h ẩm u ốc Giac ùng o àn h ểc
ác anh h ịc ánb ộ iâ n trong i ện đã i úp đỡv àt ạođi ều i ện chotơ i trong u á r
ình ngiâ nc ứuv à h ực i ện ko á u ậnn y
Tĩi cũng xin chõn thành cảm ơn các thầy cụ, cán bộ cuả khoa Cụng
Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo, tạo điều kiện
tốt cho tĩi học tập, tạo cơ hội cho tĩi đi thực tập và làm khoá luận tốt nghiệp.
Cuối cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bố đã động viân,giúp đỡ tĩi trong
thời gian qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2010
Sinh viân

Lờ Thị Khánh Loan
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOAC (Association Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hoá học
phân tích
ACN: Acetonitril
DDT: Dichlor-Diphenyl-Trichloroethane
HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
MeOH: Methanol
NXB: Nhà xuất bản
PDA: Photo Diode Array
ppm (part per million): nồng độ phần triệu
STT: Số thứ tự
TTHD: Trung tâm hoạt động
UV-VIS: Ultra Violet-Visible: Tử ngoại khả biến
VTM B
1
: Vitamin B
1
DANH MỤC BẢNG
Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B1 trong một số thực phẩm [23] 7
Bảng 3.1.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động 35
Bảng 3.1.3: Khảo sát tốc độ pha động 36
Bảng 3.1.4: Các điều kiện chạy HPLC phân tích hàm lượng vitamin B1
trong gạo 37
Bảng 3.2.5: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tới quá trình chiết
vitamin B1 trong gạo 38
Bảng 3.2.6: Ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồi 39
Bảng 3.2.7: Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ vitamin B1 41
Bảng 3.3.8: Kết quả độ lặp lại của phương pháp 44

Bảng 3.3.9. Hiệu suất thu hồi của vitamin B1 ở các nồng độ khác nhau. 45
Bảng 3.3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 46
DANH MỤC HÌN
Hình 2.3.3: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC 27
Hình 3.1.4: Sắc đồ Vitamin B1 sử dụng cột Symmestry Water C18 34
(250mm × 4,6mm × 5µm) 34
Hình 3.1.5: Sắc đồ chạy chuẩn 0,50 ppm tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút 37
Hình 3.3.6: Sắc đồ chạy chuẩn vitamin B1 0,025ppm 43
Hình 3.4.8: Sắc đồ chạy mẫu gạo RN64 47
Hình3.4.9: Sắc đồ chạy mẫu gạo Nàng Xuân 48
Hình3.4.10: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Ốc 48
Hình 3.4.11: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tám 48
Hình 3.4.12: Sắc đồ chạy mẫu gạo tẻ thường 49
Hình3.4.13: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp nương Điện Biên 49
Hình3.4.14: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tài Nguyên 49
Hình 3.4.15: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Cái Hoa Vàng 50
Hình 3.4.16: Sắc đồ chạy mẫu gạo lứt 50
Hình 3. : Sắc đồ chạy chuẩn vitamin ại ồng độ 0, pp 57
Hình 4. : Sắc đồ chạy mẫu dựng Clara –diastase 5 59
Hình 4. : Sắc đồ chạy mẫu dựng Clara –diastase 10 60
ình 4.5: ắc đồ c ạy ẫu ùng C a a- ia tase15 60
Hình 5. : Sắc đồ chạy mẫu với enzyme α-amylas 60
Hình 5. : Sắc đồ chạy mẫu với Taka diastase 61
ìn 5.4: ắc đồ ẫu ùng Taka ia tase t m 34,6µg ch ẩ 61
MỤC LỤ
MỞ ĐẦU 1
PHẦN I 3
TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu chung về vitamin [5], [11] 3
1.1.1. Định nghiã[11] 3

1.1.2. Phân loại 3
1.1.3. Vai trò của vitamin 3
1. 2. Vài nét về vitamin B1 [5], [11] 4
1.2.1. Lịch sử 4
1.2.2. Cấu tạo và tính chất 4
1.2.3. Vai trò của vitamin B1 đối với sức khoẻ con người 6
1.2.4. Nhu cầu [5] 7
1.2.5. Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B1 7
1.3. Tổng quan về enzyme 8
1.3.1. Khái niệm 8
1.3.2. Vai trò[5] 8
1.3.3. Cấu tạo hoá học của enzyme[5],[26] 8
1.3.4. Cơ chế hoạt động[5] 10
1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính của enzyme 11
1.3.6. Đặc tính một số enzyme được sử dụng 13
1.4. Các phương pháp xác định thiamin 15
1.4.1. Định lượng thiamin bằng phương pháp khối lượng 16
1.4.2. Phương pháp sinh vật học và vi trùng học [12] 16
1.4.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế 17
1.4.4. Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao 17
1.4.5. Phương pháp phổ huỳnh quang [3,12] 18
1.4.6. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 19
PHẦN II 21
ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP 21
NGHIÊN CỨU 21
2.1. Đối tượng, thiết bị, hóa chất 22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 22
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc thử 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 24
2.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp xác định vitamin B1 trong gạo 25

2.2.2. Đánh giỏ phương pháp đã xây dựng 25
2.2.3. Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B1 trong một số loại gạo 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu 25
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 25
2.3.2. Phương pháp phân tích vitamin B1 25
2.3.3. Phương pháp xử lý kết quả 32
PHẦN III 33
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vitamin B1 bằng HPLC 33
3.1.1. Lựa chọn detector và bước sóng phát hiện 33
3.1.2. Lựa chọn cột tách 33
3.1.3. Lựa chọn pha động 34
3.1.4. Khảo sát tốc độ dòng 36
3.2. So sánh một số enzyme thủy phân để tối ưu hoá quy trình xử lý mẫu 38
3.2.1. Khảo sát hàm lượng enzyme tối ưu cho quá trình xử lý mẫu 38
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồi 39
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích 40
3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 41
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) 43
3.3.3. Giới hạn định lượng (LOQ) 44
3.3.4. Xác định độ lặp lại 44
3.3.5. Xác định độ thu hồi 45
3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 45
PHẦN IV 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
4.1. Kết luận 51
4.2. Đề nghị 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PỤ Ụ 56
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh.
Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loại thực
phẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu và vitamin
tan trong nước. Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượng nhưng chúng
rất cần thiết cho các hoạt động sống của con người. Trong các loại vitamin thì
vitamin B
1
(thiamin) giữ vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể.
Thiamin có mặt trong nhiều loại thực phẩm, trong đó các loại ngũ cốc mà đặc
biệt là gạo có hàm lượng thiamin cao. Gạo là loại lương thực không thể thiếu
đối với cuộc sống hàng ngày của mỗi người, nhất là ở Việt Nam.
Xác định hàm lượng vitamin B
1
chính là một trong các yêu cầu kiểm
nghiệm về hoá sinh của gạo. Để xác định hàm lượng vitamin B
1
trong thực
phẩm có hàm lượng tinh bột cao như gạo thì quá trình phân tích thường phải
sử dụng enzyme, vì các enzyme có khả năng phá vỡ liên kết polysaccarid tạo
dịch đường hồ tan, và phá vỡ liên kiết giữa vitamin B
1
và protein. Bên cạnh
đó, các enzyme còn xúc tác phản ứng dephosphoryl để tách dạng thiamin
phosphate ester thành thiamin tự do[22],[27]. Điều này là quan trọng do trong
thực phẩm vitamin B
1
tồn tại ở dạng tự do (thiamin) B
1
, dạng phosphate ester,

hơn nữa chúng còn có sự ràng buộc với protein. Sau đó, thiamin tự do được
oxy hóa thành thiochrom và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao HPLC sử dụng detectơ huỳnh quang RF.
Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng vitamin
B
1
trong ngũ cốc nói chung và gạo nói riêng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài: “So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác
định hàm lượng vitamin B
1
trong gạo” với các mục tiêu:
- Khảo sát điều kiện chạy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích
vitamin B
1
.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
1
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
- So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để khảo sát quá trình
tách chiết vitamin B
1
trong gạo.
- Đánh giá phương pháp xác định hàm lượng vitamin B
1
.
- Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng vitamin B
1
trong một số
loại gạo trên thị trường Hà Nội.

Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
2
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
PHẦN I
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về vitamin [5], [11]
1.1.1. Định nghiã[11]
Vitamin là những hợp chất hữu cơ, được cung cấp cho cơ thể với số
lượng nhỏ từ thức ăn, là những chất không thể thiếu được với cơ thể người
cũng như động vật để tạo ra các coenzyme cần thiết cho phản ứng chuyển hóa
khác nhau.
1.1.2. Phân loại
Dựa vào độ tan của vitamin, người ta chia thành 2 nhóm:
- Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C
- Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E,
vitamin K
1.1.3. Vai trò của vitamin
Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất xảy ra trong cơ
thể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin. Các động vật cũng như con
người không có khả năng tự tổng hợp được các vitamin bằng quá trình đồng
hóa. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là thức ăn. Do vậy, cơ thể có thể thừa
hay thiếu vitamin. Khi cơ thể bị thiếu hay không có một vitamin nào đó thì sẽ
mắc một số bệnh như quáng gà, còi xương, viêm đa dây thần kinh… Ngược
lại khi thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đào thải ra
ngoài.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
3
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội

1. 2. Vài nét về vitamin B
1
[5], [11]
1.2.1. Lịch sử
Năm 1911, nhà bác học Casimir Funk đã phân lập được từ cám gạo một
yếu tố có hoạt tính và cho rằng nó là một loại yếu tố mới trong thực phẩm,
yếu tố này cú tác dụng điều trị bệnh viâm nhiều dây thần kinh. Ông đặt tên là
vitamine sau rút gọn thành vitamin và cuối cùng gọi là vitamin B
1
. Năm 1926,
hợp chất này đã được phân lập dưới dạng kết tinh bởi Jansen và Donath, và
cấu trúc hoá học của nó được xác định bởi Willians vào năm 1936. Hội đồng
dược và hoá học chấp nhận tên gọi thiamin đối với chất kết tinh vitamin B
1
.
1.2.2. Cấu tạo và tính chất
1.2.2.1. Cấu tạo
Gồm 1 vòng pyrimidin và nhóm thiazol nối với nhau qua cầu nối
metylen
Công thức hoá học:
C
12

1
7
4

Tân khoa hoc: 3-[(4- amio-2- methyl-5- pyrimdinyl) methyl]-5-(2-
hydroxyethyl)-4 - methyl thiazol.
Tên gọi khác: Thiamin.

Biệt dược: Betaxin, Bewon, Biamin, aneurin….
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
4
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Thông thường nó tồn tại ở dạng muối như:
- Thiamin hydroclorid ( C
12
H
17
ClN
4
OS.HCl)
- Thiamin hydrobromid (C12H17BrN4OS.HBr)
- Thiamin nitrat (C
12
H
17
N
5
O
4
S)
1.2.2.2. Tính chất
 Điểm nóng chảy: 246-250
0
c cho đến khi phá huỷ
 Độ hồ tan : 100g trong 1000ml nước, hay1g trong 100ml etanol 96%
không tan trong hexan, ête, axeton.
 Vitamin B

1
tồn tại dưới dạng tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước,
khó tan trong ethanol 960 và methanol, không tan trong clorofom và
ether. rất nhạy cảm với nhiệt và bị phân huỷ phần lớn khi làm chín,
hoặc xử lý trong lò vi sóng. ngược lại, sự đông lạnh không làm thay đổi
hàm lượng của nó. Vitamin B
1
có mùi đặc biệt của men. Nỉ dễ hút ẩm
và ở trạng thái khô thì vững bền. Trái lại trong dung dịch, nó dễ bị oxy
hoá và dễ bị phá huỷ.
 Độ bền của thiamin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, lực ion và các phần tử
phản ứng khác. Thiamin trong môi trường trung tính và đặc biệt trong
môi trường acid tương đối vững bền. Trong môi trường kiềm, thiamin
rất dễ bị phá huỷ, đặc biệt là khi có tác dụng của nhiệt độ.
 Do có tính bazơ nên vitamin B
1
tạo tủa với một số thuốc thử chung của
Alkaloid: tạo tủa với Hg
2
Cl, với I
2
, tanin, thuốc thử Mayer. Đặc biệt,
với acid silicovolframic tạo tủa có thành phần xác định nên ngoài việc
dựng thuốc thử này để định tính, người ta còn dựng nó để định lượng
thiamin.
 Trong môi trường kiềm, vitamin B
1
tác dụng với kali fericyanid tạo
thiocrom màu vàng và có huỳnh quang màu xanh da trời.
 Vitamin B

1
được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
5
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.2.3. Vai trò của vitamin B
1
đối với sức khoẻ con người
 Thiamin pyrophosphate là dạng thiamin liên kết với H
3
PO
4
và có vai
trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cơ thể. Thiamin
pyrophosphate là coenzyme của các enzyme piruvat-decacboxylase
hoặc a-cetoglutarat-decacboxylase. Tức là dưới dạng thiamin
pyrophosphate, vitamin B
1
tham gia vào hệ enzyme decacboxyl, để oxy
hoá các acid ceto như acid pyruvic hoặc a-cetoglutaric. Là 2 sản phẩm
trung gian của quá trình phân giải glucid. Chính vì vậy khi thiếu
vitamin B
1
thì sự trao đổi glucid sẽ gặp khó khăn[5]. Khi thiếu vitamin
B
1
sự chuyển hoá các ceto acid bị ngừng trệ làm cho cơ thể tích luỹ một
lượng lớn các ceto acid dẫn đến rối loạn trao đổi chất và gây nên các
trạng thái bệnh lý nguy hiểm[11], [33].

 Thiamin pyrophosphate còn tham gia thành phần coenzyme của
trancetolaza trong chuyển hoá pentoza. Vitamin B
1
cần cho quá trình
tổng hợp acid ribonucleic (RNA), acid deoxyribonucleic (DNA) là
những acid liên quan đến quá trình di truyền[34]. Vitamin B
1
cũng cần
cho quá trình tổng hợp nicotinamid adenin dinucleotid photphat khử
(NADP) cần cho tổng hợp acid béo mà các acid béo không no lại có rất
nhiều vai trò trong cơ thể (là thành phần của nhiều hợp chất có hoạt
tính sinh học cao như lipoprotein; là yếu tố cần thiết của màng tế bào,
các tổ chức liên kết, tổ chức thần kinh ).
 Ngoài ra, vitamin B
1
cùng với acid pantothenic còn tham gia tạo nên
chất acetylcholin là chất giữ vai trò quan trọng trong việc truyền xung
động thần kinh. Chính vì vậy mà khi thiếu vitamin B
1
, ở hệ thần kinh
nơi xảy ra trao đổi mạnh glucid, sẽ bị ảnh hưởng nhiều hơn cả[5].
 Khi thiếu B
1
có thể phát sinh bệnh beri-beri, còn gọi là bệnh tờ phù, do
quá trình trao đổi chất bị rối loạn[11].
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
6
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.2.4. Nhu cầu [5]

Nhu cầu vitamin B
1
phụ thuộc vào điều kiện nghề nghiệp, vào trạng
thái sinh lý của cơ thể, vào lứa tuối. Trung bình người lớn cần từ 1-3mg, trẻ
em 0.5-2mg trong 24 giờ. Người và động vật không tổng hợp được B
1
mà
phải nhận từ nguồn thức ăn.
1.2.5. Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B
1

Vitamin B
1
là loại vitamin rất phổ biến trong thiên nhiên, đặc biệt trong
nấm men, cám gạo, mầm lúa mỡ, ngơ, gan, thận, tim, não [5],[11]. Trong
thực phẩm vitamin B
1
tồn tại ở dạng tự do, và dạng phosphate ester, như là
thiamin monophosphate (TMP), thiamin diphosphate (TDP), và thiamin
triphosphate (TTP), một phần vitamin B
1
còn có sự liên kết với protein. [18],
[24],[27]
Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B
1
trong một số thực phẩm [23]
Thực phẩm Hàm lượng Vitamin B
1
(mg/100g)
Gạo đồ 0,19

Gạo nếp cái 0,13
Gạo tẻ máy 0,10
Thịt gà 0,15
Cải xong 0,07
Dưa hấu 0,03
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
7
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.3. Tổng quan về enzyme
1.3.1. Khái niệm
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hồ tan trong nước
và trong dung dịch muối lỏng. Enzyme có phân tử lượng lớn từ 20.000-
1.000.000 dalton [2].
1.3.2. Vai trò[5]
Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết các
phản ứng có xúc tác enzyme xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 -1011 lần so
với phản ứng không có chất xúc tác.
Tất cả các enzyme đều có nguồn gốc tự nhiên, không độc điều này có ý
nghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và y học
1.3.3. Cấu tạo hoá học của enzyme[5],[26]
1.3.3.1. Bản chất protein của enzyme
Bản chất hoá học của enzyme là protein. Enzyme được cấu tạo từ các L- α-
axitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Enzyme chia ra làm hai dạng
cấu tạo:
- Enzyme một cấu tử (là một protein đơn giản) như pepsin, amylase
- Enzyme hai cấu tử (là một protein phức tạp, trong phân tử còn có nhóm
không phải protein)
Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:
 Apoenzyme: phần protein (làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme,

quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme).
 Nhóm ngoại “agon”: phần không phải protein ( quyết định kiểu phản
ứng, trực tiếp tham gia vào phản ứng mà enzyme xúc tác). Khi nhóm
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
8
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
ngoại tách khỏi phần apoenzyme và có thể tồn tại độc lập, thì những
agon đó có tên gọi riêng là coenzyme.
1.3.3.2. Trung tâm hoạt động (TTHĐ)[5]
Trong quá trình xúc tác của enzyme chỉ có một phần tham gia trực tiếp vào
phản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động". Cấu tạo đặc
biệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác của
enzyme.
 Trong enzyme 1 cấu tử, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ
hợp các nhóm định chức của axitamin không tham gia tạo thành trục
chính của sợi polypeptid. Ví dụ, nhóm -SH của cysteine - OH của
serine, vòng imidazol của histidine, -COOH của aspartie và acid
glutamic Các nhóm này thường phân bố trên những phần khác nhau
của mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thành
trung tâm hoạt động.
 Trong enzyme hai cấu tử, ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chức
kết hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức coenzyme
và các nhóm ngoại khác kết hợp tạo thành trung tâm hoạt động
 Ở enzyme chứa kim loại, các ion kim loại cũng tham gia vào việc tạo
trung tâm hoạt động
 Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệt
hai nhóm: "tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của
enzyme) và "miền tiếp xúc" (giúp enzyme kết hợp đặc hiệu với cơ chất)
 Một enzyme có trung tâm hoạt động tồn tại dưới dạng chưa được hoạt

hoá gọi là zimogen hoặc proenzyme.
Theo Emil- Fischer (1890) thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có
cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất, cũng giống
như tương ứng giữa ổ khó và chìa khó.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
9
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Tuy nhiên đã có nhiều dẫn liệu thực nghiệm chứng minh cấu trúc không
gian của enzyme cũng như protein không cứng mà mềm dẻo, linh động. Theo
quan niệm hiện nay, khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm chức ở phần
trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí không gian tạo thành
hình thể khớp với hình thể của cơ chất, vì vậy gọi là sự “khớp cảm ứng”.Giữa
cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ
dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và các sản
phẩm phản ứng.
1.3.4. Cơ chế hoạt động[5]
Enzyme tác dụng trong điều kiện ”êm dịu” nhiệt độ tối ưu 30- 50
o
C, pH
trung tính và áp suất thường. Điều này quan trọng trong công nghiệp thực
phẩm.
Các cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức hợp enzyme - cơ
chất (ES) E + S → ES → E + P
S: cơ chất
P: sản phẩm
 Yêu cầu: E và S phải bổ sung về mặt không gian và hợp nhau về mặt
hóa học, có khả năng hình thành nhiều liên kết yếu với nhau. Chúng
liên kết sao cho có thể tạo ra và cắt đứt sự dính nhau được gây nên do
biến động nhiệt ngẫu nhiên ở nhiệt độ thường.

 Trong một số enzyme còn có "trung tâm dị không gian" những phần
enzyme khi kết hợp với các chất có phân tử nhỏ nào đó sẽ làm biến đổi
cấu trúc bậc ba của toàn bộ phân tử enzyme làm cấu trúc trung tâm hoạt
động thay đổi → biển đổi hoạt tính của enzyme.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
10
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính của enzyme
1.3.5.1. Nhiệt độ[5]
Tốc độ của phản ứng enzyme chịu ảnh hưởng của nhiệt độ. Mỗi
enzyme có một nhiệt độ tối ưu (tại nhiệt độ này enzyme có hoạt tính cao
nhất). Ví dụ: đa số các enzyme ở tế bào của cơ thể người hoạt động tối ưu ở
khoảng nhiệt độ 35-40
o
C, nhưng enzyme của vi khuẩn suối nước nóng lại hoạt
động tốt nhất ở 70
0
C hoặc cao hơn [30]. Khi chưa đạt đến nhiệt độ tối ưu của
enzyme thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ phản ứng enzyme. Tuy
nhiên, khi đã qua nhiệt độ tối ưu của enzyme thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm
giảm tốc độ phản ứng và có thể enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính.
.
Hình 1.3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tác
1.3.5.2. pH[5]
Tất cả enzyme đều nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Có
một vùng pH mà hoạt độ của enzyme là cực đại. Mỗi enzyme có pH tối ưu
riêng. Đa số enzyme có pH tối ưu từ 4 đến 7. Có enzyme hoạt động tối ưu
trong môi trường acid như pepsin (enzyme có trong dạ dày) hoạt động tối ưu
ở pH = 2

Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
11
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Hình 1.3.2: Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tác
1.3.5.3. Nồng độ cơ chất[5]
Với một lượng enzyme xác định, nếu tăng dần lượng cơ chất trong
dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzyme tăng dần nhưng đến một lúc nào
đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của
enzyme. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzyme đã được bão hồ
bởi cơ chất.
1.3.5.4. Nồng độ enzyme[30]
Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độ
phản ứng xảy ra càng nhanh. Tế bào có thể điều hồ tốc độ chuyển hoá vật chất
bằng việc tăng giảm nồng độ enzyme trong tế bào.
1.3.5.5. Chất ức chế enzyme[30]
Một số chất hoá học có thể ức chế hoạt động của enzyme nhưng khơng
bị chuyển hoá bởi enzyme. Các chất này cú thể là những ion, các phân tử vĩ
cơ, hữu cơ, kể cả các protein. khi cần ức chế enzyme nào đó cũng có thể tạo
ra các chất ức chế đặc hiệu cho enzyme ấy. Một số chất độc hại từ môi trường
như thuốc trừ sâu DDT là những chất ức chế một số enzyme quan trọng của
hệ thần kinh người và động vật.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
12
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.3.5.6. Chất hoạt hoá[5], [30]
Chất hoạt hoá: Là những chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt
động thành trạng thái hoạt động, từ trạng thía hoạt động yếu sang trạng thái
hoạt động mạnh.

Bản chất hoá học:
- Chất hoạt hoá gián tiếp: Tham gia phản ứng nhưng không tác dụng trực
tiếp với phân tử enzyme. Ví dụ, các chất có tác dụng loại trừ các yếu tố
kìm hãm khỏi môi trường phản ứng.
- Chất hoạt hoá trực tiếp: Tác dụng vào TTHĐ hoặc làm biến đổi cấu
hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt độ xúc
tác của enzyme.
Vì vậy khi hàm lượng chất hoạt hoá tăng trong mức độ cho phép thì
hoạt động của enzyme cũng tăng theo.
1.3.6. Đặc tính một số enzyme được sử dụng
Việc xác định hàm lượng vitamin B trong các mẫu thực phẩm (rau, ngũ
cốc, thịt cá, nấm men) không bổ sung vitamin B, người ta đã chỉ ra rằng nếu
chỉ thuỷ phân bằng acid thì chỉ thực hiện được một phân phản ứng
dephosphoryl dạng phosphoryl của vitamin B và việc kết hợp giữa thuỷ phân
bằng acid với enzyme diastase thì quá trình chiết sẽ tối ưu hơn.Trong tiến
trình xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng vitamin B
1
trong
thực phẩm, xuyên suốt quá trình thử nghiệm, việc đưa ra lựa chọn loại
enzyme sử dụng để giải phóng vitamin B
1
từ dạng phosphate este của nó,
dạng liân kết với protein đặc biệt được quan tâm (Hasselmann etal., 1989)
[16]. Chúng thuộc nhóm enzyme thuỷ phân. Chúng có khả năng phá vỡ liên
kết este. Và với thực phẩm có hàm lượng tinh bột cao (gạo) người ta còn quan
tâm tới enzyme có tác dụng thuỷ phân tinh bột để giúp các hợp chất cao phân
tử bị phân cắt thành sản phẩm thấp phân tử và dễ dàng hồ tan để tạo dịch
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
13

Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
chiết, giải phóng vitamin B
1
dạng tự do[24]. Với các lớ do trờn và vỡ lớ do
kinh tế, enzyme thường được chọn hơn cả là enzyme loại diastase nỉ cú sự
hoạt động phosphatase. Giờ đõy tất cả các enzyme diastase cú sự hoạt động
của protease, phosphatase[27].
1.3.6.1. α-Amylasae
Amylase là enzyme đầu tiên được phát hiện và cô lập bởi Anselme Paye
ào năm 183à enzyme l ại ia tas [4

Các enzyme mylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết
nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước
: RR’ + H-OH → R’OH + R

Trong hệ enzyme amylase có enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1 . Enzyme α –
amylase được h ạt ỉa i C+ à C
-
[5

Sự tác động của α amylase lên tinh bột: α amylase tác động lên mạch
amyloza và amylopectin của tinh bột và bẻ gãy các mối liên kết α- 1,4- gl o
id. Sau một thời gian ngắn , toàn bộ mạch amyloza và mạch chính của
amylopectin bị cắt nhỏ thành từng mảnh có năm hoặc sáu gốc glucozid. Gia
đo ạn tiếp theo α- amylase phân cắt cục bộ các mảng dextrin để tạo thành sản
phẩm cuối cùng là glucoza, maltoza và dextrin thấp phân tửhơn[
 .
α- amylase của sinh vật có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động,
chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt α- amylae t hể hiện họat tính trong
vùng aciế u[

:
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
14
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
- H ti ưu c ủ α- amylae c ủa nấm mc l à 4,–4
9
- H ti ưu c ủ α- amylae c ủa vi khun l à 5,–
1- Khi pH<3 h ì enzyme vụ hoạt, trừ enzyme của AspNiger. có thể
hoạt động ở pH = 2,5–28 . Trong môi trường có sự tồn tại của acid HCl, HBr
thì enzyme hoạt động có hiệu quả hơ
 Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn
khác nhau cũng không đồng nhất. Trong dung dịch đệm (pH = 4,7),
α- amylase của Asp. Oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao,
thậm chí ở 40
o
C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 -
29%, hoạt lực đường hóa còn 27 -85%. Ở 50
o
C trong 2 giờ, α-
amylase của nấm sợi này bị vụ hoạt hoàn toàn[30].
1.3.5.2. Taka-diastasae [31], [32]
Taka-diastase là một loại enzyme diastase (thủy phân) được nuôi cấy và
phân lập từ nấm Aspergillus oryzae. Năm 1894, tiến sĩ Takamin (Nhật Bản) là
người đầu tiên sản xuất ra enzyme taka-diastase.
Taka-diastase thủy phân liên kết 1,4-glycozid trong tinh bột, glycogen
hay các loại poplysaccarid khác cú chứa từ 3 phân tử đường glucose trở lên.
1.3.5.3. Clara–diastasae
Clara-diastase là tên riêng của một hỗn hợp các enzyme thủy phân bao
gồm α-amylase, cellulase, invertase, peptidase, phosphatase and sulfatase. Về

mặt bản chất clara-diastase có đầy đủ các loại enzyme thủy phân đường,
protein, cắt gốc phosphat và sulfat.
1.4. Các phương pháp xác định thiamin
Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B
1
là một lĩnh vực rất quan
trọng và được ứng dụng rộng rãi trong y học, dược, công nghệ thực phẩm
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
15
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học và các nghiên cứu về
phương pháp xác định hàm lượng vitamin B
1
. Dưới đây là một số phương
pháp đã được ứng dụng rộng rãi
1.4.1. Định lượng thiamin bằng phương pháp khối lượng
D.Adamson và J.Handisyde định lượng thiamin trong các chế phẩm
dược bằng phương pháp khối lượng dựa theo phản ứng kết tủa của vitamin B
1
với thuốc thử acid silicovonframic. Phương pháp được tiến hành: Cho dung
dịch acid silicowonframic vào thiamin có nồng độ khoảng 0.05mg khi đun sôi
trong môi trường acid clohydric để tạo kết tủa, sau đó rửa kết tủa bằng acid
clohydric 1,4% nóng qua phễu thuỷ tinh G4, sấy khô kết tủa đến khối lượng
không đổi ở nhiệt độ 100-150
0
c. Khối lượng kết tủa được nhân với hệ số 0,19
sẽ cho hàm lượng của thiamin khan nước trong mẫu phân tích, với sai số 7,5-
15%.
Khi định lượng thuốc viên, trước tiên phải tiến hành hồ tan thuốc viên đã

nghiền nhỏ bằng acid clohydric 2,6%, loại những phần rắn không tan và nước
lọc lấy được đem cho tủa thiamin bằng acid silicowonframic[12],[17].
1.4.2. Phương pháp sinh vật học và vi trùng học [12]
Phương pháp định lượng thiamin trên súc vật trên cơ sở làm chứng
(test) về sự trưởng thành nhanh chóng. Việc thiếu vitamin B
1
ở chuột ốm gây
sự bại liệt phần dưới, mà sau đó được điều trị bằng cách cho mẫu chuẩn đồng
thời với mẫu thử. Độ nhạy của phương pháp vi sinh vật giảm đáng kể, điều đó
được xác định rằng đôi khi do ảnh hưởng của vi sinh vật tạo nên thiamin ở bộ
máy tiêu hoá của chuột. Mẫu làm chứng vi sinh vật đặc hiệu nhất và hay dựng
nhất là dựng phương pháp định lượng đánh dâú dựa trên việc điều trị bệnh
viêm dây thần kinh của chim bồ câu phát sinh do cho ăn thức ăn thiếu
vitamin. Phương pháp này khó thực hiện, mất nhiều thời gian và bị nhiều yếu
tố ảnh hưởng. Nỉ được dựng chủ yếu là để thử tác dụng của thuốc.
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
16
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
1.4.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế
Saad S. M. Hassan, Monhamed T. Zaki, và Monhamed H. Eldesouki
đưa ra phương pháp xác định thiamin trong sản phẩm dược sử dụng điện cực
chọn lọc ion. Phương pháp dựa trên phản ứng tạo sunphua với
kaliplumbite(KpbO
2
) và đo lượng ion chì còn dư không phản ứng với vitamin
B
1
trong môi trường đệm acetat pH=4,5 bằng cách chuẩn độ với EDTA. Quá
trình chuẩn độ được đơn giản và độ chính xác tăng lên khi sử dụng kỹ thuật

Gran’s plot. Phương pháp cho phộp phân tích hàm vitamin B
1
trong khoảng 3-
50mg cho độ lặp lại 99% và độ lệch chuẩn ?0,7%. Phương pháp cho kết quả
với độ lặp lại cao nhưng không được dựng để định lượng thiamin trong các
chế phẩm dược đa thành phần và trong nguyên liệu tự nhiên. Vỡ trong các chế
phẩm dược đa thành phần và trong nguyên liệu tự nhiên có nhiều yếu tố gây
ảnh hưởng đến thế của điện cực [20].
1.4.4. Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao
Điện di mao quản thế cao (HVCE) là một phương pháp phân tích hiện
đại, được phát triển trân cơ sở của điện di cổ điển, đã được ứng dụng trong
khoảng chục năm gần đây. Phương pháp này ngày càng được áp dụng rộng
rói trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong dược, y và sinh học.
Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao khác với phương pháp sắc
ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) về cơ chế của sự tách, đó là sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất tan (ion) dưới tác dụng của lực điện trường E của
nguồn cao thế được đặt vào hai đầu của cột tách (ống mao quản) trong môi
trường của dung dịch điện ly và chất đệm có pH thích hợp.
Phương pháp này đã được sử dụng để phân tích bẩy vitamin tan trong
nước thiamin, nicotinamide, nicotic acid, pyridoxin, ascorbic acid, folic acid,
riboflavin và đã được áp dụng thành công trong dược phẩm. Hỗn hợp có chứa
các viatamin này được tách khỏi nhau trong thời gian 7 phút bằng sắc ký điện
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
17
Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội
di mao quản thế cao trong môi trường dung dịch điện di natri dodecyl sunfat
(SDS) sau đó được phát hiện bằng detector UV-VIS và detector diode-aray.
Phương pháp cho giới hạn phát hiện 0,08-1mg đối với acid forlic và 0,025-
1mg nicotinamide và thiamin, với độ lệch chuẩn <6% đối với tất cả các

mẫu[21].
1.4.5. Phương pháp phổ huỳnh quang [3,12]
Trong các phương pháp quang hóa học định lượng thiamin, phương pháp
thiocrom được xếp lên hàng đầu, vitamin B
1
(dưới dạng muối thiamin
clohydrat) bị oxy hoá bởi kali ferixyanid ở môi trường kiềm cho một chất có
huỳnh quang màu xanh da trời gọi là thiocrom, theo phản ứng sau đây.
N
N
CH
2
NH
2
.HCl
N
S
Cl
CH
3
CH
2
CH
2
OH
NaOH
CH
2
CH
2

OH
CH
3
N
S
CH
2
N
N
Kaliferixyanua
Thiamin
Thiocrom
NH
2
HO
N
N
CH
2
CH
3
CH
2
CH
2
OH
N
S
N
H

3
C
H
3
C
H
3
C
chiết thiocrom vào izobutanol và đo phổ huỳnh quang của nó. Phương
pháp này được được tiến hành xác định vitamin B
1
trong nhiều đối tượng
khác nhau như:
 Xác định vitamin B
1
trong cơ thể người và cơ thể vật nuôi. Mẫu có thể
là phần cứng, phần mềm hoặc ở dạng dung dịch được xử lý, tách
vitamin B
1
trong mẫu bằng cách đun cách thuỷ mẫu (90-100
0
c) trong
môi trường acid clohydric 0,1N khoảng 1giờ, tiến hành oxy hoá
vitamin B
1
bằng kali fericyanid trong môi trường NaOH để chuyển
thiamin thành thiocrom và chiết vào isobutanol, sau đó đo phổ huỳnh
Lê Thị Khánh Loan 06-04 K13 Khoa
CNSH
18