Nghiên cứu và phân lập Flavonoid của cây hoàng cầm (scutellaria baicalensis)

BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LỜI CẢM ƠN
Báo cáo khoa học này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học các
hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa Học, Trường Đại học Khoa Học
Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Văn Đậu, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều
kiện cho chúng em trong quá trình thực hiện nghiên cứu hoa học này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn
trong phòng Hóa học các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là chị Lại Hoàng Yến đã giúp
đỡ em nhiều trong quá trình nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em hoàn
thành báo cáo nghiên cứu khoa học này.
Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2012
Sinh viên
Phùng Thị Tuyền

Phùng Thị Tuyền-K54B Page 1
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Mục lục
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về họ hoa môi ( Lamiaceae hay Labiata)…………………………………
4
1.2. Cây Hoàng cầm………………………………………………………………… 5
1.2.1 Đặc điểm thực vật …………………………………………………………………5
1.2.2 Nguồn gốc và phân bố…………………………………………………………… 6
1.2.3 Hóa thực vật cây Hoàng cầm…………………………………………………… 6
1.3 Công dụng và các hoạt tính sinh học……………………………………………… 8
1.3.1.Ứng dụng trong y học dân gian…………………………………………………… 8

1.3.2. tác dụng dược lý………………………………………………………………… 9
1.3.3. Hoạt tính sinh học của một số chất trong cây Hoàng cầm……………………… 10
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Các phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………11
2.1.1. Chiết các hợp chất từ mẫu thực vật……………………………………………. …11
2.1.2. Phương pháp khảo sát các lớp chất…………………………………………… 11
2.1.3 Phương pháp kết tinh lại 13
2.1.4. Phương pháp xác định cấu trúc các chất phân lập 13
2.2. Thực nghiệm 13
2.2.1. Nguyên liệu thực vật 13
2.2.2. Chiết các hoạt chất từ thân và rễ cây Hoàng cầm 13
2.2.3. Phân tích cặn SBD bằng TLC 14
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 2
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
2.2.4. Phân tách cặn SBD bằng CC 14
2.2.5. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết
điclometan ( SBD) 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều chế các phần chiết. 16
3.2. Phân tích và phân tách cặn chiết diclometan (SBD) 16
3.2.1.Phân tích cặn chiết điclometan (SBD) bằng CC 17
3.4. Hằng số vật lý và cấu trúc các chất phân lập được từ cặn diclometan (SBD1) 18
3.4.1 Chất β-Sitosterol (SBD1) ……………………………………………………… 18
3.4.2 Wogonin (SBD2) …………………………………………………………………22
Kết luận …………………………………………………………………………………23
Tài liệu tham khảo
Phổ của SBD1 và SBD 2
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 3
BÁO CÁO KHOA HỌC

KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LỜI MỞ ĐẦU
Việc tăng cường nghiên cứu, khai thác và phát triển nguồn tài nguyên thực vật
làm thuốc đang là một định hướng lớn trong chiến lược phát triển ngành công nghiệp và
nâng cao sức khỏe cộng đồng.Từ những năm đầu thế kỉ XIX,trong lĩnh vực y-dược
học,việc kết hợp giữa các phương pháp khoa học kĩ thuật và các loại thực vật xuất phát
từ thiên nhiên đã đưa con người đến một bước lớn trong việc phát minh ra nhiều loại
thuốc có khả năng chữa bệnh.
Hoàng cầm là một vi thuốc thông dụng,nhưng hiện nay chưa thấy ở nước
ta.Hoàng cầm được sử dụng rộng rãi là thuốc thảo dược Trung Quốc được sử dụng trong
điều trị chống viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả
các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ huyết áp,kháng khuẩn….
Xuất phát từ những lí do trên, bài báo cáo này có tên là: “Nghiên cứu và phân lập
Flavonoid của cây hoàng cầm (scutellaria baicalensis) “.
Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hoàng cầm, các nhiệm vụ
đặt ra như sau:
- Xây dựng phương pháp chiết hiệu quả với cây Hoàng cầm.
- Khảo sát định tính và phân tách các chất từ cây Hoàng cầm.
- Khảo sát cấu trúc các chất phân lập được từ cây Hoàng cầm.
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 4
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 Vài nét về họ hoa môi ( Lamiaceae hay Labiatae ).
Họ hoa môi hay được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà …,là một
họ thực vật có hoa. Nó từng được coi là có học hang gần với họ Verbenaceae nhưng một
số nghiên cứu phát sinh gần đây đã chỉ ra rằng một loạt các chi được phân loại trong họ
Verbenaceae thực chất là thuộc họ Limiaceae, trong khi các chi cốt lõi của họ
Verbanaceae thì không có quan hệ họ hàng gần với Lamiaceae mà là gần hơn với các
thành viên khác cả bộ Lamiales.Họ Lamiaceae mỏ rộng chứa khoảng 233-263 chi và

khoảng 6900-7173 loài.
Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi thành phần của
cây và bao gồm nhiều loài cây than thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực, như húng
quế, bạc hà, hương thảo, ô kinh giới, oải hướng, tía tô, hương nhu….Một số loài là cây
bụi hay cây gỗ,hiếm gặp hơn là các dạng leo.Nhiều loài được gieo trồng rộng rãi, không
chỉ vì hương thơm của chúng mà còn vì dễ gieo trồng với mục đích lấy lá để ăn, làm gia
vị, làm cảnh hay lấy hạt.
Tên gọi nguyên gốc của họ này là Labiatae, do hoa của chúng thông thường có các
cánh hoa hợp thành môi trên và môi dưới.Nhưng phần lớn các nhà thực vật học hiện tại sử
dụng tên gọi Lamiaceae khi nói về họ này.
Các lá của chúng mọc chéo chữ thập, nghĩa là lá sau mọc vuông góc với lá trước, hay
mọc vòng.
Thân cây nói chung có tiết diện hình vuông, nhưng điều này không phải bắt buộc ở tất cả
các loài cũng như tiết diện kiểu này cũng có thể xuất hiện ở các họ thực vật khác.
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 5
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Hoa của chúng đối xứng hai bên với 5 cánh hoa hợp, 5 lá đài hợp. Chúng thường là lưỡng
tính và mọc vòng (cụm hoa trông giống như một vòng hoa nhưng thực tế bao gồm 2 cụm
chụm lại).
1.2 Cây Hoàng cầm ( scutellaria baicalensis ).
Tên khoa học là Scutellaria baicalensis (Hoàng cầm), nó còn có các tên khác là Hủ
trường, Túc cầm, Hoàng văn, Kinh cầm, Đỗ phụ, Nội hư, Ấn dầu lục, Khổ đốc bưu, Đồn vĩ
cầm, Thủ vĩ cầm, Điều cầm, Khô cầm, Bắc cầm, Phiến cầm ,Khô trường,Lý hủ thảo, Giang
cốc thu, Lý hủ cân thảo, Điều cầm, Tử cầm, Đạm tử cầm, Đạm hoàng cầm, Tủ cầm, Đông
cầm, Hoàng kim trà, Lan tâm hoàng.
1.2.1 Đặc điểm thực vật
Hoàng cầm là một loại cỏ sống dai, cao 20-50cm, có rễ phình to thành hình chùy,
mặt ngoài màu vàng sẫm bẻ ra có màu vàng. Thân mọc đứng, vuông, phân nhánh, nhẵn
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 6

BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
hoặc có lông ngắn. Lá mọc đối, cuống rất ngắn, hoặc không cuống; phiến lá hình mác
hẹp, hơi đầu tù, mép nguyên, dài 1.5-4cm, rộng 3-8mm hoặc 1cm, mặt trên màu xanh
sẫm, mặt dưới xanh nhạt. Hoa mọc thành bông ở đầu cành, màu lam tím. Cánh hoa gồm 2
môi, 4 nhị (2 nhị lớn dài hơn tràng) màu vàng, bầu có 4 ngăn.
1.2.2 Nguồn gốc phân bố
Đang thí nghiệm di thực vào vùng mát của nước ta. Cây mọc tốt, nhưng chưa phát
triển.Hiện nay vẫn phải nhập của Trung Quốc ( Hắc long Giang, Liêu Ninh, Hà Bắc, Hà
Nam, Vân Nam, Nội Mông ). Mọc hoang cả ở Liên Xô cũ được nghiên cứu sử dụng làm
thuốc chữa cai huyết áp.
Mùa xuân và mùa thu thu hoạch lấy rễ: đào về cất bỏ rễ con, rửa sạch đất cát, phơi
hơi khô, cạo bỏ vỏ mỏng, phơi hoặc sấy khô là được.
1.2.3. Hóa thực vật của cây Hoàng cầm.
1.2.3.1. Tinh dầu
1.2.3.2. Dẫn xuất flavon
Theo các nghiên cứu thì chất xác định được trong cây hoàng cầm chủ yếu là dẫn
xuất của flavon.Trong cả lá, rễ, thân đều có scutelarin hay wooginin ( 8,4-10,3% ),
baicalin chỉ có trong rễ, cùng với nhiều chất như baicalein, neo-baicalein, b-sitosterol,
benzoic acid, woogonoside, skullcapflavone, oroxylin A, methoxylbaicalei,
dihydrooroxylin A, chrysin, 2,5,8-trihydroxy-7-methoxyflavone, 2,5,8-trihydroxy-6,7-
dimethoxyflavone, 4,5,7-trihydroxy-6-methoxyflavanone.Ngoài ra còn có tannin và chất
nhựa.Không thấy có ancaloit, glucozit, saponin, vitamin C.
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 7
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Baicalin wogonoside


wogonin

Phùng Thị Tuyền-K54B Page 8
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Skullcapflavone 1 Skullcapflavone 2
1.3. Công dụng và các hoạt chất sinh học
1.3.1. Ứng dụng trong y học dân gian
Từ lâu,y học Trung Quốc đã sử dụng hoàng cầm là một vị thuốc để phòng và chữa
bệnh.Trong đông y: Hoàng cầm là một vị thuốc mát chữa sốt, chữa cảm mạo, ho cảm,
cầm máu, kinh nguyệt quá nhiều. Theo tài liệu cổ: Hoàng cầm vị đắng tính hàn, vào 5
kinh tâm, phế, can, đởm và đại tràng. Có tác dụng tả phế hỏa, thanh thấp nhiệt. Dùng
chữa hàn nhiệt vãng lại, phế nhiệt sinh ho, tả lỵ đau bụng, thấp nhiệt da vàng, đầu nhức,
mắt đỏ, đau, động thai.
Liều dùng mỗi ngay 6-15g sắc với nước chia 3 lần uống trong ngày. Có thể dùng
bột. Gần đây, hoàng cầm được dùng làm thuốc chữa các triệu chứng nhức đầu, mất ngủ
của bệnh cao huyết áp do thần kinh thực vật và do mạch máu bị cứng, đồng thời được
dùng điều trị bệnh cao huyết áp. Dùng dưới hình thức rượu hoàng cầm (bột hoàng cầm
20g, cồn 700 vừa đủ 100ml). Ngày uống 2-3 lần, mỗi lần 20-30 giọt.
Đơn thuốc có hoàng cầm trong kinh nghiệm cổ truyền:
1. Thanh kim hoàng: Hoàng cầm sấy khô tán nhỏ làm thành viên to bằng hạt ngô. Ngày
dùng 20-30 viên. Chữa các bệnh đổ máu cam, thổ huyết, kinh nguyệt quá nhiều, cảm
mạo, ho cảm.
2. Tam hoàng cầm (Theo Thiên kim phương).
-Hoàng cầm (mùa xuân dùng 120g, mùa hạ và mùa thu 240g, mùa đông 120g).
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 9
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-Hoàng liên (mùa xuân 160g, mùa hạ 280g, mùa thu 120g, mùa đông 80g).
-Đại hoàng (mùa xuân 120g, mùa hạ 40g, mùa thu 120g, mùa đông 200g)
Cả ba vị, liều lượng tùy theo mùa mà thay đổi, tất cả tán nhỏ, dùng mật ong viên thành

viên to bằng hạt đậu đen. Ngày uống 3 lần, mỗi lần 5-7 viên. Uống luôn trong 1 tháng.
Chữa bệnh lao, viêm niêm mạc tử cung.
3. Hoàng cầm-mạch môn đông, mỗi vị 10g. Sắc uống trong ngày thay nước. Dùng sau
khi sinh nở bị mất máu nhiều, khát nước.
1.3.2. Tác dụng dược lý.
+ Tác dụng miễn dịch : tác dụng chống dị ứng của baicalein liên hệ đến sự ức chế
khả năng giải phóng enzyme ra khỏi các tế bào.Tác dụng ngăn ngừa dị ứng này làm cho
cơ dãn ra,thuốc có tác dụng đối với da heo được gây dị ứng và chất Histamin. Chất
Baicalein và Baicalin có tác dụng dãn phế quản đối với tiểu phế quản của heo bị gây dị
ứng suyễn.Cả hai chất này có tác dụng ức chế phù co thắt và giảm tính thẩm thấu mao
mạch ở chuột.Chất Baicalin cũng ngăn ngừa phổi xuất huyết ở chuột xuống mức thấp
nhất (Chinese herbal medicine).
+ Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng cầm có kháng phổ rộng. Trong thí nghiệm, nó có
tác dụng ức chế đối với nhiều khuẩn bệnh gồm tụ cầu vàng, phế cầu khuẩn, não mô viêm
Neisseria.Nhiều thí nghiệm báo cáo cho thấy thuốc có tác dụng kháng lại trực khuẩn lao,
kháng lại với nấm da và có khả năng diệt Leptospira (Chinese herbal medicine).
+ Tác dụng điều hòa nhiệt độ: từ năm 1935, có báo cáo cho biết rễ Hoàng cầm có
tác dụng hạ nhiệt.
+ Tác dụng đối với huyết áp: nước sắc, cồn chiết, dịch truyền, kể cả nước và cồn
trích Hoàng cầm đều có tác dụng hạ huyết áp
+ Tác dụng lợi tiểu.
+ Tác dụng chuyển hóa Lipid: nước sắc hỗn hợp Hoàng cầm, Hoàng liên, Đại
hoàng không gây ảnh hưởng đối với Cholesterol/phospholipid nhưng làm hạ lipid.
+ Tác dụng đối với mật, với vết vị trường, với hệ thần kinh trung ương ( chất baicalin làm
giảm sự di chuyển và phản xạ của chuột ).
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 10
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
1.3.3. Hoạt tính sinh học của một số chất có trong cây Hoàng cầm.
Trong cây Hoàng cầm chủ yếu chứa Flavonoid là dẫn xuất của phenol có hầu hết

ở người, động thực vật và vi sinh vật do đưa trực tiếp vào từ nguồn thức ăn. Bản thân
con người không có khả năng tự tổng hợp được phenol. Flavonoid tham gia vào tất cả
các quá trình trao đổi chất, sinh tổng hợp và quá trình enzym. Về mặt cấu tạo, flavonoid
là các polyphenol có tính axit, đính nhóm hydroxy tự do ở các vòng.
Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và
dạng liên kết với glucid (glycosid). Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung
môi hữu cơ như ete, axeton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng
glycosid thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như
axeton, benzen, cloroform.
Hoạt tính sinh học của flavonoid: Có tác dụng với khối u và một số dạng ung thư
như enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy
-5,6,7,4'-tetrametoxyflavon). Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin. Có tác
dụng estrogen như glycosid quecrcetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7-ramnorid.
Flavonoids có hoạt chất chống oxy hóa. Một số hoạt độ tính của flavonoid bao
gồm: chống dị ứng, chống ung thư, chất chống oxy hóa, chống viêm và chống virus,
chống dị ứng, chống co giật… Các flavonoid quercetin được biết đến với khả năng
của nó để làm giảm sốt, eszema, viêm xoang và bệnh suyễn. Đặc biệt, flavonoid còn
có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch.
Do khả năng ức chế quá trình oxy hoá nên chúng có hiệu ứng chống u lành tính và u
ác tính. Các flavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng
như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương
hàn, lị
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 11
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Các phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Chiết các hợp chất từ mẫu thực vật
- Ngâm mẫu thực vật đã qua xử lý sơ bộ trong methanol.Để tăng hiệu suất chiết,
tiến hành chiết ngâm nhiều lần, mỗi lần ngâm trong 3 – 4 ngày.

- Dựa vào phương pháp chiết chất lỏng, sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng
dần để chiết các lớp chất có độ phân cực tương ứng.
2.1.2. Phương pháp khảo sát các lớp chất
2.1.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien
60 F
254
, dày 0,2 mm (Merck), sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để khảo sát
và chọn ra một hệ tách tốt nhất cho sắc ký cột.
Các dung môi thường được dùng để triển khai sắc kí là n-hexan, axeton,
diclomentan, etyl axetat và metanol Chúng được làm khan và chưng cất lại trước khi
pha theo tỷ lệ phù hợp.
Các vệt chất trên lớp mỏng được phát hiện dưới ánh sáng tử ngọai (λ=254 nm),với
dung dịch vanilin/H
2
SO
4
đặc 1%, tiếp theo hơ nóng ở 120
0
C và dung dịch FeCl3/ethanol
96%.
Đối với sắc kí bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho
R
f
tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với yêu cầu khảo sát hỗn hợp thì chọn dung môi sao cho
các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có R
f
càng xa nhau càng tốt.
2.1.2.2. Phương pháp sắc kí cột
Sau khi khảo sát bản mỏng, tiến hành sắc kí cột để tách một số hợp chất trong phần chiết.

Phùng Thị Tuyền-K54B Page 12

BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Có 3 phương pháp sắc kí cột (để phân lập các chất trong hỗn hợp và tinh chế các chất.
Column Chrotomatography, CC: sắc kí cột thường, Flash Chromatography, FC: sắc kí cột
nhanh.
Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi chỉ sử dụng phương pháp sắc kí cột
thường. Đây là phương pháp tách chất được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.
Cột tách sắc kí là một ống thủy tinh hình trụ, phía dưới có khóa. Cột có đường kính
và chiều dài tùy theo yêu cầu sử dụng.
Trong sắc kí cột, pha tĩnh thường là silicagel (Merk, cỡ hạt 63–100 μm), và pha
động là dung môi, hay các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau ( n-hexan, ete dầu hỏa,
điclometan, clorofoc, etyl axetat, axeton, metanol ).
Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt
Một lượng silica gel ứng với cột sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là
30 cm, được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ dung môi ít phân cực
hơn. Bột nhão này được đuổi hết bọt khí và được nhồi vào cột sắc ký. Có thể dùng bơm
nén hoặc để tự dung môi ít phân cực hơn đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel
hoàn toàn ổn định.
Đưa mẫu lên cột sắc ký:
+ Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel: Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa
đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp. Trộn dung dịch thu được với silica gel với tỷ lệ 1g
chất/1,2-1,5g silica gel. Hỗn hợp này, sau đó được làm bay hơi dung môi đến khô kiệt
thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel. Hỗn hợp này đưa lên cột sắc ký.
+ Triển khai sắc ký cột: Mở khóa dưới để cho dung môi chảy ra khỏi cột, cho đến
khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2mm. Cho từ từ mẫu đã tẩm silica
gel lên cột. Khi đưa mẫu lên chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất ở phía trên và phía
dưới cột tạo thành mặt phẳng ngang. Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác
định nhờ vào các khảo sát thăm dò bằng TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân

đoạn 20-50 ml. Với cột sắc ký tinh chế các phân đoạn được thu từ 3-5ml.
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 13
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
+ Khảo sát sắc ký các phân đoạn: Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được
bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt
dung môi để thu được các nhóm phân đoạn.
2.1.3 Phương pháp kết tinh lại
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để làm sạch chất rắn. Việc làm sạch chất
rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của các chất và tạp chất trong dung
môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau.
2.1.4. Phương pháp xác định cấu trúc các chất phân lập
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (
1
H-NMR ) được ghi trên thiết bị Bruker
Avance 500 Spectrometer.
TMS (tetrametyl silan) (
1
H-NMR) là chất chuẩn nội zero. Độ chuyển dịch hóa học
δ được biểu thị bằng ppm, J tính theo Hz.
Phổ sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS) được ghi trên thiết bị Varian 320-MS.
Điểm nóng chảy không hiệu chỉnh được đo trên máy Boetius.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Nguyên liệu thực vật
Mẫu nghiên cứu là 1 kg thân và rễ cây hoàng cầm đã được làm khô.
2.2.2. Chiết các hoạt chất từ thân và rễ cây Hoàng cầm.
Phần tổng quan về thành phần hóa học của cây Hoàng cầm nói chung cho thấy chủ
yếu chứa Flavonoid,việc chiết chủ yếu được thực hiện ở các dung môi có độ phân cực
trung bình trở lên như điclometan, etyl axetat.
1kg Hoàng cầm được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó,

lọc lấy dịch chiết, bã nguyên liệu lại được ngâm tiếp với methanol. Quá trình này được
tiến hành tương tự như vậy 3 lần. Tổng thể tích methanol dùng trong 3 lần là 15l. Dịch
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 14
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
chiết sau 3 lần được gom lại, đem cất loại dung môi dưới áp suất thấp ở nhiệt độ khoảng
40-50
0
C đến khi thu được khối sệt.
Pha khối sệt ở trên với khoảng 0,5l nước cất, rồi chiết chúng bằng các dung môi
trước hết là điclometan (3 lần), sau đó đến etyl axetat (3 lần).
Dịch chiết điclometan và etyl axetat <ếp theo được xử lí như sau: đem cất loại
dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40-50
0
C, thu được các cặn chiết ở dạng sệt, kí
hiệu lần lượt là SBD và SBE.
Sơ đồ chiết và hiệu suất các phần chiết được trình bày ở chương 3: Kết quả và
thảo luận.
2.2.3. Phân tích cặn SBD bằng TLC
Hòa tan một lượng nhỏ cặn diclometan bằng aceton. Sau đó, dùng capilla để hút
chất, chấm lên bản mỏng (DC-Alufolien 60 F
254
dày 0,2 mm) sao cho vết chất cách mép
dưới của bản 0,7 cm và cách đều 2 mép bên là 0,5 cm. Sau khi sử dụng qua nhiều hệ dung
môi và các tỉ lệ khác nhau. Nhận thấy hệ dung môi hexan : axeton (4/1) cho sự tách tốt
nhất đối với cặn điclometan.
Phát hiện các vết chất dưới ánh sáng thường , sau đó soi bản mỏng dưới đèn tử
ngoại UV (λ = 254 nm), cuối cùng phun bản mỏng với dung FeCl3 /ethanol 96
2.2.4. Phân tách cặn SBD bằng CC
a.Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có đường kính 4 cm, cao 80 com, lót đáy cột bằng một

miếng bông thủy tinh .
b.Tẩm mẫu: Hòa tan 13,2 g cặn điclometan, sau đó tẩm với silicagel cỡ hạt 63-100
μm,trộn đều vào nhau rồi để bay hơi hết để thu được bột mịn.
c.Nhồi cột: Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt, vừa đổ hỗn hợp silicagel và
dung môi vừa gõ nhẹ lên thành cột để silica gel được nén đều. Khi cột đã ổn định, đưa mẫu
đã tẩm lên cột.
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 15
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
d.Chạy sắc kí cột: Khi dung môi trong cột xuống đến cách bề mặt silicagen đã được nén
đều khoảng 4cm thì đưa mẫu đã tẩm lên cột. Sau đó đặt một miếng bông thấm lên bề mặt
chất để tránh sự khuếch tán ngược của chất tẩm. Tiến hành rửa giải bằng dung môi theo
gradient, tăng dần độ phân cực: đầu tiên với 100 % hexan, tiếp theo là hỗn hợp hexan :
axeton theo tỉ lệ tăng dần axeton, và cuối cùng dội cột với axeton. Dung dịch rửa giải
được thu vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự, tổng cộng thu được 65 ống nghiệm.
e.Khảo sát các phân đoạn rửa giải: Qua kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng, những ống
nghiệm có sắc kí đồ giống nhau thì gom lại, thu được 12 phân đoạn,kí hiệu là SBD I→
IX. Sau đó tiến hành rửa chất cùng với kết tinh lại thu được chất tinh khiết ở phân đoạn
SBD IV (SBD1). Tiếp tục chạy sắc kí cột với những cột nhỏ hơn phân đoạn SBD VIII với
hệ dung môi diclometan-etylacetat, pha tĩnh là silicagel, tiến hành rửa chất và kết tinh lại
chúng tôi thu được chất tinh khiết, kí hiệu là SBD2.
2.2.5. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết
điclometan ( SBD)
2.2.5.1. Chất β-sitosterol (SBD1)
Tinh thể hình kim, màu trắng, đnc: 130.9-132.4
o
C.
R
f
=0.36 (TLC, silica gel, n-hexan/axeton 5:1, vệt chất hiện màu tím khi phun

vanillin/H
2
SO
4
đặc 1%).
FT-IR: ν
max
cm
-1
= 3246, 1642
EI-MS: M
+.
414
Hợp chất này còn được nhận dạng trên cơ sở phân tích, so sánh TLC và co-TLC với chất
chuẩn β-Sitosterol.
2.2.5.2. Chất SBD2
Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, đnc: 192.4 – 195.1
R
f
= 0.57 (TLC, silicagel, n-hexan/etylacetat 7:3 , vệt chất hiện màu xanh khi phun
FeCl
3
/etanol 96% ).
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 16
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều chế các phần chiết.
Phần thân và rễ hoàng cầm đã làm khô được ngâm với methanol. Sau đó, dịch
chiết được loại dung môi rồi chiết với diclometan và etylacetat.

Hiệu suất các phần chiết được đưa ra trong bảng sau:
Bảng 1. Hiệu suất các phần chiết từ cây Hoàng cầm
STT Cặn chiết Kí hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất (%)
1 Diclometan SBD 13.2 1.32
2 Etylacetat SBE 26.3 2.63
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 17
Thân và rễ hoàng
cầm khô (1 kg)
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chiết bằng 3×150ml diclometan
Chiết bằng 3×150ml etylacetat
Sơ đồ 1. Quy trình điều chế các cặn chiết trong cây hoàng cầm
3.2. Phân tích và phân tách cặn chiết diclometan (SBD)
Phân tích bằng sắc kí lớp mỏng,sử dụng hệ dung môi hexan/aceton (4/1) cho sự
tách tốt nhất.
3.2.1.Phân tích cặn chiết điclometan (SBD) bằng CC
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 18
-Ngâm chiết với methanol 3
lần.
-Lọc dịch chiết qua giấy lọc.
Dịch chiết
methanol
-Cất loại dung môi ở nhiệt độ
< 50
0
C.
-Pha loãng bằng 0,5 l nước cất
Dịch chiết

diclometan
Dịch còn lại sau khi
chiết với diclometan
-Loại nước bằng Na
2
SO
4
-Cất loại dung môi ở
nhiệt độ <50
0
C
Dịch còn lại sau
chiết
Dịch chiết
etylacetat
Cặn diclometan
(SBD)
Cặn etylacetat
(SBE)
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Phân tách trên cột silicagel (Merck, cỡ hạt 63-100 μm) 13.2 g cặn diclometan Rửa
giải lần lượt với hexan, rồi hỗn hợp dung môi hexan/aceton với đọ phân cực tăng dần.
Quá trình chạy sắc kí cột được trình bày ở bảng 2
Bảng 2. Quá trình phân tách cặn chiết diclometan bằng CC
STT V
hexan
/ V
aceton
Thể tích (ml) Ống nghiệm

1 95:5 350 1 – 3
2 9:1 600 1 – 3
3 8:2 100 4 – 6
4 7:3 500 6 - 65
Quá trình rủa giải dung dịch được thu vào các ống nghiệm,tổng cộng là 65 ống.
Qua kiểm tra SKLM, những ống nghiệm có sắc kí đồ giống nhau được gom lại và thu
được 9 phân đoạn (I → IX).
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 19
Cặn SBD ( 13.2g )
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-Rửa với n-hexan
-Kết tinh lại
- CC, silicagel, hệ dung môi
Diclometan/etylacetat(7/3)
- Kết tinh lại
Sơ đồ 2: Các phân đoạn sau khi chạy SC cặn diclometan
- Phân đoạn IV (ống nghiệm 8) xuất hiện tinh thể màu trắng. Sau đó tiến hành kết
tinh lại thu được tinh thể sạch (SBD1).
- Phân đoạn VIII (ống nghiệm 17,18) được xử lý tiếp (sắc kí cột, rửa chất, kết tinh
lại) cho 1 chất tinh khiết, kí hiệu là SBD2.
3.4. Hằng số vật lý và cấu trúc các chất phân lập được từ cặn diclometan (SBD1).
3.4.1 Chất β-Sitosterol (SBD1)
Hợp chất SBD1 đã được phân lập ở phân đoạn IV dưới dạng tinh thể hình kim,
màu trắng, đnc: 130.9-132.4
o
C.
Hợp chất này cho giá trị R
f
=0.36 (TLC, silica gel, n-hexan/axeton 5:1, vệt chất

hiện màu tím khi phun vanillin/H
2
SO
4
đặc 1% + t
o
).
Phổ EI-MS của SBD1 quan sát thấy pic phân tử [M]
+.
của nó là 414, từ các phổ
FT-IR, và có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl(OH): ν
max
3246cm
-1
(rộng,
mạnh), một nối đôi C=C: ν
max
1642 cm
-1
(yếu)
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 20
IX
43 - 65
VIII
19 - 40
VI
13 - 16
II
4 - 6
V

9 - 12
VII
17 , 18
IV
8
III
7
I
1 - 3
SBD2
SBD1
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Các số liệu về phổ FT-IR, EI-MS và các hằng số vật lý của hợp chất này phù
hợp với β-Sitosterol.
C δ
H
a, c
, J (Hz) δ
C
a, b
δ
C
*a, b
[15]
1 2H (m) 37.3 36.1
2 2H (m) 31.7 31.6
3 3.68 (tt, J=4.6, 13.2) 71.8 71.8
4 2H (m) 42.3 42.3
5 - 140.8 140.7

6 5.33 (d, 5.2) (m) 121.7 121.7
7 2H (m) 31.9 31.8
8 1H (m) 32 31.9
9 1H (m) 50.2 50.1
10 - 36.5 36.1
11 2H (m) 21.1 21.2
12 2H (m) 39.8 39.7
13 - 42.3 42.3
14 1H (m) 56.8 56.9
15 2H (m) 24.3 24.2
16 2H (m) 28.3 28.2
17 1H (m) 56.1 56.4
18 0.76 (s) 11.9 11.8
19 1.03 (s) 19.9 20.0
20 1H (m) 36.2 36.1
21 0.96 (d, J=7.0) 18.8 18.7
22 2H (m) 33.9 33.7
23 2H (m) 26.1 26.2
24 1H (m) 45.9 45.8
25 1H (m) 29.2 29.1
26 0.84 (d, J=8.0) 19.1 19.0
27 0.86 (d, J=8.0) 19.4 19.3
28 2H (m) 23.1 23.2
29 0.88 (d, J=0.75) 11.9 11.8
Bảng 3.
1
H-NMR và
13
C-NMR của chất SBD1
Hơn nữa hợp chất này còn được nhận dạng trên cơ sở phân tích, so sánh TLC

và co-TLC với chất chuẩn β-Sitosterol
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 21
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Với sự phân tích nêu trên có thể khẳng định SBD1 là 3β-Stigmast-5-en-3-ol
hay β-Sitosterol có công thức phân tử C
29
H
50
O và có công thức cấu tạo như sau:

OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
19
11
12
13
14
15
16
17

2 0
18
2 2
2 3
2 4
2 5
2 6
2 7
2 8
2 9
2 1
SBD1
Hoạt tính sinh học của β-Sitosterol
+ β-Sitosterol là một trong nhiều phytosterol (sterol thực vật) với cấu trúc hóa học
tương tự như cholesterol. Hợp chất này hỗ trợ mạnh mẽ hệ thống miễn dịch của cơ thể,
làm giảm nguy cơ ung thư, giảm các triệu chứng của tiền liệt tuyến lành tính.
+ β-sitosterol giới hạn số lượng cholesterol có thể nhập vào cơ thể và giảm viêm, ngăn ngừa
các bệnh tim mạch, bệnh lao, viêm khớp dạng thấp, dị ứng, đau cơ, hen xuyễn.
3.4.2 Wogonin (SBD2)
+ Hợp chất SBD2 đã được phân lập ở phân đoạn VIII dưới dạng tinh thể hình kim, màu
vàng nhạt, đnc: 192,4-195,1
o
C.
+ Hợp chất này cho giá trị R
f
=0.57 (TLC, silica gel, n-hexan/etylacetat 7:3, vệt chất
hiện màu xanh khi phun FeCl
3
/etanol 96%.
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 22

BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KẾT LUẬN
1. Đã xây dựng được một quy trình điều chế các cặn chiết từ cây Hoàng cầm là
diclometan và etyl axetat, chứa lớp họat chất mà chúng tôi quan tâm nghiên cứu.
2. Đã phân tích thành phần cặn chiết diclometan bằng phương pháp SKLM. Hệ
dung môi phân tách tốt cho cặn hexan/aceton 4:1.
3. Sử dụng phương pháp kết tinh lại đã thu được một chất tinh khiết, kí hiệu
SBD1.
4. Sử dụng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel đã thu được một
chất tinh khiết, kí hiệu SBD2
5. Sử dụng các phương pháp phổ (MS, NMR) kết hợp với phổ chuẩn đã xác định
được cấu trúc của:
 Chất SBD1 là 3β-Stigmast-5-en-3-ol hay β-Sitosterol
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 23
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
 Chất SBD2 là Wogonin
Tài liệu tham khảo
1.GS.Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, cây Hoàng cầm (Tr 311).
2. />Action=document&docId=44151&db=EPB&tab=desc&lang=EN&db_query=2%3A0%3
A&markupType=all
3. Gao Z, Yang X, Huang K, Xu H. Free-radical scavenging and mechanism study of
flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi. Appl Magn Reson .
2000;19:35-44.
4. Stojakowska A, Malarz J. A quantitative RP-HPLC determination of flavonoids in the
roots of Scutellaria baicalensis Georgi. Herba Pol . 1998;44:300-306.
5. Miyaichi Y, Imoto Y, Saida H, Tomimori T. Studies on the constituents of Scutellaria
species. (X). On the flavonoid constituents of the leaves of Scutellaria baicalensis Georgi.
Shoyakugaku Zasshi . 1988;42:216-219.

Phùng Thị Tuyền-K54B Page 24
BÁO CÁO KHOA HỌC
KHOA HÓA HỌC-ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
6. Chevallier, A. The Encyclopedia of Medicinal Plants . New York, NY: DK Publishing,
Inc.;1996:133.
7. Morimoto S, Tateishi N, Matsuda T, et al. Novel hydrogen peroxide metabolism in
suspension cells of Scutellaria baicalensis Georgi. J Biol Chem . 1998;273:12,606-612.
8. Chung C, Park J, Bae K. Pharmacological effects of methanolic extract from the root
of Scutellaria baicalensis and its flavonoids on human gingival fibroblast. Planta Med .
1995;61:150-153.
9. Lin CC, Shieh DE. The anti-inflammatory activity of Scutellaria rivularis extracts and
its active components, baicalin, baicalein and wogonin. Am J Chin Med . 1996;24:31-36.
10. Chang Y, Shen J, Wung B, Cheng J, Wang D. Chinese herbal remedy wogonin
inhibits monocyte chemotactic protein-1 gene expression in human endothelial cells. Mol
Pharmacol . 2001;60:507-513.
11. Krakauer T, Li B, Young H. The flavonoid baicalin inhibits superantigen-induced
inflammatory cytokines and chemokines. FEBS Lett . 2001;500:52-55.
12. Wakabayashi I. Inhibitory effects of baicalein and wogonin on lipopolysaccharide-
induced nitric oxide production in macrophages. Pharmacol Toxicol . 1999;84:288-291.
13. Gao Z, Huang K, Yang X, Xu H. Free radical scavenging and antioxidant activities of
flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi. Biochim Biophys
Acta . 1999;1472:643-650.
Phổ
1
H-NMR của SBD1
Phùng Thị Tuyền-K54B Page 25