Nghiên cứu đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy bằng phương pháp thủy tinh hóa

NGHIÊN CỨU ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO TRỨNG TRÂU ĐẦM LẦY BẰNG
PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA
Nguyễn Khánh Vân, Vũ Thị Thu Hương, Quản Xuân Hữu,
Đỗ Văn Hương, Nguyễn Thị Hương
Phòng thí nghiệm trọng ñiểm công nghệ tế bào ñộng vật
ABTRACT
The study aimed to determine survival of buffalo oocytes immature and
matured in vitro after cryopreservated by vitrification method. Survival of buffalo
oocytes was evaluated base on their normal morphology and chromosome to oocytes
matured or the maturation rate to immature oocytes. The vitrification solution (VS)
consisted of TCM 199 supplemented with 0.5M sucrose, 0.5M bovine serum albumin
(BSA) and 6M ethylene glycol (EG). The buffalo oocytes were pre-equilibrated in
50% of the VS for 3-5min, then kept in VS for 1min in temperature room and loaded
in 0.25ml straws. The straws were then plunged in LN2 for storage. After 2 week of
storage buffalo oocytes matured were (38oC for 5s) and evaluated for morphological,
the maturation rate and chromosome damage. The percentage of post thawing
morphologicalnormal vitrified mature oocytes significantly higher were (76,67% vs
70.31%). It was observed that 75.33% (113/150) of the mature buffalo oocytes were
not chromosome damage after vitrification-warming. However, the maturation rate of
the buffalo oocytes immature after vitrification-warming significantly much lower
than that for control groups (31.1% vs 65.45%). It was concluded that can
cryopreservation success the mature or immature buffalo oocytes by vitrification
method.
Keywords
: oocytes; buffalo; mature, immature, vitrification
1. Đặt vấn ñề
Quá trình bảo quản lạnh là một lựa chọn hàng ñầu cho việc giữ gìn trứng chưa
thụ tinh cho cả hai mục ñích nghiên cứu và thương mại. Đã có một số phương pháp
bảo quản lạnh ñược sử dụng ñể bảo quản phôi, trứng ñộng vật và tạo ra ñược con non
từ trứng, phôi sau ñông lạnh-giải ñông. Một trong những phương pháp ñông lạnh
nhanh ñược nghiên cứu rộng rãi hiện nay là phương pháp thủy tinh hóa

(Vitrification). Trong sinh học lạnh thì thuật ngữ Vitrification liên quan tới nhóm các
phương pháp ñông lạnh khác nhau, mà mục ñích chính của phương pháp này là ñảm
bảo tới mức tối ña sự ñông ñặc không tạo ñá của toàn bộ dung dịch chứa mẫu khi
nhiệt ñộ ñược hạ thấp. Lợi ích chính của quá trình thủy tinh hóa là không gây tổn
thương cho tế bào trứng trong quá trình ñông lạnh. Đông lạnh tế bào trứng theo
phương pháp thủy tinh hóa hiện nay là một phương pháp rất phổ biến vì có thể loại
trừ ñược việc hình thành tinh thể ñá bên trong tế bào bằng cách sử dụng các chất bảo
quản lạnh có nồng ñộ cao do tính nhầy của chúng làm cho nước bị ñông ñặc nhưng
không có sự giãn nở. Đã có nhiều báo cáo về sự thành công của việc bảo quản lạnh tế
bào trứng của một số loài ñộng vật bằng phương pháp thủy tinh hóa như là chuột
(Edashige và cs., 2003); người (Katayama và cs., 2003); bò (Luna và cs., 2001); lợn
(Huang và Holtz, 2002); ngựa (Hurtl và cs., 2000); trâu (Dhali và cs., 2000; Hufana
và cs., 2004).
Tại Việt Nam, ñông lạnh tế bào trứng vẫn còn là một lĩnh vực cần có nhiều
nghiên cứu, ñặc biệt là trứng của ñộng vật lớn trong ñó có tế bào trứng trâu. Việc
ñông lạnh thành công tế bào trứng trâu có một ý nghĩa rất lớn ñối với việc bảo tồn
nguồn gen và tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu quá trình phát triển và lai tạo
giống. Mục ñích chính của nghiên cứu này là ñánh giá ñược khả năng sống của tế bào
trứng trâu thành thục và chưa thành thục sau ñông lạnh-giải ñông.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Khai thác và thu tế bào trứng trâu
Buồng trứng trâu thu ở lò mổ ñược bảo quản trong dung dịch PBS có bổ sung
0.1% antibiotic, nhiệt ñộ 32-37
o
C, ñưa ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3h.
Thu tế bào trứng trâu từ những nang trứng 3-8mm của buồng trứng bằng phương
pháp chọc hút. Lựa chọn những tế bào trứng loại A, B với khối tế bào chất ñồng nhất
và 3 lớp màng cumulus trở nên . Các tế bào trứng này sẽ ñược chia làm 3 nhóm:
nhóm 1 ñược thủy tinh hóa ngay sau khi thu; nhóm 2 ñược thủy tinh hóa sau 24h nuôi
thành thục; nhóm 3 ñược nuôi thành thục 24h ñể làm ñối chứng.

2.2. Nuôi thành thục trứng trâu in vitro
Môi trường nuôi tế bào trứng trâu thành thục in vitro gồm có: Hams F-10 +
10% FCS + 5µg/ml FSH + 0.1% dung dịch antibiotic (100 000 iu Penicilin + 0.1g
Streptomycin/ml) .Những tế bào trứng trâu loại A, B sau khi lựa chọn sẽ ñược rửa
trong môi trường nuôi thành thục in vitro 3 lần, rồi chuyển vào ñĩa có chứa giọt nuôi,
nuôi 24h trong ñiều kiện 5% CO
2
và 38.5
o
C. Tỷ lệ thành thục ñược kiểm tra bằng
phương pháp nhuộm nhân tế bào với sự xuất hiện thể cực thứ nhất.
2.3. Đông lạnh tế bào trứng trâu bằng phương pháp thủy tinh hóa
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp thuỷ tinh hoá của
Yadav và cs., 2008 có cải biến)
2.3.1. Môi trường thủy tinh hóa
- Môi trường thuỷ tinh hoá VS (TCM 199 + 6M EG + 0.5M sucrose + 0.4%
BSA), môi trường trước cân bằng (TCM 199 + 50% VS).
2.3.2. Đông lạnh tế bào trứng trâu
- Các tế bào trứng ñược cho vào môi trường trước cân bằng ở nhiệt ñộ phòng
trong vòng 3-5 phút, sau ñó chuyển vào môi trường thủy tinh hóa và ñược hút ngay
vào cọng rạ ñể ở nhiệt ñộ phòng trong vòng 1 phút. Sau ñó cọng rạ ñược nhúng ngập
trực tiếp vào trong dung dịch ni tơ lỏng.
2.4. Gi i ông tế bào trứng trâu
- Sau 2 tuần bảo quản trong ni tơ lỏng các tế bào trứng trâu thành thục in vitro
sẽ ñược giải ñông,và ñánh giá khả năng sống sau ñông lạnh-giải ñông bằng phương
pháp nhuộm nhân tế bào và quan sát hình thái. Kiểm tra hình thái của chúng bằng
kính hiển vi soi nổi và kính hiển vi huỳnh quang. Những tế bào trứng trâu khi quan
sát dưới kính hiển vi soi nổi có hình thái bình thường, các lớp tế bào hạt (cumulus)
sáng, giãn nở trở lại, khối tế bào chất ñồng nhất chặt chẽ sẽ ñược tiếp tục kiểm tra
bằng nuôi thành thục in vitro 24h (ñối với trứng chưa thành thục) và nhuộm nhân tế

bào sau ñó (ñối với trứng thành thục in vitro). Những tế bào trứng trâu thành thục in
vitro có khả năng sống sau ñông lạnh-giải ñông là những tế bào trứng sau giải ñông
không xuất hiện những tổn thương về mặt hình thái: lớp tế bào hạt sáng và giãn nở trở
lại, có màng sáng (zona pellucida) và nhiễm sắc thể không bị ñứt gãy, màng tế bào
chất và tế bào chất còn nguyên vẹn, ñồng ñều.
- Số liệu ñược phân tích thống kê theo chuẩn χ
2
.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Đánh giá chất lượng hình thái của tế bào trứng trâu sau ñông lạnh-giải ñông
Tỷ lệ tế bào trứng thu ñược sau ñông lạnh-giải ñông (ĐL-GĐ) ñối với
trứng thành thục và chưa thành thục trong nghiên cứu này tương ứng là 96.15% và
82.05%. Tỷ lệ thu ñược tế bào trứng sau ñông lạnh-giải ñông ñược báo cáo là 80-
100% ở các loài khác nhau (Nowshari và cs., 1994; Men và cs., 2002; Atabay và cs.,
2004), ñiều ñó cũng phù hợp với kết quả của nghiên cứu này. Việc mất một số tế bào
trứng trong quá trình ñông lạnh - giải ñông cũng có một vài báo cáo ñưa ra (Dhali và
cs., 2000; Luna và cs., 2001; Isachenko và cs., 2005). Nguyên nhân có thể là do tế bào
trứng bị dính vào cọng rạ do bề mặt rạn hoặc ghồ ghề (ñiều này thường xảy ra trong
quá trình giải ñông) hoặc trứng bị tan rã khi bị ñông lạnh không ñúng cách.
B ng 1. Chất lượng tế bào trứng trâu dựa vào hình thái ngay sau ĐL-GĐ
Số lư
ợng trứng

Giai ño
ạn
Trứng ñư
ợc
thủy tinh
hóa
Số tbt thu ñược

sau ĐL-GĐ (%)

Số tbt có hình
thái không thay
ñổi sau ĐL-GĐ
(%)
Số tbt bị tổn
thương sau ĐL-
GĐ (%)
Chưa thành th
ục 156
128
(82.05±5.88)
b
90 (70.31±7.8)
d
38 (29.69)

Thành th
ục 156
150
(96.15±2.77)
a
115 (76.67±6.7)
c

35 (23.33)
a;b
: Các giá trị trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa (p<0.05)
c;d

: Các giá trị trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa (p< 0.05)

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ trứng trâu có hình thái không bị biến ñổi
sau ñông lạnh-giải ñông ( số trứng có hình thái bình thường/số trứng thu ñược) trong
lô trứng thành thục có tỷ lệ cao hơn so với lô trứng chưa thành thục (tương ứng là
76.67% và 70.31%). Hong và cs., (1999) ñã báo cáo rằng tỷ lệ trứng người chưa
thành thục có hình thái bình thường sau ñông lạnh-giải ñông là rất cao (84%). Theo
báo cáo của Lim và cs., (1999); Arav và cs., 2000; Hochi và cs., 2000 thì tỷ lệ trứng
bò thành thục có hình thái không thay ñổi sau ñông lạnh-giải ñông (70-90%) là cao
hơn so với trứng chưa thành thục (23–33%) (Fuku và cs., 1995). Tuy nhiên Martino
và cs., (1996); cũng như Albarracin và cs., (2005) lại báo cáo rằng tỷ lệ này ở trứng
bò thành thục là thấp hơn so với chưa thành thục. Trong khi ñó theo Yadav và cs.,
(2008) tỷ lệ trứng trâu nước chưa thành thục có hình thái không bị biến ñổi sau ñông
lạnh-giải ñông là rất cao (90.56%). Điều ñó cho thấy số lượng trứng thành thục và
chưa thành thục ñược bảo quản lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa có hình thái
không thay ñổi sau ñông lạnh-giải ñông là khác nhau ñối với mỗi loài.


Hình 1. Trứng có hình thái thay ñổi sau Hình 2.Trứng có hình thái không thay
ĐL-GĐ ñổi sau
3.2. Đánh giá kh
năng sống sau ñông lạnh-giải ñông của tế bào trứng trâu
thành thục in vitro
Quá trình ñông lạnh sẽ làm tổn thương ñến cấu trúc vi ống của tế bào trứng.
Sự bất thường trong sợi thoi vô sắc dẫn ñến sự phân tán nhiễm sắc thể, do ñó tế bào
trứng thành thục sau ñông lạnh-giải ñông sẽ không thực hiện ñược sự thụ tinh một
cách bình thường và không hoàn thiện ñược sự phát triển. Kết hợp với việc ñánh giá
chất lượng trứng dựa trên hình thái chúng tôi còn kiểm tra sự ổn ñịnh của bộ nhiễm
sắc thể và thoi phân bào vì ñây là nhân tố tiên quyết ñảm bảo trứng thành thục có khả
năng sống sau ñông lạnh-giải ñông hay không.

B ng 2. Chất lượng nhiễm sắc thể của các tế bào trứng trâu thành thục in vitro có
hình thái không thay ñổi sau ñông lạnh-giải ñông

Số tbt có hình thái bình thường
Số tbt thu ñược
sau ĐL-GĐ
Nhiễm sắc thể không bị tổn
thương
Nhiễm sắc thể bị ñứt gãy phân
tán
n n % n %
150 113 75.33±6.7

2 1.33



Hình 3.Trứng trâu thành thục có nhiễm sắc thể bị tổn thương sau ñông lạnh-giải
ñông
Những trứng có thể phát triển ñược sau ñông lạnh-giải ñông phải có bộ nhiễm
sắc thể tập trung với các nhiễm sắc thể rõ nét thường nằm lệch về một phía của trứng
hoặc gần với màng sinh chất. Những trứng không còn khả năng phát triển khi có các
nhiễm sắc thể phân tán hoặc quá co cụm, nhiễm sắc thể bị phân rã hoặc không còn giữ
ñược hình dạng ñặc trưng. Tỷ lệ trứng thành thục có khả năng sống sau ñông lạnh-
giải ñông trong nghiên cứu của chúng tôi là 75.33%.

Hình 4.Trứng trâu thành thục có nhiễm s c th không b tổn thương sau ĐL-GĐ
3.3. Đánh giá kh
năng sống sau ñông lạnh-giải ñông của tế bào trứng trâu chưa
thành thục

Các t
bào trứng chưa thành thục có hình thái bình thường sau ñông lạnh-giải
ñông trong nghiên cứu này có tỷ lệ thành thục thấp hơn so với ñối chứng (31.1% so
với 65.45%) nhưng có phần cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Hammam và cs.,
(2005) (30.0%), Yadav và cs., (2008) (21.17%). Nguyên nhân có thể là do quá trình
thủy tinh hóa tác ñộng lên sợi thoi vô sắc và các tế bào hạt cumulus. Khi sợi thoi vô
sắc bị phá hủy nó sẽ làm giảm sự hoàn thiện quá trình thành thục, sự hình thành thể
cực thứ nhất, sự di chuyển của tiền nhân (Carroll và cs., 1993). Thêm vào ñó, việc
bảo quản lạnh thành công trứng chưa thành thục phụ thuộc nhiều vào khả năng lưu
giữ tính nguyên vẹn về mặt cấu trúc và chức năng của toàn bộ tế bào trứng và lớp
cumulus bao xung quanh tế bào trứng. Cầu nối giữa trứng và tế bào cumulus có một
vai trò quan trọng trong quá trình thành thục bởi vì nó cung cấp cơ chất dinh dưỡng
có tầm quan trọng trong suốt quá trình thành thục của tế bào trứng. Điều ñó cho thấy
rằng trứng chưa thành thục nếu không có tế bào cumulus sẽ không ñủ khả năng thành
thục nhân và tế bào chất.


Hình 5. Trứng trâu chưa thành thục phát triển in vitro sau ñông lạnh-giải ñông
B
ng 3. ả năng thành thục in vitro của trứng trâu chưa thành thục sau ĐL-GĐ
Trứng Số trứng ñược nuôi in vitro (n) Số trứng thành thục (%)
Chưa thành thục 90 28 (31.1±9.5)
b
Đối chứng 110 72 (65.45±8.8)
a
a;b
: Các giá trị trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa (p<0.05)
4. Kết luận
Với những kết quả ñạt ñược của nghiên cứu này cho thấy khả năng bảo quản
lạnh tế bào trứng trâu thành thục in vitro và chưa thành thục bằng phương pháp thủy

tinh hóa tại Việt Nam bước ñầu ñã thành công. Từ ñó có thể mở rộng hướng nghiên
cứu sâu hơn về lĩnh vực ñông lạnh tế bào trứng ñộng vật nói chung và tế bào trứng
trâu nói riêng.
Tài liệu tham khảo
Albarraci
J.L Morat R zquierdo D. and Mogas, T., 2005a.Vitrification of calf
oocytes: effects of maturation stage and prematuration treatment on the nuclear and
cytoskeletal components of oocytes and their subsequent development. Molecular
Reproduction and Development, 72(2), 239–249
1. Albarracin, J.L., Morato, R., Rojas, C. and Mogas, T., 2005b. Effects of
vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertal
and adult bovine oocytes. Theriogenology, 63(3), 890–901
2. Atabay, E.C., Takahashi,Y., Katagiri, S., Nagano, M.,Koga, A. and Kanai,Y.,
2004. Vitrification of bovine oocytes and its application to intergeneric somatic
cell nucleus transfer. Theriogenology, 61(1), 15–23
3. Arav, A., Zeron, Y. and Ocheretny, A., 2000. A new device and method for
vitrification increases the cooling rates and allows successful cryopreservation of
bovine oocytes. Theriogenology, 53, 248 (Abstract)
4. Carroll, J., Wood, M.J. and Whittingham, D.G., 1993. Normal fertilization and
development of frozenthawed mouse oocytes: protective action of certain macro-
molecules. Biology of Reproduction, 48, 606–612
5. Dhali, A., Manik, R.S., Das, S.K., Singla, S.K. and Palta, P., 2000. Vitrification of
buffalo (Bubalus bubalis) oocytes. Theriogenology, 53, 1295–1303
6. Edashige, K., Yamaji, Y., Kleinhans, F.W. and Kasai, M., 2003. Artificial
expression of Aquaporin-3 improves the survival of mouse oocytes after
cryopreservation. Biology of Reproduction, 68, 87–94
7. Fuku, E., Xia, L. andDowney, B.R., 1995. Ultrastructural changes in bovines
oocytes cryopreserved by vitrification. Cryobiology, 32, 139–156
8. Hochi, S., Akiyama, M., Kimura, K. and Hanada, A., 2000. Vitrification of in
vitro matured bovine oocytes in open-pulled glass capillaries of different

diameters. Theriogenology, 53, 255 (Abstract)
9. Hong, S.W., Chung, H.M., Lim, J.M., Ko, J.J., Yoon, T.K., Yee, B. and Cha, K.Y.,
1999. Improved human oocytes development after vitrification: a comparision of
thawing methods. Fertility and Sterility, 72, 142–146
10. Huang, W.T. and Holtz, W., 2002. Effects of meiotic stages, cryoprotectants,
cooling and vitrification on cryopreservation of porcine oocytes. Asian
Australasian Journal of Animal Science, 15, 485–493
11. Hufana-Duran, D., Pedro, P.B., Venturina, H.V., Hufana, R.D., Salazar, A.L.,
Duran, P.G. and Cruz, L.C., 2004. Post-warming hatching and birth of live calves
following transfer of in vitro-derived vitrified water buffalo. Theriogenology,
61(7–8), 1429–1439
12. Hurtt, A.E., Landim-Alvarenga, F., Seidel, G.E. and Squires, E.L., 2000.
Vitrification of immature and mature equine and bovine oocytes in ethylene
glycol, Ficoll and sucrose solution using open-pulled straws. Theriogenology, 54,
119–128
13. Isachenko,V., Montag, M., Isachenko, E., Zaeva,V., Krivokhachenko, I., Shafei, R.
andVanderven, H., 2005. Aseptic technology of vitrification of human pronuclear
oocytes using open-pulled starws. Human Reproduction, 20(2), 492–496
14. Katayama, K.P., Stehlik, J., Kuwayana, M., Kato, O. and Stehlik, E., 2003. High
survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertility and
Sterility, 80, 223–224
15. Lim, J.M., Ko, J.J., Hwang, W.S., Chung, H.M. and Niwa, K., 1999. Development
of in vitro matured bovine oocytes after cryopreservation with different
cryoprotectants. Theriogenology, 51, 1303–1310
16. Luna, H.S., Ferrari, I. and Rompf, R., 2001. Influence of maturation of bovine
oocytes at time of vitrification on the incidence of diploid metaphase II at
completion of maturation. Animal Reproduction Science, 68, 23–28
17. Martino, A., Songsasen, N. and Leibo, S.P., 1996. Development into blastocysts of
bovine oocytes cyropreserved by ultra rapid cooling. Biology of Reproduction, 54,
1059–1069

18. Men, H., Monson, R.L. and Rutledge, J.J., 2002. Effect of meiotic stages and
maturation protocols on bovine oocyte’s resistance to cryopreservation.
Theriogenology, 57(3), 1095–1103
19. M. Hammam, A. M; El- Shahat K.H., 2005. Vitrification of immature and mature
buffalo oocytes in glycerol solution by a simple method. ISAH , Vol 1 (252-255)
20. Nowshari, M.A., Nayudu, P.L. and Hodges, J.K., 1994. Effect of cryoprotectant
concentration, equilibration time and thawing procedure on survival and
development of rapid frozen-thawed mouse oocytes. Theriogenology, 42, 1193–
1204
21. Yadav.R.C, Sharma. A, Grarg. N, Purohit G.N., 2008. Survival of vitrified water
buffalo cumulus oocytes complexes and their subsequent development invitro.
Bulgarian Juornal of Veterinary Medicine. 11, No1, 55-64.