xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi














ALPHA GLOBIN







 

- 2014


















ALPHA GLOBIN



Chuyên ngành: 
: 60 42 01 21

 

: 


- 2014





LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất
tới PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em
thực hiện đề tài. Cô không chỉ truyền thụ cho em nhiều kiến thức về chuyên môn mà
còn giúp em bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu
khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp em
tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Em cũng xin trân trọng cảm ơn
ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành cho em nhiều lời khuyên quý báu
trong những lúc em gặp khó khăn.
Về phía nhà trường, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh
học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu; em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền
học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều
kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ. Em cũng xin cảm ơn Phòng thí
nghiệm Sinh Y, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein là nơi em
thực hiện đề tài nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ.
Về phía cơ quan, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Khoa Di
truyền & SHPT, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương là nơi em đang công tác.
Các anh chị luôn chia sẻ với em trong công việc, thường xuyên động viên về tinh thần
giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Những kiến thức chuyên
môn anh chị chia sẻ đã giúp em hoàn thiện luận văn tốt nhất có thể.

Em xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà và các bạn sinh viên Phòng thí
nghiệm Sinh Y đã giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt em xin cảm
ơn ThS. Nguyễn Thị Thu Hường đã luôn kề bên động viên tinh thần, giúp đỡ tận
tình mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn cũng như những
vấn đề trong cuộc sống.




Lời cuối em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, người thân và bạn bè luôn ủng hộ,
giúp đỡ em rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng năm 2014
Học viên





Trần Tuấn Anh




BNG KÝ HIU VÀ CH VIT TT
Vit tt

Vi
ADN
:

Acid Deoxyribonucleic
ARN
:
Acid Ribonucleic
bp
:
Base pair
dNTP
:
Deoxynucleotide Triphosphates
G6PD
:
Glucose-6-phosphate dehydrogenase
kb
:
Kilobase
MCH
:
Mean Cell Hemoglobin
MCV
:
Mean Corpuscular Hemoglobin
PCR
:
Polymerase Chain Reaction
WHO
:
World Health Organization

DANH MC CÁC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
Hình 1.
α-globin 
(16p13.3)
9
Hình 2.

+
-thalassemia
10
Hình 3.

+
-thalassemia
11
Hình 4.

o
-
α-globin
12

Hình 5.

15
Hình 6.

thalassemia
23
Hình 7.
 nghiên cu
26
Hình 8.
Kt qu n di ADN tng s trên gel agarose 1%
32
Hình 9.
Kt qu tu kin ni kim LIS
33
Hình 10.
Kt qu sàng lt bin
SEA

34
Hình 11.
Kt qu sàng lt bin
THAI

35
Hình 12.
Kt qu sàng lc và tu kin phn i
n -
3.7

n -
4.2
(B)
36
Hình 13.
Kt qu sàng lc khun ln chèn SEA bng cp mi
vector M13-F/R
38
Hình 14.
Kt qu sàng lc khun ln chèn SEA bng cp mi
SEA-F/R
39
Hình 15.
Kt qu sàng lc khun ln chèn 4.2 bng cp mi
vector M13-F/R
39
Hình 16.
Kt qu sàng lc khun ln chèn 4.2 vi cp mi 4.2-F/R
40





STT
Tên hình
Trang
Hình 17.

40

Hình 18.
Kt qu n SEA vi ngân hàng d liu NCBI
41
Hình 19.
Kt qu n 4.2 vi ngân hàng d liu NCBI
42
Hình 20.
Kt qu tu kin phn ng PCR vi hai cp m
44
Hình 21.
Kt qu n di sn phm PCR s dng ba cp m
45
Hình 22.
Kt qu tu kin phn ng PCR s dng ba cp m
SEA
46
Hình 23.
Kt qu n di sn phm PCR s dng bn cp m
và 4.2
48
Hình 24.
Kt qu tu kin phn ng PCR vi m-F mi thit
k
49
Hình 25.
Kt qu kim tra tính nh ca m-F mi thit k
49
Hình 26.
Kt qu tu kin PCR vi 4 cp mi có b sung DMSO
51

Hình 27.
Kt qu sàng ti 5 cp m
52
Hình 28.
Kt qu PCR mt s mt bin vi quy i
t
53





DANH MC CÁC BNG
STT
Tên bng
Trang
Bng 1.
Trình t các cp mi dùng trong nghiên cc sn phm
ng
24
Bng 2.
Thành phu kin phn m

28
Bng 3.
Thành phu kin nt bin vào vector pTZ5T-R/T
37
Bng 4.
Thành phu kin sàng lc khun lc vi cp mi vector
M13-F/R

38
Bng 5.
Thành phu kin phn ng PCR s dng hai cp mi LIS và

43
Bng 6.
Thành phu kin phn ng PCR s dng ba cp m
và SEA
45
Bng 7.
Thành phu kin phn ng PCR t dng ba cp mi

46
Bng 8.
Thành phu kin phn ng PCR s dng bn cp mi LIS,

47
Bng 9.
Thành phu kin phn i có b sung DMSO
50
Bng 10.
Thành phu kin tn ng PCR s dng 5 cp
m
52
Bng 11.
Tng hp s lit bin
66

MC LC
 1
NG QUAN TÀI LIU 3
1.1.  QUAN   ALPHA THALASSEMIA 3
 3
 3
 5
 8
1.1.4.1. Cu trúc và t chc cm gen globin  i 8
 t bin 9
1.2. SÀNG   MANG GEN VÀ    ALPHA
THALASSEMIA 13
 13
 16
t hc 16
1.2.2.2. Phân tích thành phn hemoglobin 17
1.2.2.3. Phân tích t l tng hp chui alpha/beta-globin 17
c phân t 18
1.3.  PHÁP PCR   TRONG    ALPHA
THALASSEMIA 19
IÊN CU 22
2.1. NGUYÊN  HÓA  VÀ   22
ng nghiên cu 22
2.1.2. Hóa cht 22

2.1.3. Các cp mi 23
2.1.4. Thit b 24
2.2.  PHÁP NGHIÊN  25
2.2. nghiên cu 25
nh n ADN b 27
2.2.3. K thui 27
n di 28
2.2.5.  28
2.2.5.1. Bin np bng sc nhit 29
2.2.5.2. Sàng lc khun lc và nuôi t bào bão hòa 29
2.2.5.3. Tách plasmid 30
T QU VÀ THO LUN 31
3.1.   NHÓM  NHÂN NGHIÊN  31
3.2.   SÀNG     32
3.2.1. Sàng lc mn SEA 33
3.2.2. Sàng lc hai mn THAI, FIL 34
-- 35
3.3. BIN NP, TÁCH DÒNG VÀ GII TRÌNH T N T BIN 37
3.3.1. Kt qu sàng lc khun lc t bin SEA 37
3.3.2. Kt qu sàng lc khun ln t bin 4.2 39
3.3.3. Kt qu gii trình t t bin 40
3.4. KT QU TI  HÓA U KIN PHN NG PCR  MI 43
3.4.1. Ti cp m 43




3.4.2. Ti 3 cp m 44
3.4.3. Ti 4 cp m 47

3.4.4. Ti 5 cp m 51
3.5. KT QU PHÁT HIN T BIN BNG PCR  MI
53
3.6. THO LUN
54
T LUN VÀ KIN NGH 61
TÀI LIU THAM KHO 62
 62
 62
Ph lc 1 - Kt qu gii trình t n t bin SEA 69
Ph lc 2 - Kt qu gii trình t n t bin 4.2 70
Ph lc 3 - Kt qu phát hit bin trên 100 mu bng k thui 71
Ph lc 4 - Bng tng hp kt qu xét nghim cn lâm sàng 74
Ph lc 5 - Nht bi-thalassemia 79
Ph lc 6 - Nht bin alpha-thalassemia trong khu v 80


1


 6%) 
 
 
      1.040.       
  
             
.
            hình 
trên                
        ng.      

thalassemia, tính  gen  
mang gen . 
gá 
     halassemia
 trong  và 
Theo , v
    . 
   mà              
xét  gen . 
  
T u nghiên cu công b v vic
phát hin ng thi nhiu mn ln trên cm gen α-globin trong mt phn ng
i. Tuy nhiên nhng nghiên c cp n cách thc t
hóa phn i cho vùng giàu trình t m gen α-globin.



2

Vì vy chúng tôi thc hi tài t bin gen alpha globin gây
bnh thalassemia bng k thu vi m
nguyên lý k thu thit k nhiu cp mi cho mt phn ng, vic ti 
phn ng PCR trên nhng vùng trình t  quy trình t
 l t bing nghiên cu.  tài nghiên cc thc hin
ti Phòng thí nghim Sinh Y thuc Khoa Sinh hc ca i hc Khoa hc
T nhiên và Phòng Genomic thuc Phòng thí nghim Trng m Công ngh
Enzym và Protein.

3



1.1.1. 
Thalassemia            ,
alpha globin (α-globin) beta globin
(-globin).  thalassemia          
Xy-ri - 
10]. Do ,  là
         sau này).   
Wipple và Bradford thành Thalassemia 
 vùng ven 
(   -  có 
 .
c coi là h qu ca mt lot bin gen nhm chng li
bnh st rét.  d hp t thì nhng t bin hay d hp t
t bin có sc sng và kh  ký sinh trùng st rét tt  i bình
nh rt ph bin  các vùng sc nhii và
cn nhia Trung H       c,

Bc M [13].

Hemoglobin (Hb) là phân t có vai trò mang và vn chuyn oxy trong .
Mt phân t Hb ng (HbA) c cu thành t 2 chu-globin liên kt vi
2 chu-globin và bn nhân Hem có kh n chuyc bn phân t oxy.
 -globin 
-globin. D  
 


4

 

chúng  
                 
màng   
   làm
 


    . 

 [65].    
  
 

Ngày nay, b halassemia  xem là     
 trong
 

 [65].
  mang gen   10 % , 
   80  90 %  [25]. 
2001,   7 
 ; m     300.000        halassemia,
 %  65, 66].
    thalassemia         
  . N   
          cao: alpha thalassemia (-
thalassemia)   1 %, beta thalassemia (-thalassemia)   4   


5

[48]2 trong 
5, gen   2.mang gen 
1, (430 mang -thalassemia, 520 -thalassemia/HbE,
1,050 HbH, 435 Hb Bart) [48]. 2,1 -thalassemia và 62 %
-thalassemia (trong halassemia)
             -thalassemia trong

1.1.3. Balpha t
ng có 4 alen trên 2 nhim sc th c kí hiu là
n alen này chu trách nhim tng hp nên chu-globin. Chu-globin
c tng hp tham gia cu thành mt s phân t hemoglobin bao gm: HbA 
 ng thành (alpha2 beta2), HbF trong bào thai (alpha2 gamma2) và mt
ng nh Hb (alpha2 delta2). t bin xy ra trên cm gen α-globin làm gim
hoc mt tng hp chu-globin là nguyên nhân gây ra bnh -thalasemia. c
m lâm sàng ca b-c báo cáo lu tiên vào cui nhng
u i nhng bng v hemoglobin liên quan ti bnh

thiu máu hng cu nh, hng cu c sng hp không thiu st [41,
46, 53].  m lâm sàng, cn lâm sàng và s ng alen b t bin,
b-c chia thành 4 th bnh, c th 
i mang -thalassemia th n phn ln là do mt mt alen (- c
m cn lâm sàng  tr  sinh là huyt sc t 
4
 (1 - 2 %) do
chui gamma   a so vi chui alpha. Còn   ng thành có c
 hng cu nh  c sc va phi, ng Hb    ng.
-thalassemia th n không phi s dng các liu pháp u tr.
Bnh -thalassemia th nh  ng hp còn hai alen có ch . Hai
alen còn li có th trên cùng mt nhim sc th -thalassemia) - ph bin 
    hoc trên hai nhim sc th -thalassemia) - ph


6

bin  Châu Phi [32]. Bnh có biu hin thiu máu nh và i ng Hb
Bart 
4
)  tr ; t l Hb ng  ng thành và
t l tng hp chui /-globin gim còn 0,7 - 0,8. ng hp mc b-
thalassemia th nh ng có kiu gen ng hp t mt bim hoc d hp
t mt bim kt hp vi mn 1 gen [20]. nh nhân mang mt
t bim ng hp t lâm sàng ca bnh HbH th nh nng
hp ng hp t t bin Hb Constant Spring là t bin m ph bin  c
châu Á [19, 52].
Bnh HbH là tình trng ch còn li mt alen có ch, ng do t bin
mt 3 alen ( /-c mt 2 gen  kt hp vi mt t bin m ( 
ND

, dn
n tha chui -globin và hình thành nên huyt sc t bng HbH 
4
).
Dng bnh có t bim kt hp ng có m lâm sàng nng
mt 3 gen. Theo báo cáo thng kê t nh nhân ti bnh vin Siriraj (Thái
Lan), tn sut bt bin m (60 t bin mn (40 %)
[63]. m lâm sàng ca bnh HbH t nh n rt nng là hi chng phù thai
HbH. Hi chng này c quan sát  s ng hp t bin mn 2
gen kt hp vi mt bin m ti codon 31 (GA) hoc codon 59 (GA), tuy
 nhng hiu bit rõ ràng v hi chng này. Cu trúc phân t huyt sc
t HbH không nh và ch yu b ta trong t bào hng cu ( dng th vùi) sau
 phá hy sm  lách gây nên tình trng tan máu [49]. m cn lâm sàng
ca bnh HbH là thiu máu, tan máu hng cu nh, c sc; các thông s t bào
máu: MCH ~ 18 pg, MCV khong 58 fl  tr em và 64 fl  i ln, n
hemoglobin 7 - 10 g/dL và t l hng c i 5  10 %; t l tng hp chui
alpha/beta globin gim còn 0,2  0,6 [19, 26]. m lâm sàng ca bnh là gan
to, lách to, có bin d nhng bnh nhân quá ti s  ng
hp quá ti st ch gp  nhi bnh ln tui do vic truyn máu lp li hoc
p thu st. i bnh mang thai, tình trng thiu máu có th x
 tan máu, có m trùng cao khi s dng thuc oxi hóa. Vì
vy thai ph phi tránh vic dùng thuc oxi hóa trong thai k [39].


7

Hi chng phù thai Hb Bart ng gn lin vi s vng mt c 4 alen ( / ).
 yu là huyt sc t 
4
) và

m ng nh Hb Portland 1 và Hb Portland 2 (zeta2 gamma2 và zeta2 beta2).
Bi thiu máu rt nghiêm trng (ng Hb khong 3  8 g/dL); c
m lâm sàng gan to, lách to, phù thai và suy tim [67]. Tr  không thích ng
c vi tình trng này nên ng cht ngay sau khi sinh [67]. Mt s bin chng
ca sn ph bao gm tin sn git,  i (Polyhydramnios) hoc thiu i
(Oligohydramnios) do  c gim tích t dch i, xut huyt, thiu máu và
nhim trùng huyt. Vi m  nghiêm trng ca hi chng này và nhng bin
chng c i m trong thi k mang thai, vic chm dt thai k c khuyn
cáo. Hi chi ph bin  khu v Nam Á, trong khi him
gp  a Trung Hi do tn sut mang 
o
-thalassemia thp [19, 21, 37]. Tuy nhiên,
s di dân trên th gii và tp quán k i chng Hb Bart 
nhiu quc gia và hin tu tr c hiu cho hi chng này.
Phân tích các th bnh trong -thalassemia cho thy a kiu gen
vi c m lâm sàng và cn lâm sàng bnh rt phc tp. M   
không ch  n là kiu gen quy nh c m lâm sàng và không ch liên
n 2 gen α-globin n c nhng gen khác trong cm gen α-
globin  zeta mã hóa cho Hb Portland và gen theta 
, r phân bit rõ ràng nhng khác bit lâm sàng da vào s ng gen b
mt hoc không có chVí d  ng hp t mn 
SEA
(mt c 4 gen
) là nguyên nhân gây phù thai khá ph bin  khu vc   , tuy nhiên
ng hemoglobin bào thai (Hb Portland 1 và Hb Portland 2) v ch
thai tip tc phát trin. Trong khi, dng ng hp t t bin (
FIL
hoc
THAI
) mt

  t c gen zeta do vy mà không sn xuc Hb Portland, cho nên
phi s thai ngay nh  tránh nguy him cho thai ph [7, 26].



8

Vi s t bin gây bnh ln, t hp các gen t bin hình thành nhiu
m ng thì vic phân loi bnh không th ch dm
 có chnh chính xác và có nhng hiu bit th tng
ng hp bnh c th cn ph ng thi nhng biu hin lâm sàng và
 phân t ca bnh.
1.1.4alpha thalassemia
1.1.4.1. 
-globin   gen α1-globin và gen
α2-globin trên  
α-globin  ADN 
1978 [50]. Hình       gen α-globin  2 gen alpha1 và alpha2
mã hóa cho  -globin, 1 gen zeta2 mã hóa cho  -globin trong phôi,
pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2) và 1 gen theta1 
 [40]. Các gen -zeta-alpha2-
alpha1-(
  ]-R1-R4)            [25].
gen α2-globin  - 
α1-globinα-globin
 lâm sàng 
-thalassemia [61].  
  li-thalassemia, n

+

--globin 
o
-
thalassemia).


9


Hình 1.  α-globin   16 (16p13.3)
g-globin - alpha1 và alpha2, 1 gen zeta2 mã hóa cho
-pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2)
và 1 gen 4, 40].
1.1.4.2. 
lpha
+
-thalassemia do 
Hai gen α-globin            cao,
 [28, 40]. cách nhau
     Hình 2. T
 hình thành 
(-
3.7
)  1 gen α-globin -  mang 3 gen
α-globin 
anti3.7
)  
              -
4.2
)  -

thalassemia         
anti4.2
)   
(Hình 3) [31, 60]. -
3.7
và -
4.2
-thalassemia
 .   
 gây 
+
-thalassemia Hình 2 và
                 vài
 khác [29].

Nhim sc th 16
Cm gen α-globin


10


Hình 2. 
+
-
                


      α-globin         gen α2-globin;



+
-
  -  
     
 
+
-        -   
             
+
-thalassemia) có
    α-globin
  
IVSI(-5)
   
2
AATAAG
,

2
AATGAA

2
AATA
30, 
      ing (HbCS), Hb Icaria, Hb


Hb Petah Tikvah, Hb Adana, Hb Aghia Sophia [22, 33, 54, 59] 5).

11


Hình 3.  hình thành 
+
-thalassemia. 
 
3.7
và
    
anti3.7
           
 
4.2
 
anti4.2
[29].
lpha
o
-thalassemia do 
   (gây 
o
-thalassemia) 2 gen α-globin
 α-globin. 

o
-
cân [36 phát sinh có th  
 trong   ,           

phát sinh alpha
+
-thalassemia. Khi  trình    α-globin   
 
  3 x 10
5
là
 α-globin thì        ¼
  [14]. Ngoài ra,     còn 
i chéo không cân vùng X

i chéo không cân vùng Z


12

    khác  có           
  motif     
MED

 tái 
ADN  rõ  vùng
 
MED
và các 
o
-thalassemia khác [29].

Hình 4.     
o

-        α-
globin. (MLPA probes) 
 
 gãy [29].



13

1.2.      VÀ    ALPHA
THALASSEMIA
1.2.1. C thalassemia
              
  
có   
     .  
             [1, 33, 62], chúng tôi
               ,
 trong Hình 5.   3
  1 -   là phân tích các
   (DCIP),  giá
 ). Giai  2 - Phân tích hemoglobin (HPLC) 
  3 -  


- 
M  là 
    
 
trung bình MCV > 80 fl, MCH > 27 pg,

            3,5  5 %.   
  
1 gen α-globin 
+
-thalassemia)

  2 [1, 56, 62].



14

- Phân tích hemoglobin
  phân tích
   các
           2,0  3,2 %.
 > 3,5 % thì  mang -thalassemia
này               
 , thì t
     gen,
 [1, 3, 56, 62].
 3 - 
   < 3,2           α-
globin. Hb > 3,5 % 
β-globin,   β-globin 
 α-globin. T
        trên gen α-globin;     
                
              gen β-globin.
                 

codon 26 gen β-globin

 
              
 
 [1, 3, 56, 62] .