Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định TYP vi rut lở mồm long móng (LMLM)

Bộ KH CN
Viện Thú y
Bộ KH CN
Viện Thú y

Bộ khoa học, công nghệ và môi trờng
Viện Thú Y
86, Đờng Trờng Chinh - Đống Đa Hà Nội


Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06:

Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất
vacxin nhợc độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia

súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác
định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM)


Chủ nhiệm đề tài: TS. Tô Long Thành



6102
19/9/2006

Hà Nội 2005


Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y.
Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trởng Viện Thú y
trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu.

Bộ KH CN
Viện Thú y

NTTULIB
Mục lục


Trang
Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06
2
Danh sách cán bộ tham gia
3

Danh sách các đon vị tham gia, phối hợp
5
tóm tắt Báo cáo
6
Những từ viết tắt
13
Lời nói đầu
14
Chơng I Tổng quan tài liệu
24

1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò
24

1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng
24

1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới
24

1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam
25

1.1.2. Tóm lợc về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng
26

1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida
27

1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida

27

1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn
27

1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn.
28

1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida
28

1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida
31

1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida
32

1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida
32

1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida
33

1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen).
33

1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen.
34

1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida.

35

1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella
spp gây ra ở gia cầm.
37

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella.
37

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nớc.
39

1.2.3. Đặc điểm của Salmonella.
41

1.2.4. Tình trạng ngộ độc thức ăn do Salmonella.
41

1.2.5. Biện pháp phòng bệnh.
42

1.2.6. vắc-xin chống Salmonella cho gà
43

1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella
43

1.2.6.2. Sơ lợc về kháng nguyên roi của S. typhimurium
44

1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có
khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella.
45

NTTULIB

1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin
46

1.3. Bệnh Lở mồm Long móng
47


1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình
nghiên cứu về bệnh trong, ngoài nớc.
47


1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh
trên thế giới và ở Việt Nam.
47


1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới.
49


1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong nớc.
51

1.3.2. Vi rút gây bệnh LMLM.
52


1.3.2.1. Hình thái học.
52


1.3.2.2. Sức đề kháng của vi rút.
52


1.3.2.3. Đặc tính nuôi cấy.
52


1.3.3. Các phơng pháp chẩn đoán.
53


1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng.
53


1.3.3.2. Đại cơng về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm.
53


1.3.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học.

54


1.3.3.3.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)
54


1.3.3.3.2. Phản ứng trung hoà vi rút.
55


1.3.3.3.3. Phản ứng ELISA.
55


1.3.3.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác
56


1.3.3.4. Chẩn đoán vi rút học.
56


1.3.3.5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR.
56
Chơng II: Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu
58

A. Nguyên liệu
58

2.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng
chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lợng cao.
58


2.1.1. Động vật thí nghiệm.
58


2.1.2. Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng.
58


2.1.3. Dụng cụ máy móc thí nghiệm.
58


2.1.4. Môi trờng, hoá chất
58

2.2. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và
S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn.
59


2.2.1. Động vật và sản phẩm động vật.
59

2.2.2. Các loại môi trờng thông thờng.
59


2.2.3. Các loại môi trờng chuyên biết.
60


2.2.4. Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác.
62

2.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và
S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp.
62


2.3.1. Chủng vi sinh vật.
62


2.3.2. Động vật.
62


2.3.3. Plasmid.
62

NTTULIB

2.3.4. Môi trờng nuôi cấy.
63


2.3.5 Các dung dịch.
63

2.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR.
64


2.4.1. Bệnh phẩm.
64


2.4.2. Nguồn bệnh phẩm.
64


2.4.3. Dung dịch bảo quản bệnh phẩm.
64


2.4.4. Tế bào BHK- 21 và môi trờng nuôi cấy tế bào.
65


2.4.5. Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RT-
P
CR.

65

2.4.5.1. Mẫu ARN chuẩn.
65

2.4.5.2. Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RT-
PCR.
65

2.4.5.3. Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng
(cloning).
65

2.4.5.4. Thiết bị, máy móc.
66


2.4.5.5. Các cặp mồi đặc hiệu với vi rút LMLM type O, A , C hoặc Asia-1.
66
B. Phơng pháp nghiên cứu
66

3.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ
huyết trùng trâu bò chất lợng cao.
66


3.1.1. Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất
vacxin.
66

3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi
khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR.
67


3.1.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn đối với chuột nhắt trắng.
69


3.1.4. Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn Saponin.
71

3.1.5. Kiểm nghiệm vắc xin
72

3.1.5.1. Kiểm tra vô trùng vắc xin.
72

3.1.5.2 Kiểm tra an toàn vacxin
72

3.1.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin.
72

3.1.5.3.1. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm.
72

3.1.5.3.2.

Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò.
72


3.1.6. Phơng pháp xử lý số liệu.
76


3.1.6.1. Phơng pháp tính chỉ số miễn dịch.
76


3.1.6.2. Phơng pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê.
76

3.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium
bằng công nghệ vi khuẩn.
77


3.2.1. Các phơng pháp vi sinh vật học thông thờng.
77


3.2.2. Các phơng pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin.
77

3.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium
bằng vi khuẩn biến nạp.
78

3.3.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn.
78


3.3.2. Phơng pháp tổng hợp chuỗi (PCR).
78

NTTULIB


3.3.3. Xử lý ADN bằng enzym hạn chế.
78


3.3.4. Phản ứng nối ghép gen.
79


3.3.5. Biến nạp vào E. coli.
79


3.3.6. Tách chiết ADN plasmid từ E. coli.
80


3.3.7. Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp.
81

3.3.8. Biến nạp plasmid vào nấm men P. pastoris bằng xung điện.
82


3.3.9. Western Blot, ELISA.
83

3.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR.
84


3.4.1. Các phơng pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của
Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế.
84


3.4.2. Phơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm.
84


3.4.3. Phơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM.
86


3.4.3.1. Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô.
86

3.4.3.2. Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ngợc.
86


3.4.3.3. Phản ứng PCR.
86


3.4.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR.
87


3.4.4. Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O
của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam.
88


3.4.4.1. Lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRR2.1 và biến nạp
vào tế bào khả biến (competent E. coli cells).
88


3.4.4.2. Tách chiết Plasmid.
89


3.4.4.3. Cắt bằng enzym giới hạn.
89

3.4.5. Phơng pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM.
90


3.4.5.1. Phơng pháp nuôi tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney - 21).
90


3.4.5.2. Phơng pháp tách tế bào bám dính.
90


3.4.5.3. Phơng pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHK-21.
90
Chơng III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
92

4.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ
huyết trùng trâu bò chất lợng cao.
92


4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ
trâu bò chết của các địa phơng.
92


4.1.2. Tính tơng đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P. multocida
chủng IR với đại diện các chủng P. multocida phân lập đợc.
95

4.1.3. Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả
năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò.
96


4.1.4. Kết quả xác định công thức bổ trợ thích hợp và theo dõi độ
dài miễn dịch của vắc xin keo phèn-saponin.
97


4.1.5. Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn-
saponin chủng IR.
98


4.1.6. Tính tơng đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida
chủng IR với các chủng P. multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT
trâu bò tại Việt Nam.
99

NTTULIB


4.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium
bằng công nghệ vi khuẩn.
99

4.2.1. Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn
nuôi gà giống.
99


4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp.
100


4.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn
Salmonella phân lập đợc.
102


4.2.4. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập
đợc trên chuột nhắt trắng.
104


4.2.5. Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên
các loại môi trờng dinh dỡng khác nhau.
105


4.2.6. Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella
106


4.2.7. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập
đợc

106


4.2.8. Kết quả xác định LD 50 của các chủng Salmonella phân lập
đợc
107


4.2.9. Sản xuất thử nghiệm vacxin S. enteritidis và S. Typhimurium
vô hoạt keo phèn
108


4.2.10. Kết quả thử thuần khiết vacxin
108


4.2.11. Kết quả thử vô trùng của vacxin
108


4.2.12. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng
109


4.2.13. Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị
110


4.2.14. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng

110


4.2.15. Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà
111


4.2.16. Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin
111

4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium
bằng vi khuẩn biến nạp
113


4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21
113

4.3.1.1. Đa gen vào vectơ pCR2.1
113

4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn
113

4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S.
typhimurium, S. enteritidis

114

4.3.1.1.3. Đa sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1

115


4.3.1.2. Đa gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+)
119


4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21
120


4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong nấm men P. pastoris
122


4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR
122


4.3.2.2. Đa gen vào vectơ tách dòng pCR2.1
123


4.3.2.3. Đa gen vào vectơ biểu hiện pPIC9
123


4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris
125

4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3
126

NTTULIB


4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC
126


4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng
nguyên toàn phần trên gà hậu bị
127


4.3.3.3. Western blot và ELISA
127


4.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3
131


4.3.5. Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3
132

4.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR
134

4.4.1. Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam
trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây

134


4.4.2. Diễn biến lâm sàng của bệnh trên bò và lợn
136


4.4.3. Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc
nghi mắc bệnh

138


4.4.3.1. Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM
138


4.4.3.2. Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM
139


4.4.3.3. Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM
139


4.4.4. Thiết lập phơng pháp RTPCR để phát hiện vi rút
gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết

140


4.4.5. Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập
tại tỉnh Qủang Trị
143


4.4.6. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng
trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM.
145


4.4.7. Kết quả ứng dụng phơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định
typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa
147


4.4.8. Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho
serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị
149


4.4.8.1. Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các
type O, A, C, và asia-1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O

149

4.4.8.2. Kết quả giải trình trình tự nuclêotide
151


4.4.9. Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHK-21
153


4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM
153


4.4.9.2. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21
153


4.4.9.3. Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút
LMLM lên tế bào BHK-21

155


4.4.9.4. So sánh chẩn đoán vi rút LMLM bằng RT-PCR từ bệnh phẩm biểu
mô và từ bệnh phẩm biểu mô đã cấy chuyển trên tế bào

156


4.4.10. So sánh phơng pháp ELISA và RT-PCR để chẩn đoán-
định typ virut LMLM

158


4.4.11. Nhận xét tổng quan về phơng pháp RT-PCR trong
chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM

160
Chơng IVKết luận và đề nghị
163

Kết luận
163

I. Các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm
163

II. Về nội dung và phơng pháp sử dụng
163

NTTULIB

III. Về giải pháp khoa học công nghệ
164

IV. Các sản phẩm cụ thể
165

Đề nghị
165

Lời cảm ơn
166
Tài liệu tham khảo
167



NTTULIB

2

Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06



TT

Mã số

Tên đề tài nhánh

Cơ quan của chủ
nhiệm đề tài nhánh



1


KC.04.06.01

Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc
xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng
trâu bò chất lợng cao

ThS. Hoàng Xuân Nghinh


Viện Thú y


2


KC.04.06.02
Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.
enteritidis và S. typhi murium bằng
công nghệ vi khuẩn.

TS. Trần Thị Hạnh


Viện Thú y


3

KC.04.06.03
Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.
enteritidis và S. typhi murium bằng vi
khuẩn biến nạp.

TS. Trơng Nam Hải

Viện Công nghệ
Sinh học

4

KC.04.06.04
Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật
sinh học phân tử (RT-PCR).

TS. Tô Long Thành

Viện Thú y





NTTULIB

3


Danh sách cán bộ tham gia


TT Họ và Tên Học vị
chuyên môn

Cơ quan công tác
1 Trơng Văn Dung PGS. TS Viện Thú y
2 Hoàng Xuân Nghinh Th.S Viện Thú y
3 Đỗ Tuấn Cơng BSTY Viện Thú y
4 Trần Ngọc ánh Th.S Viện Thú y
5 Nguyễn Lại Hoàn TS Viện Thú y
6 Trơng Thị Hồng Hoa BSTY Viện Thú y
7 Lê Văn Phan BSTY Viện Thú y
8 Nguyễn Thị Bích BSTY Viện Thú y
9 Đặng Vũ Hoàng BSTY Viện Thú y
10 Trần Thị Thanh Hà BSTY Viện Thú y
11 Trần Thu Hiền Th.S Công Ty Hanvet
12 Nguyễn Thị Nguyệt Th.S Công Ty Hanvet
13 Nguyễn Lê Văn Th.S Viện Chăn nuôi
14 Trần Thị Hạnh TS Viện Thú y
15 Nguyễn Tiến Thành BSTY Viện Thú y
16 Đặng Thị Thanh Sơn BSTY Viện Thú y
17 Ngô Chung Thủy BSTY Viện Thú y
18 Trịnh Phú Ngọc TS Viện Thú y
19 Đặng Đình Thởng BSTY Viện Thú y

NTTULIB

4
20 Thái Kim Thanh KTV Viện Thú y
21 Hoàng Quang Thỏa Th.S TT Thú y vùng Hà Nội
22 Lê Thị Thi BSTY Phân Viện TY NT
23 Lâm Minh Thuận BSTY ĐH Nông lâm Thủ Đức
24 Nguyễn Thị Hoa Lý TS Trung tâm kiểm tra Vệ
sinh Thú y TW2

25 Trơng Nam Hải TS Viện Công nghệ SH
26 Nguyễn Thanh Thuỷ CN Viện Công nghệ SH
27 Đỗ Thị Huyền Th.S Viện Công nghệ SH
28 Trần Ngọc Tân CN Viện Công nghệ SH
29 Nguyễn Hồng Thanh CN Viện Công nghệ SH
30 Nguyễn Thị Trung Th.S Viện Công nghệ SH
31 Nguyễn Thành Trung SV Đại học KH TN
32 Nguyễn Thị Thu Hằng SV Đại học KH TN
33 Nguyễn Minh Giang SV Đại học SP Hà Nội
34 Bùi Thị Tố Nga SV Đại học NN I
35 Nguyễn Phơng Giang SV Đại học NN I
36 Nguyễn Thị Hơng SV Đại học NN I
37 Đinh Duy Kháng TS Viện Công nghệ SH
38 Dơng Hồng Quân CN Viện Công nghệ SH





NTTULIB

5


Danh sách các đơn vị tham gia, phối hợp




TT

Đơn vị
1 Viện Thú y
2 Viện Công nghệ Sinh học
3 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ơng
4 Trung tâm Thú y vùng Thành phố Hồ Chí Minh
5 Chi Cục Thú y tirnh Lạng Sơn
6 Chi Cục Thú y tỉnh Phú Thọ
7 Chi Cục Thú y tỉnh Bắc Giang
8 Chi Cục Thú y tỉnh Thái Bình
9 Chi Cục Thú y tỉnh Ninh Thuận
10 Chi Cục Thú y tỉnh Thừa Thiên Huế
11 Chi Cục Thú y tỉnh Quảng Trị
12 Chi Cục Thú y tỉnh Daklak
13 TT Thú y vùng Hà Nội
14 Phân Viện TY NT
15 ĐH Nông lâm Thủ Đức
16 Trung tâm kiểm tra Vệ sinh Thú y TW2



NTTULIB

6

tóm tắt Báo cáo

Đề tài:
Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhợc độc
vô hoạt phòng bệnh cho giá súc, gia cầm và ứng dụng kỹ thuật
gen xác định loại vi rut Lở mồm Long móng (LMLM)

Mã số: KC.04.06.
Thuộc Chơng trình Khoa học Công nghệ cấp Nhà nớc KC.04 nghiên cứu
khoa học và phát triển công nghệ sinh học giai đoạn 2001-2005.

Theo tinh thần của Hợp Đồng "Nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ
số: 06/2001/HĐ - ĐTCT KC 04.06 ký ngày 24 tháng 10 năm 2001 giữa Ban Chủ
nhiệm Chơng trình KC-04 - đại diện cho Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trờng với
Viện Thú y là cơ quan Chủ trì Đề tài và Chủ nhiệm Đề tài, Đề tài KC.04.06 có ba
mục tiêu nh sau:
- Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nhợc độc biến nạp gen phòng bệnh cho gà.
- Tạo chủng vi khuẩn tụ huyết trùng để sản xuất vắc xin.
- Định type vi rut LMLM để lựa chọn vắc xin phù hợp.
Đề tài đợc thực hiện từ tháng 11 năm 2001 và kết thúc vào tháng 12 năm 2004
với tổng số kinh phí là 2700 triệu đồng trong đó kinh phí từ ngân sách nhà nớc là 2600
triệu đồng.
Để thực hiện các mục tiêu của Đề tài theo nh Hợp đồng đã yêu cầu, chúng tôi
đã lựa chọn; với sự chấp thuận của Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi Trờng, 4 đề tài
nhánh (xem Bảng 1) với các nội dung nghiên cứu khác nhau nhằm đa ra các công
nghệ sản xuất thích hợp để có đợc các loại vắc xin sẽ đợc sử dụng trong phòng chống
bệnh Tụ huyết trùng trâu bò là bệnh gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trâu bò
của nớc ta và vấn đề ô nhiễm thực phẩm do Salmonella enteritidis và Salmonella typhi

NTTULIB

7
murium gây ra ở các sản phẩm của từ gia cầm đây là những mầm bệnh có tầm quan
trọng về y tế, đặc biệt liên quan đến vấn đề an toàn thực phẩm. Đối với bệnh Lở mồm
Long móng (LMLM) là một bệnh đặc biệt nguy hiểm của động vật guốc chẵn, mục
tiêu của đề tài là thiết lập phơng pháp chẩn đoán-định type vi rút gây bệnh LMLM

bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR). Một trong những ứng dụng thực tiễn của
phơng pháp này là xác định type vi rút gây bệnh LMLM một cách nhanh chóng và
chính xác để lựa chọn và sử dụng vắc xin thích hợp.

Bảng 1. Phân công chủ đề nghiên cứu và Chủ trì các Đề tài nhánh
TT Mã số nhánh Đề tài nhánh Chủ trì Cơ quan

1

KC.04.06.01.
Nghiên cứu phát triển
và hoàn thiện vắc xin
phòng chống bệnh tụ
huyết trùng trâu bò chất
lợng cao


Hoàng Xuân Nghinh


Viện TY

2

KC.04.06.02.
Sản xuất vắc xin phòng
chống S. enteritidis và S.
typhi murium bằng công
nghệ vi khuẩn

Trần Thị Hạnh

Viện TY


3


KC.04.06.03.
Sản xuất vắc xin phòng
chống S. enteritidis và S.
typhi murium bằng vi
khuẩn biến nạp

Trơng Nam Hải

Viện
CNSH

4

KC.04.06.04.
Định type vi rút LMLM
bằng kỹ thuật RT-PCR

Tô Long Thành

Viện TY

Đề tài bắt đầu đợc thực hiện vào cuối tháng 10 năm 2001 và kết thúc vào tháng

12 năm 2004 theo nh thời lợng cho phép của Hợp đồng. Nhìn chung, theo kế hoạch
nghiên cứu đã đợc xác định cho từng năm, các đề tài nhánh đều hoàn thành công việc
đúng tiến độ. Kết quả của từng đề tài nhánh mà chúng tôi tập hợp sau đây sẽ chứng
minh điều đó. Tuy nhiên, Ban Chủ nhiệm đề tài của Viện Thú y cũng nh Ban Chủ

NTTULIB

8
nhiệm chơng trình KC-04 đã thống nhất đánh giá và ghi nhận những cố gắng đã đạt
đợc của các đề tài nhánh thực hiện trên đối tợng gia cầm nhằm hoàn thành các nội
dung của đề tài theo đúng tiến độ đề ra. Chúng ta đều biết trong thời gian thực hiện đề
tài, dịch cúm gia cầm do vi rút H5N1 nổ ra vào cuối năm 2003 và vẫn âm ỉ cho đến
hiện nay đã gây ảnh hởng không nhỏ đến việc thực hiện các thực nghiệm trên bản
động vật.
Cho đến thời điểm chúng tôi tổng kết Đề tài này, các đề tài nhánh đều hoàn
thành các nội dung công việc đã đợc ký với Ban Chủ nhiệm Chơng trình.
1. Đề tài nhánh KC.04.06.01: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin
phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lợng cao.
Bằng việc phân lập vi khuẩn P. multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu bò từ
trâu bò bị bệnh tại một số địa phơng trong nớc và so sánh tính tơng đồng kháng
nguyên của chúng với các chủng vi khuẩn hiện đang đợc sử dụng để chế tạo vắc xin,
các tác giả đã lựa chọn chủng IR của vi khuẩn P. multocida để chế tạo vắc xin. Đề tài
nhấn mạnh vào hai yếu tố nhằm nâng cao hiệu quả của vắc xin: (i) xác định liều kháng
nguyên kích thích sinh miễn dịch tốt nhất và (ii) cải tiến công thức của chất bổ trợ,
dùng hỗn hợp saponin và keo phèn để tạo đáp ứng miễn dịch cao và độ dài miễn dịch
tốt hơn so với các vắc xin đang đợc sử dụng trong nớc. Sau khi thử nghiệm vắc xin
với kết quả khả quan ở một số địa phơng nh Phú Thọ và Bắc Giang, vắc xin đã đợc
kiểm nghiệm tại Cục Thú y với kết quả đạt yêu cầu.
Các kết quả thu đợc đợc tóm tắt nh sau:
- Phân lập đợc 16 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết ở một

số địa phơng trong nớc.
- Chọn vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR là chủng gốc để chế vắc xin.
- Xác định tính tơng đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn Pasteurella multocida
chủng IR với các chủng đại diện phân lập đợc từ các địa ph
ơng.
- Xác định liều kháng nguyên thích hợp là 25 tỷ vi khuẩn/1 liều vắc xin.
- Công thức bổ trợ thích hợp: Saponin 1%, keo phèn 20%.
- Độ dài miễn dịch chắc chắn của vắc xin trên bản động vật: ít nhất 6 tháng.

NTTULIB

9
- Có thể dùng các vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR; 4 chủng: Pb1,
Pb2, Pbu1, Pbu2; chủng P52 để chế vắc xin.
- Vắc xin đợc kiểm nghiệm cấp quốc gia: Đạt yêu cầu.
Trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu đã đề ra, đề tài đã tiếp nhận 5
sinh viên đại học Thú y thực tập tốt nghiệp với kết quả bảo vệ báo cáo tốt nghiệp đạt
kết quả cao (xem Phụ Lục).
2. KC.04.06.02: Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi
murium bằng công nghệ vi khuẩn.
Đề tài đợc tiến hành với bớc điều tra cơ bản nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi
khuẩn Salmonella spp trên các đối tợng gia cầm của một số trại chăn nuôi. Từ những
chủng Salmonella phân lập đợc, các tác giả đã định type và lu giữ đợc các chủng vi
khuẩn S. typhi murium và S. enteritidis. Bằng các kỹ thuật vi sinh vật học, các tác giả đã
chọn đợc một chủng S. typhi murium và một chủng S. enteritidis để sản xuất vắc xin
vô hoạt kep phèn. Kết quả thử nghiệm vắc xin cho thấy vắc xin bảo hộ tốt cho chuột và
an toàn cho gà đợc dùng vắc xin.
Các kết quả cụ thể nh sau:
- Đã xác định đợc tỉ lệ nhiễm Salmonella spp trên gà và vịt ở miền Bắc, miền
Trung và miền Nam. Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên gia cầm của Việt Nam la 4,24%.

- Đã phân lập và định týp đợc 2 chủng Salmonella typhi murium (7,55%) và
Salmonella enteritidis (1,80%) trong tổng số vi khuẩn Salmonella phân lập đợc.
- Đã thử độc lực và khả năng sống sót của 13 chủng vi khuẩn phân lập đợc.
- Xác định đợc chỉ tiêu LD50 của 13 chủng phân lập đợc với kết quả từ 10
-2,7

đến 10
-3,2
.
- Chọn đợc 2 chủng S. enteritidis (E17) và S. typhi murium (T6) có các đặc
tính sinh vật hóa học điển hình, có độc lực cao, khả năng sống sót cao để sản xuất
vacxin vô hoạt keo phèn.

NTTULIB

10
- Đã sản xuất thử nghiệm thành công 2 loại vacxin vô hoạt keo phèn S.
enteritidis (E17) và S. typhi murium (T6), với kết quả bảo hộ tốt trên chuột nhắt trắng
và an toàn trên gà thí nghiệm.
- Đã xác định đợc liều vacxin có hiệu giá kháng thể cao nhất là 2,5 ml/ con.
Trong quá trình thực hiện, đề tài đã tiếp nhận 1 sinh viên đại học Thú y thực tập
tốt nghiệp và 1 hoạc viên thạc sỹ. Đề tài đã công bố 2 bài báo (xem Phụ Lục).
3. KC.04.06.03: Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi
murium bằng vi khuẩn biến nạp.
Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, các tác giả đã tách dòng các đoạn gen mã
hóa cho kháng nguyên lông H:i của vi khuẩn S. typhi murium, H:g,m và kháng nguyên
lông sef14 của vi khuẩn S. enteritidis. Các đoạn gen này đã đợc biểu hiện trong vi
khuẩn E. Coli và khả năng sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp FliC3 và
Gm3 đợc xác định là tơng tự nh kháng nguyên tự nhiên. Thử nghiệm công cờng
độc cho gà đợc dùng vắc xin tái tổ hợp cho thấy vắc xin tái tổ hợp bảo hộ đợc cho gà

chống lại vi khuẩn Salmonella.
Các kết quả thu đợc nh sau:
- Đã tách dòng thành công các đoạn gen mã hoá cho kháng nguyên roi H:i của
vi khuẩn S. typhi murium, H:g,m và kháng nguyên lông sef14 của vi khuẩn S.
Enteritidis.
- Biểu hiện thành công gen mã hoá kháng nguyên roi của S. typhi murium và S.
enteritidis trong vi khuẩn E. Coli BL21.
- Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp FliC3 và Gm3
đợc xác định là tơng tự nh kháng nguyên tự nhiên.
- Đã tạo thành công vacxin tái tổ hợp chống Salmonella ở gà.
Thêm vào đó: Đề tài đã đào tạo đợc 2 sinh viên đại học và 1 thạc sỹ khoa học,
đợc nhận giải Báo cáo Khoa học ấn tợng của Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn
quốc năm 2003, Giải nhì Hội nghị Khoa học Thanh niên của Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.

NTTULIB

11
Đề tài đã công bố 03 ấn phẩm (xem Phụ Lục) có liên quan đến nội dung khoa
học của đề tài.
4. KC.04.06.04: Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR.
Với hơn 250 bệnh phẩm thu thập đợc từ các ổ dịch của trâu bò và lợn nghi là
mắc bệnh Lở mồm Long móng (LMLM), lần đầu tiên ở Việt Nam, các tác giả đã áp
dụng thành công kỹ thuật RT-PCR nhằm chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM.
Thêm vào đó, các tác giả đã phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM từ bệnh phẩm
thu thập ở một số địa phơng trên nuôi cấy tế bào dong BHK-21 và đây chính là
phơng pháp làm tăng số lợng vi rút và sau đó tiến hành định type bằng phơng pháp
RT-PCR từ những bệnh phẩm chất lợng kém hoặc số lợng vi rút trong bệnh phẩm
không đủ để tiến hành ngay phơng pháp RT-PCR.
Các kết quả cụ thể đã thu đợc nh sau:

- Đã ứng dụng thành công phơng pháp RT-PCR trong điều kiện trang thiết bị và
nghiên cứu của Việt Nam với các mẫu ARN chuẩn chiết tách từ vi rút LMLM
của Việt Nam, nhận từ Phòng thí nghiệm Tham chiếu về bệnh LMLM Pirbright,
Anh quốc.
- Đã sử dụng phơng pháp RT-PCR đối với bệnh phẩm biểu mô thu thập từ gia súc
(trâu, bò, lợn) nghi mắc bệnh LMLM với kết quả của phơng pháp đạt độ đặc
hiệu cao. Trong trờng hợp chỉ cần xác định mầm bệnh có phải là vi rút gây
bệnh LMLM hay không, chỉ cần sử dụng cặp mồi 1F/1R dặc hiệu chung cho tất
cả các typ vi rút gây bệnh LMLM nhằm có câu trả lời nhanh nhất để triển khai
các biện pháp khống chế bệnh.
- Đã duy trì, bảo quản và phục hồi tế bào BHK-21 một cách dễ dàng và nó trở
thành nguyên liệu quí cho các nghiên cứu sâu hơn về vi rút LMLM. Sử dụng tế
bào này, đã phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM ở tỉnh Quảng Trị và đã
khẳng định đây là một vi rút typ O bằng phơng pháp RT-PCR. Đây là một
phơng pháp thay thế trong trờng hợp số lợng vi rút trên bệnh phẩm thấp, cần
gây nhiễm lên tế bào cảm thụ để tăng số lợng vi rút và sau đó tiến hành định
type bằng phơng pháp RT-PCR.

NTTULIB

12
Thêm vào đó, đề tài đã hớng dẫn 3 sinh viên đại học Thú y, 1 Thạc sỹ Thú y và
công bố 4 bài báo (xem phần Phụ Lục).


NTTULIB

13
Nh÷ng tõ viÕt t¾t

ADN Acid Deroxyribonucleic
Amp+ Ampicillin.
BHK-21 Baby Hamster Kidney dßng 21
bp base pair.
BSA Bovine Serum Albumin
cADN Complementary ADN
CPE Cytopathogen effect
DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
DMSO Dymethyl Sulffoxide
dNTP Deroxyribonucleotide 5’-triphosphates.
DTT Dithiothretiol
EDTA Ethylen diamin tetra axit axetic.
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay.
EtBr Ethidium bromide.
FAO Food and Agricultural Organization
FCS Fetal Calf Serum
FMD Foot and Mouth Disease.
IPTG Isopropy-β-D-thiogalactopyranoside.
Kb Kilo base.
LB Luria-Bertani medium.
LMLM Lë måm Long mãng
OIE Office Internaitionale des Epizooties
PBS Phosphate- Buffered- Saline
RT-PCR Reverse Trancription- Polymerase Chain Reaction
SDS Sodium Dodecyl sunphat.
TAE Tris- axetat-EDTA.
Taq pholymerase Polymerase cña Thermus aquaticus
TCID
50
50% Tissue Culture Infectious Dose

TE Tris- EDTA.
Trypsin- EDTA Ethylene- Diamine- Tetra-Acetate
WRL World Reference Laboratory
X-gal 5-Bromo-4chlorua-3 indolyl-β-O galactosyranozit.


NTTULIB

14
Lời nói đầu

Lịch sử nghiên cứu và phát triển vắc xin đã có chiều dài hơn 200 năm kể từ lần
đầu tiên khi Edward Jenner thử nghiệm dùng vắc xin chống bệnh đậu mùa cho cậu bé
James Phipps tám tuổi sống tại một làng quê nớc Anh vào năm 1795. Nhờ đó mà cậu
bé đã đợc cứu sống khi dịch bệnh đã lan rộng, cớp đi sinh mạng của bao ngời. Cách
phòng bệnh nh vậy trên thực tế đã tồn tại trong dân gian của các nớc Trung Quốc, ấn
Độ, và Ba T từ hơn một ngàn năm trớc. Tuy nhiên, Jenner là nhà khoa học đầu tiên
đã xem xét vấn đề một cách có hệ thống, vì vậy ông đợc xem là ngời khởi đầu cho
ngành vắc-xin học. Gần một thế kỉ sau, vào năm 1885, Louis Pasteur đã chế tạo thành
công vắc xin chống bệnh dại và đã chứng minh khả năng bảo vệ cơ thể chống lại bệnh
truyền nhiễm bằng chính tác nhân gây bệnh đó nhng đã bị làm suy yếu đi hoặc đã bị
giết chết. Qua các công trình nghiên cứu, Pasteur đã phát hiện ra vai trò của các vi sinh
vật trong thế giới sống. Nhờ đó, ông không chỉ đánh đổ đợc thuyết tự sinh duy tâm mà
còn đặt nền móng cho sự phát triển của ngành vắc-xin học hiện đại. Loại vaccine này
đã đợc sử dụng rộng rãi vào cuối thế kỷ XIX tuy nhiên khả năng phòng bệnh của loại
vắc xin này cha cao.
Với đặc điểm của ngành Thú y, phòng bệnh luôn đợc coi là là tốt hơn điều trị,
nên có thể nói vắc xin hiện nay vẫn đợc coi là biện pháp chủ yếu để phòng bệnh cho
gia súc và gia cầm. Việc điều trị gia súc và gia cầm, ngoài tốn kém về chi phí thuốc còn
có thể gây nên hiện tợng kháng thuốc kháng sinh đối với vi sinh vật và tạo nên các

chất tồn d trong sản phẩm động vật mà nó có thể ảnh hởng trực tiếp đến sức khỏe của
ngời tiêu dùng. Hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi rõ ràng phụ thuộc nhiều vào
việc phải hay không phải điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm.
Trong số các loại vắc xin dùng trong y học nói chung và thú y học nói riêng, hai
loại đợc dùng phổ biến là vắc xin vô hoạt (vi sinh vật đã đợc giết chết) và vắc xin
nhợc độc (vi sinh vật vẫn còn sống nh
ng không có khả năng gây bệnh). Mặc dù trớc
đây vắc xin nhợc độc đợc coi là tạo đợc miễn dịch cao hơn và dài hơn so với vắc xin
vô hoạt; nhng đến nay với các chất bổ trợ mới, vắc xin vô hoạt đã dần dần thay thế cho
vắc xin nhợc độc trên thị trờng thế giới, nhất là tại các nớc có trình độ phát triển
khoa học kỹ thuật cao ngời ta không muốn gặp phải nguy cơ xuất hiện lại các chủng

NTTULIB

15
vi sinh vật có khả năng gây bệnh cho gia súc và gia cầm từ vắc xin, dù là với một xác
suất nhỏ nhất.
Nh đã nói ở trên, để khắc phục các nhợc điểm của vắc xin đợc tạo ra từ vi
khuẩn đã đợc vô hoạt, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra vắc xin sống bằng cách làm
suy yếu vi khuẩn. Loại vắc xin này có khả năng bảo vệ cơ thể rất tốt nhng nó lại có rủi
ro rất lớn đối với những cơ thể có sức đề kháng kém. Do nhợc điểm đó mà vắc xin
sống nhợc độc đã ra đời. Loại vắc xin này đợc điều chế bằng cách làm bất hoạt hoặc
phá huỷ các gen mã hoá cho độc lực của tác nhân gây bệnh. Vì nguồn kháng nguyên
hầu nh không bị thay đổi nên vắc xin này cũng có hiệu lực rất cao, khả năng bảo vệ cơ
thể rất tốt. Nhng các nghiên cứu về mức độ an toàn của vắc xin cho thấy, các chủng
vắc xin đợc tạo ra lại có tính di truyền không ổn định. Các gen độc đã bị bất hoạt
nhng sau một thời gian nó có thể phục hồi và vì thế vắc xin sống nhợc độc cũng còn
mang rủi ro lớn. Gần đây, nhờ sự phát triển nh vũ bão của sinh học phân tử, các nhà
khoa học đã nghĩ ra việc tạo vắc xin phòng bệnh mới dựa vào kháng nguyên tiểu phần.
Vì là kháng nguyên tiểu phần nên vắc xin này sẽ có độ an toàn rất cao và khả năng bảo

hộ vẫn đợc đảm bảo. Đây là loại vắc xin đang đợc quan tâm nghiên cứu hàng đầu và
sẽ đợc sử dụng rộng rãi trong một tơng lai không xa.
Trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng nhất ở vật nuôi, phải kể đến vi rut
gây bệnh Lở mồm long móng (LMLM) (Loeffler và Frosch, 1898), vi rut Dịch tả lợn
(USA, 1833; trích dẫn theo Sharma, 1995), vi rut gây bệnh Newcastle (Kranevel, 1926),
vi rut dại (Zinke, 1804) Với vi khuẩn gây thiệt hại nhiều nhất cho ngành chăn nuôi
phải kể đến là tụ huyết trùng trâu bò, tụ huyết trùng lợn, tụ huyết trùng gia cầm do vi
khuẩn Pasteurella multocida, và các bệnh của gia súc gia cầm do vi khuẩn Salmonella
spp. (Salmonellosis). ở các nớc có nền khoa học phát triển cao, ngời ta đã sản xuất
thành công các loại vắc xin tơng ứng đối với các bệnh kể trên. Ví dụ, đối với vắc xin
LMLM, hiện nay có 8 nớc sản xuất, mà chủ yếu là Pháp, Anh, Hà lan và Nga (Liên xô
cũ) với sản phẩm là vắc xin vô hoạt dùng bổ trợ dầu. ở châu á, Trung quốc và Thái
lan cũng tiến hành sản xuất vắc xin LMLM với số lợng hạn chế, chủ yếu để dùng
trong nớc. Đối với các bệnh khác, mặc dù chủng vi sinh vật dùng để sản xuất vắc xin
có thể khác nhau, nhng hầu hết các nớc đều tự chủ sản xuất và tự đảm bảo đợc nhu
cầu vắc xin trong nớc.

NTTULIB

16
Đối với bệnh tụ huyết trùng trâu bò, hầu hết các nớc có bệnh đều sản xuất vắc
xin từ một chủng vi khuẩn P. multocida nào đó và đều tiến hành các chơng trình tiêm
phòng (Ramdan và Adler, 1993). Nhìn chung, vắc xin chống bệnh tụ huyết trùng trâu
bò thờng đợc dùng là vắc xin chết với bổ trợ keo phèn hoặc bổ trợ dầu. ở Iran, ngời
ta lại a dùng vắc xin với bổ trợ saponin và dạng cải tiến sau này đợc gọi là vắc xin
phocmôn hóa có bổ trợ saponin (Theo FAO, 1979). Cũng đã có những tác giả đề xuất
việc dùng vắc xin là chất chiết đã đợc tinh khiết (purified extracts) nh Penn và Nagy
(1974, 1976), Muniandy và cs (1993). Cũng có một số thông báo về việc dùng vắc xin
nhợc độc (Adelberg và cs, 1965; Oeschger và Berlyn, 1974; De Alwis và Carter,
1980). Tựu chung lại, muốn một vắc xin có hiệu quả trong việc phòng chốnng bệnh tụ

huyết trùng trâu bò, ngoài các yếu tố quan trọng nh nồng độ kháng nguyên , thì sự
tơng đồng giữa chủng vi khuẩn dùng để chế vắc xin và chủng vi khuẩn gây bệnh ngoài
thực địa là điều kiện hết sức quan trọng.
Với nhũng thành tựu của sinh học phân tử (SHPT), khoa học càng ngày càng
hiểu biết rõ ràng hơn về bản chất gây bệnh của vi sinh vật, khả năng phòng vệ của cơ
thể vật chủ với mầm bệnh và các yếu tố đóng vai trò quyết định trong đáp ứng của vật
chủ đối với vi sinh vật (Zinkarnagel, 1999). Càng ngày, ngời ta càng hiểu chắc chắn
hơn rằng không phải vật chủ hình thành đáp ứng miễn dịch đối với toàn bộ prôtêin cấu
trúc của một vi sinh vật gây bệnh nào đó. Nói cách khác, không phải tất cả kháng
nguyên (prôtêin) đều có khả năng gây đáp ứng miễn dịch (đặc biệt là miễn dịch phòng
hộ) tơng tự nh nhau. Chính vì thế, càng ngày càng thấy nhiều nghiên cứu về vắc xin
tái tổ hợp (recombinant vaccines) dùng phòng bệnh cho gia súc, gia cầm, ví dụ nh đối
với bệnh LMLM (Bergmann và cs, 2000) Cedillo-Barron, 2001; Mason và Grubman,
2001), bệnh Newcastle (Carpentier, 1994; Wu, 2000; Huang, 2001), bệnh viêm dạ dày
ruột truyền nhiễm của lợn (Sestak et al., 1998, Tuboly, 2001) tức là các vắc xin trong
đó không có mầm bệnh (cho dù là nhợc độc hoặc vô hoạt) mà chỉ có các kháng
nguyên (tức là các prôtêin) có khả năng kích thích cơ thể vật chủ sản sinh đáp ứng miễn
dịch phòng hộ.
Việc ứng dụng các kỹ thuật SHPT để sản xuất các vắc xin tái tổ hợp nhằm tạo ra
một vắc xin an toàn, có tính sinh miễn dịch cao ứng dụng trong phòng bệnh cho gia súc
và gia cầm đã và đang đợc thực hiện ở hầu hết các quốc gia tiên tiến trên thế giới. Các

NTTULIB

17
tác nhân gây bệnh quan trọng này đã đợc nghiên cứu rất chi tiết ở mức độ phân tử.
Trình tự nhiều gen quan trọng mã hóa cho các protein khác nhau của các đối tợng này
nh gen mã hóa cho protein vỏ, gen mã hóa cho kháng nguyên liên kết, kháng nguyên
gây ngng kết hồng cầu (HA) cũng nh neuraminidaza (NA) của các vi rút, gen mã hóa
cho các độc tố cũng nh các tính trạng khác nhau của vi khuẩn đã đợc đăng ký trong

Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế. Có thể truy cập và ghi chép lại trình tự các bộ gen hoặc
các đoạn gen quan trọng của hầu hết các mầm bệnh nguy hiểm cho gia súc và gia cầm
tại Website của Viện Hàn lâm Y học Hoa kỳ và các Websites có liên quan theo địa chỉ:
(<
Để sản xuất một vắc xin có hiệu quả phòng hộ cao, việc lựa chọn chủng vi sinh
vật để chế vẵc xin phù hợp về tính kháng nguyên với chủng vi rut gây bệnh ngoài thực
địa là điều hết sức quan trọng. Điều này trở nên rất rõ ràng và hiển nhiên khi chúng ta
biết rằng đối với vi rut LMLM có 7 type huyết thanh và hơn 70 dới type (subtypes)
(Kitching, 1999, 2000). Đối với vi khuẩn P. multocida ngời ta đã phân lập đợc hàng
ngàn chủng vi khuẩn với phân nhóm A, B, D, và E với tính chất gây bệnh và tính kháng
nguyên hoàn toàn khác biệt nhau (de Alwis, 1996, 1998). Cũng tơng tự nh vậy, trong
thiên nhiên tồn tại hàng ngàn chủng vi khuẩn Salmonella mà khả năng gây bệnh cũng
nh tính kháng nguyên của chúng đối với cùng một vật chủ hoặc với các vật chủ khác
nhau thì hoàn toàn khác nhau. Cũng chính vì lẽ đó, hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử
nh: Ribotyping, PCR, lai phân tử, RFLP, điện di trờng xung điện v.v đã đợc sử
dụng để phát hiện cũng nh định type các tác nhân gây bệnh. Đặc biệt đối với các tác
nhân gây bệnh nguy hiểm có thể gây thành đại dịch và có tính biến đổi kháng nguyên
rất phức tạp nh vi rut gây bệnh LMLM, vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng thì việc ứng
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ một các chính xác các chủng vi rút hay
vi khuẩn phân lập đều đợc tất cả các nớc trên thế giới đặc biệt quan tâm. Đã có rất
nhiều công trình công bố về việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ vi
khuẩn P. multocida và xác định typ và subtyp của vi rut LMLM. Việc định subtyp một
cách chính xác bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cực kỳ quan trọng vì nó giúp ta tìm ra
qui luật lu hành của tác nhân gây bệnh, chọn chủng chính xác, thích hợp cho việc sản
xuất và ứng dụng vắc xin một cách hiệu quả. Đó cũng chính là lý do tại sao đối với các
nớc cha tự xác định đợc subtyp của chủng vi rut LMLM lu hành trong các ổ dịch

NTTULIB

18

của nớc mình đều phải gửi bệnh phẩm đến Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế tại
Pirbright, Vơng quốc Anh. Trong hoàn cảnh nớc ta, việc ứng dụng kỹ thuật SHPT
trong việc định typ vi rút LMLM trở nên cấp thiết để chúng ta có thể chủ động trong
công việc này, không phải mua Kit ELISA của nớc ngoài, và sau đó tạo cơ sở cho
những nghiên cứu sâu hơn ở mức độ sub-typ.
Các prôtêin tái tổ hợp dùng trong nghiên cứu và phòng chống các bệnh LMLM
(Leippert, 2001; Nayak và cs, 2001), Newcastle (Baumans, 2001), và Gumboro
(Gomes, 2000) cũng đã đợc nhiều nớc nh Mỹ, Nhật bản, Australia, Pháp, Canada,
Anh v.v nghiên cứu thành công để từng bớc thay thế cho các kháng nguyên toàn
thân vi khuẩn hay toàn thân vi rut. Ngời ta đã tách đợc gen mã hóa cho kháng
nguyên glycoprotein vỏ của nhiều loại vi rut, ví dụ nh vi rut LMLM, Gumbro, gen mã
hóa cho các kháng nguyên quan trọng của vi rut Newcastle nh kháng nguyên liên kết,
kháng nguyên ngng kết hồng cầu, kháng nguyên neuraminidaza sau đó cho biểu hiện
thành công với vi rut đậu gà hoặc Baculovirut hay trong vi khuẩn Salmonella (xem
Shieh và cs, 2001). Càng ngày càng thấy xuất hiện nhiều vacxin thế hệ mới trên thị
trờng. Rõ ràng đây là một hớng nghiên cứu mới trong tơng lai nhằm mang lại hiệu
quả của công việc phát hiện bệnh, phòng trị bệnh tốt mà lại đảm bảo dịch bệnh không
có cơ hội trở lại, tạo điều kiện cho công cuộc khống chế dẫn đến tiêu diệt bệnh đợc dễ
dàng. Đây là một trong những điều kiện cơ bản nhằm tạo ra một đàn gia súc gia cầm
sạch bệnh với thịt và sản phẩm khác từ động vật có chất lợng tốt cho nhân dân tiêu
dùng và đảm bảo chất lợng cho xuất khẩu.
Vi khuẩn Salmonella, tác nhân gây bệnh cho hầu hết các loài gia súc, gia cầm và
ngời đã đợc biết đến từ hàng trăm năm nay (Trích dẫn theo Hahn G, 1993). Nhờ có
khả năng thích ứng với nhiều loại vật chủ, nên số lợng serotyp Salmonella không
ngừng gia tăng kể từ khi nó đợc phát hiện và đợc công nhận là tác nhân gây bệnh lần
đầu tiên vào năm 1885. ở đầu thập kỷ 90, số lợng chủng
Salmonella đã vào khoảng
2000 (Wilcock, Schwartz 1992). Chỉ 5 năm sau, con số đó đã đạt đến 3000 (Plonait,
Bickhardt 1997). Bệnh do Salmonella spp gây ra đợc phát hiện ở khắp các châu lục
trên thế giới. Bệnh ở bê nghé chủ yếu do 2 loài S. dublin và S. typhi murium. Đặc biệt, ở

gà bệnh do các loài Salmonella gây ra đợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Ngoài 2
loài Salmonella là S. pullorum và S. gallinarum gây bệnh đặc hiệu cho gà sinh sản còn

NTTULIB