ENZYME PECTINASE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BÀI BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: ENZYME PECTINASE
Giáo Viên: cô Lại Mai Hương
Nhóm : Phạm Ngọc Anh Thy
Nguyễn Việt Hoài
Hoàng Thò Thoa
Phạm Trương Thò Thanh Thủy
Nguyễn Diệu Linh
Lê Thò Ngọc Đào
Tháng 4-2007
1
LỜI NÓI ĐẦU
Môn học vi sinh thực phẩm giúp ích rất nhiều cho
chúng em trong việc mở rộng kiến thức của mình về
thế giới nhỏ bé xung quanh ta, đồng thời còn tạo một
nền tảng tri thức vững chắc cho chúng em về lónh vực
chuyên môn của mình sau này.
Để hoàn thành được bài báo cáo này “ENZYME
PECTINASE”, trứơc tiên chúng em xin chân thành
cám ơn cô Hương đã giúp chúng em rất nhiều trong
việc tìm tài liệu. Cám ơn cô đã gợi mở cho chúng em
hướng đi cơ bản, những yêu cầu thiết yếu cần có cũng
như những điểm cần chú trọng trong một bài báo cáo.
Qua bài báo cáo “ENZYME PECTINASE”,
chúng em đã thu được những kinh nghiệm quý báu
qua những lần làm việc tập thể, cùng thảo luận và
cùng đóng góp ý kiến. Hơn nữa, chúng em đã tổng hợp
được một đề tài rất thú vò, bổ sung thêm kiến thức cho

mình và đồng thời, dùng để làm nguồn tư liệu về sau.
2
MỤC LỤC
I. Enzyme pectinase và cơ chất
1. Cơ chất pectin
2. Enzyme pectase
II. Vi sinh vật tổng hợp pectase
III. Nuôi cấy thu nhận pectinase
1. Nguyên liệu
2. Chuẩn bò môi trường
3. Phương pháp nuôi cấy
4. Thu nhận enzyme pectinase
5. Tinh sạch enzyme pectinase
6. Sản phẩm của enzyme pectinase
IV. Ứng dụng của enzyme pectinase
1. Trong sản xuất rượu vang
2. Trong sản xuất nứơc quả
3. Trong sản xuất các mặt hàng từ quả
4. Trong sản xuất cà phê
5. Trong chăn nuôi
6. Trong trích ly dược liệu đông y
3
I. ENZYME PECTINASE VÀ CƠ CHẤT:
1. Cơ chất pectin:
1.1. Cấu tạo pectin :
- Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, có cấu tạo từ sự
kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết
α
-1,4-glucoside. Tuỳ
thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 - 200.000.

- Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin rất phổ biến
trong thực vật, là hợp chất polimer tự nhiên tồn tại có 3 dạng: protopectin,
pectin và acid pectinic. Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa
các thành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu.
- Pectin có nhiều trong các loại quả (1 – 1,5%). Các vỏ, cùi
cam, chanh, dứa có nhiều pectin. Trong rau cũng có pectin như cà rốt, bắp
cải, bí.
- Các pectin tự nhiên đònh vò trong thành tế bào có thể liên kết
với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không
tan. Trong quả xanh, pectin ở dạng không hoà tan gọi là protopectin làm cho
quả rất cứng. Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và
có cấu tạo hoá học phức tạp. Protopectin tồn tại chủ yếu ở thành tế bào,
thường ở dạng liên kết với polysaccharide khác như arabin, tinh bột,
cellulose… Khi quả chín, dưới tác dụng của enzyme protopectinase cũng như
acid hữu cơ có trong quả làm cho protopectin chuyển thành pectin hoà tan,
làm mềm quả.
4
Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự
nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester
hoá bằng methanol.
Tính chất quan trọng nhất của pectin là dễ tạo gel. Pectin được ester hoá
cao sẽ tạo gel đặc trong môi trường acid 1% và trong dung dòch đường có
nồng độ 65%.
- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các
nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic
acid.
Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm
methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vò
polygalacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid.
1.2. Tính chất của pectin:

- Pectin là chất bột trắng xám nhạt hay có màu nâu.
- Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác,
không khử oxy. Pectin hoà tan trong nước, amoniac, dung dòch kiềm,
cacbonate natri và trong glycerine nóng.
+ Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân
tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm. Khi đó, độ nhớt của
dung dòch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ.
+ Pectin dễ bò kết tủa bởi ethanol, isopropanol, acetone, sulfat amon, chlorua
nhôm, các muối đồng, muối canxi và acid.
- Độ bền vững của pectin trước các enzym pectinase sẽ được
tăng lên khi có mặt của các cation, nhất là Al
3+
và Fe
3+
+ Pectin hoà tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzyme pectase sẽ giải
phóng nhóm methoxy tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do. Pectin
chuyển sang dạng keo khi có đường và acid hay kim loại hóa trò cao.
- Khi có đường và acid, pectin có tính chất làm đông. Pectin của
quả có khả năng đông tốt hơn pectin của rau vì cấu tạo có nhiều nhóm
methoxy hơn
+ Độ kết đông càng cao khi nhóm methoxy càng nhiều.
• Khi nhóm methoxy chiếm 11%, pectin đông tốt ở pH = 3,5
• Khi nhóm methoxy chiếm 5%, pectin đông tốt ở pH = 2,9
• Khi hàm lượng pectin khoảng 1%, độ acid từ 1 – 1,3%, pH = 2,8 –
3,2 ; độ đường 65 – 70% thì sản phẩm có thể đông tốt
- Pectin thường được sản xuất từ táo, cà rốt, vỏ bưởi, lúa mạch
nha…
5
2. Enzyme pectinase:
2.1. Khái niệm:

- Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ của các
polymer pectin, làm giảm độ nhớt và giảm khối lượng phân tử của các sản
phẩm tạo thành.
- Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong quá trình chế
biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả.
- Sản phẩm của quá trình thuỷ phân bởi enzyme pectinase là
acid galacturonic, galactose, methanol…
2.2. Các loại pectinaza
Theo quan điểm hiện đại, enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ
chế tác dụng của chúng, trong phức hệ enzime có những enzime sau:
- Pectinesterase
- Polygalacturonase
- Transeliminase
a. Pectinesterase (PE) (pectase, pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11)
phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của acid galaturonic
theo sơ đồ:
Pectin + nH
2
O → methanol + acid pectinic
Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vò
galacturonate nằm kề đơn vò không bò ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy
(-OCH
3
) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid
pectic và methanol.
Vò trí tấn công nhóm methoxy ở vò trí 5 dễ hơn ở vò trí 3 và 7 (2 gốc –
COOH).
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trò pH tối ưu khác
nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của
chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối ưu từ 2,0 đến 6,5.

trái lại PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6
đến 7,5 – 8
COOHCOOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
COOH COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
1 2 3 4 5 6 7 8 9
6
Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45
0
C. Từ 55 đến
62
0
C thì enzime bò vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime
pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 60
0
C
Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt
độ tối ưu là 30 – 45
o

C, pH
opt
= 4,5-5,5 và bò vô hoạt ở 55- 62
o
C và từ thực vật
(pH
opt
=7,5-8, t
o
opt
= 55-60
o
C). Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào
nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion
canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm
mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger. Trái lại các cation hóa trò 3 và 4
(thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng
của pectinesterase
Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông
thể. Và người ta cũng đã xác lập được rằng N-axit cuối trong phân tử enzime
là phenylalanin
Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester
nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. Và enzime sẽ thủy phân lần lượt cắt
liên kết ester dọc theo phân tử pectin. Hoạt động của pectinesterase phụ
thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester
hóa. Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần
thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%.
Cấu trúc của pectinesterase từ carrot
b.Polygalacturonase(PG)(poly
α

-1,4-galacturoniglucanohydrolase)
(pectinase 3.2.1.12) thuỷ phân liên kết gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay
mỗi mạch, tức là thủy phân liên kết α - 1,4 – D – galactoside giữa các phần
tử axit galacturonic trong pectin và trong các axit polygalacturonic khác.
7
Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu có trong vi khuẩn và nấm mốc.
Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có
tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa vào đó người ta chia ra 4 kiêûu sau:
- Polymethyl galacturonase (PMG-poly-
α
-1,4-galacturonid-
methyl ester glucanhydrolase.3.2.1.41.EC). PMG lại đựơc phân thành 2 nhóm
nhỏ phụ thuộc vào vò trí phân cắt liên kết
α
-1,4 ở trong hay ở cuối và đầu
đoạn mạch
• Endo glucosidase polymethyl galacturonase kiểu I (endo-PMG-I). Đây
là enzyme có tính chất dòch hoá, pectin ở mức độ methyl hoá càng cao
(nhiều gốc methoxy-OCH
3
) thì bò thuỷ phân càng nhanh và triệt để.
Trong môi trường khi có mặt pectinesterase (PE) thì enzyme này
thường bò giảm hoạt lực
Endo-PMG-I rất phổ biến trong các nòi nấm mốc: Asp.niger, Asp.awamori,
Botrytis cinezea, Neurispora crassa)
Cơ chế tác dụng như hình vẽ:

• Exo-glucozidase polymethyl galacturonase kiểu III (exo – PMG- III).
Đây là enzyme có tính chất đường hoá, có khả năng cắt từng gốc
monome acid galacturonic ra khỏi mạch bắt đầu từ đầu không khử có

nhóm methoxy (-OCH
3
)
Cơ chế tác dụng như hình vẽ:
- Enzyme tác dụng lên acid pectinic hay acid pectic – gọi là
polygalacturonase (PG) cũng được phân thành 2 nhóm nhỏ:
7654321
COOHCOOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
7654321
COOHCOOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
COOH COOCH
3
COOCH
3
8
COOCH

3
• Endo glucosidase polygalacturonase kiểu II (endo – PG – II). Đây là
enzyme có tính chất dòch hoá, chỉ thuỷ phân cơ chất khi có mặt nhóm –
COOH tự do. Hoạt độ của endo – PG – II tăng lên nhiều khi cơ chất
được xử lý trước bằng pectinesterase (để tạo nhiều gốc –COOH tự do).
Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp đựơc enzyme này.
Cơ chế tác dụng như hình vẽ:

• Exo – glucosidase polygalacturonase kiểu IV (exo-PG-IV)
Endopolygalacturonase cũng có tên nữa là polygalacturonase dòch hóa.
Còn exopolygalacturonase thì có tên là polygalacturonase đường hóa
Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân pectin bởi
polygalacturonase có thể là các axit penta -, tetra -, tri- và digalacturonic
pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào
nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dòch hóa
(Endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì PH tối ưu nằm
trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì
lại có PH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đường hóa khi
tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid
pectinic thì pH tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6
Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng PH từ 4 – 6
Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng
thủy ngân thì có thể bền vững khi pH 2,5
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40
-45
0
C. Trong khoảng nhòệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bò vô
hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 65
0
C

Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các
caiton của kim loại kiềm cũng như cation amon
7654321
COOCH
3
COOCH
3
COOH COOH COOCH
3
COOCH
3
COOH
9
Polygalacturonase từ ERWINIA CAROTOVORA SSP. CAROTOVORA
c. Transeliminase (TE)
Cấu trúc của Transeliminase
Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm (khoảng năm
1960-1961) bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan ra
khỏi protopectin để tạo thành pectin hoà tan và enzyme transeliminase phân
cắt phi thuỷ phân (không có sự tham gia của phân tử H
2
O) pectin để tạo ra
các gốc galacturonic có nối kép giữa nguyên tử C
4
và C
5
. Phản ứng xảy ra dễ
dàng ở môi trường trung tính hay kiềm yếu
10
Traseliminase cũng có tính đặc hiệu cao, do đó người ta phân biệt các

Traseliminase như sau
- Endopectintraseliminase
- Expopectintraseliminase
- Endopectinic - traseliminase
- Expopectinic - traseliminase
Traseliminase từ nguồn khác nhau thì có cơ chế tác dụng và các thuộc tính
khác nhau. Chẳng hạn Traseliminase từ Bac.polymxa tác dụng trên uronit cao,
nhưng không tác dụng trên acid trigalacturonic, traseliminase từ nấm mốc
hoạt động tối ưu ở pH 5,2 trái lại traseliminase từ vi khuẩn họat động tối ưu ở
pH từ 7 – 8,5
Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường
bề sâu của nấm mốc. Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime
này A.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase. Con.diplodiella,
Pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase. Nấm men Sacch.fragilis
dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase. Vi khuẩn Bac.polymyxa,
Bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase
Các loại enzyme pectinase
Stt Enzyme
( tên gọi theo hệ thống )
Enzyme
( tên thường gọi )
Phản ứng xúc tác
1 Pectin-pectinhydrolase
(3.1.1.11)
Pectinesterase (PE) Pectin+H
2
O= n methanol+ pectic
acid
2 Poly-α-1,4-
galacturonidglycano

hydrolase-PG (3.2.1.15)
Endopolyglacturonase
(Endo-PG)
Thủy phân liên kết α-1,4-D-
galacturonic trong galacturonide
khơng theo một trật tự nào.
3 Poly-α-1,4-
Dgalacturonidgalacturon-
hydrolase (3.2.1.40)
Exo-polygalacturonase
(exo-PG)
Thủy phân liên kết α-1,4-D-
galacturonide trong pectat, trong
galacturonide với sự đứt mạch của
11
acid galacturonic.
4 Poly-α-1,4-D galacturonid
metilester-
glycanohydrolase
(3.2.1.41)
Endopolymetylgalactur-
onase
(Endo-PMG)
Thủy phân liên kết α-1,4-D-
galacturonide trong pectin khơng
theo một trật tự nhất định.
5 Poly-α-1,4-D galacturonid
digalacturonoliase
(4.2.99.7)
Exo-pectatliase

(exo-PKTE)
Thủy phân liên kết α-1,4-D-
galacturonide trong pectat với sự tạo
thành ∆-4,5 acid degalacturonic
khơng theo một trật tự nhất định.
6 Poly-α-1,4-D galacturonid
glycanoliase (4.2.2.1)
Endopectatliase
(PETE)
Thủy phân liên kết α-1,4-D-
galacturonide trong pectat, trong
galacturonide với sự tạo thành nối
đơi khơng theo một trật tự nhất định.
7 Poly-α -1,4 D
galacturonid metylester-
glycanoliase (4.2.99.8)
Endopectinliase
(Endo-PTE)
Thủy phân liên kết α-1,4-D-
galacturonide trong pectin với sự tạo
thành nối đơi khơng theo một trật tự
nhất định.
II. VI SINH VẬT SINH TỔNG HP PECTINASE:
Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn.
Nấm mốc: penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam,
P.cilrimim, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi,
A.aureus, A.oryzae, A.wentii, Fusarium moniliforme,…
Nấm men: Saccharomyces fragilis
Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella
aerogenes…

Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các
bộ phận khác của thực vật. Khi quả bò hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ
cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực
vật.
• Polygalacturonase
Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật. PG
thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi
khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis, Asperigillus niger,
Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, Neurosrora crassa, các loài
Ascomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum.
• Pectate lyase
Pectate lyase (PEL) là các enzyme vi sinh vật ngoại bào. Các enzyme
của giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng
12
soft-rod ở thực vật. Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy ở Aeromonas,
Pseudomonas, Xanthomonas, Asperigillus và Fusarium.
Tính chất vật lý của một số enzyme pectinase được sinh tổng
hợp từ giống Aspergillus
Species and enzyme type Enzyme Mol mass
(kDa)
pH
opt
T
opt
(°C) pI
Endopolygalacturonases
A. alliaceus endoPG 40 5.5 35 5.9
A. carbonarius PG-I 61 4.0 55
A. carbonarius PG-II 42 4.1 50
A. carbonarius PG-III 47 4.3 55

A. niger E
1
35 4.1
A. niger E
2
80 3.8
A. niger Endo-I 55 4.9 3.2-3.5
A. niger Endo-II 38 4.8 4.6-5.9
A. niger Endo-III A 57 4.3 3.3
A. niger Endo-III B 57 4.5 3.3
A. niger Endo-IV 59 4.8 3.7
A. niger PGA 35 4.0 3.43
A. niger PGB 35 5.0 6.19
A. niger PGD 51 4.2 4.1
A. oryzae PGI 4.0 60
A. oryzae PGA 41 5.0 45
A. oryzae PGB 39 5.0 55
Exopolygalacturonases
A. aculeatus 42 4.3
A. alliaceus exoPG
1
40 3.5 45-50 5.7
A. alliaceus exoPG
2
40 6.0 30-35 6.3
A. niger exo-PG I 66 3.8 60 5.6
A. niger exo-PG II 63 4.5 60 5.8
A. niger Exo-I 4.0
Rhamnogalacturonan
hydrolases

A. aculeatus RhgA 51 3-4 40-50
A. aculeatus RGase A 59 3.5 30-50 4.5
A. aculeatus RG-RH 84 4 60 4.9-5.4
13
A. aculeatus RG-GH 66 4 50 5.12
Pectin lyase
Aspergillus sp. strain
CH-Y-1043
8.5-8.8 40-45
A. japonicus 32 6.0 55 7.7
A. niger PL B 40 8.5-9.0 5.9
A. niger PLI 37.5 3.65
A. niger PLII 37.5 3.75
A. oryzae PL 8.5 50-55
Pectate lyase
A. nidulans PL A 40 4.2
A. niger PlyA 43 7.5-8.5
Rhamnogalacturonan
lyase

A. aculeatus RGase B 55 6.0 50 5.2
 Giới thiệu về mốc Aspergillus
Đây là loài nấm mốc hiếu khí. Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và
nhân con, có các tiểu thể. Khi phát triển tế bào nấm mốc thành hệ sợi: khuẩn
ty ăn sâu vào cơ chất – khuẩn ty khí sinh
Giống Aspergillus thuộc lớp nấm túi Ascomycetes
Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt. Có hai
loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ty
dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn ty cơ chất). Khuẩn ty

phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân. Cuống đính
bào tử không phân nhánh dài và thẳng đầu, có nhiều cuống nhỏ. Tùy loại có
cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng. Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào
hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Các đính bào
tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần. Những chuỗi đính bào
tử xếp đối xứng từng quả tròn trên chóp nang trông như đóa hoa cúc. Đính
bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch bề mặt xù xì. Do cuống
sinh bào tử và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của
khuẩn lạc mốc. Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là: vàng, vàng lục,
đen, tro, nâu…
Đặc điểm của giống Aspergillus giàu các enzyme thủy phân ngoại bào
(amylase, protease, pectinase, lipase…). Màu do các bào tử già có màu sắc
gây nên, ta thường gặp lớp mốc có màu đỏ, đen, vàng… Các bào tử này dễ bò
gió cuốn đi xa và rơi vào đâu gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới
14
Aspergillus
Seplate hyphoe: sợi nấm
Conidiophore: cuống sinh bào tủ
Vesicle: tề bào hình chai
Phiolides: đính bào tử
Conidiospores: bào tử
15
 Giôùi thieäu veà Aspergillus niger
The effect of radioactive compounds (U) applied in the minimum doses
detectable by the electronic counter (B-2) on the culture of Aspergillus niger:
a) control; growth on a medium without radioactive substances; b) growth on a
medium containing uranium. Swollen hyphae of the mycelium with degenerative
coarsely-granular protoplasm.
16
17

Aspergillus niger thường được gọi là mốc đen. Sợi mốc màu trắng nhưng
đính bào tử màu đen. Từ cuống đầu tiên mọc 2-4 nhánh cuống nhỏ rồi mới
tiếp đến các bào tử. Mốc sinh ra enzyme amylase, protease, pectinase,
glucoseoxydase. Mốc này được dùng trong sản xuất rượu, sản xuất acid xitric,
acid fumaric. Protease do mốc này hoạt động ở pH 2.5-3.5
Aspergillus niger có hoạt tính amylase đường hóa khác nhau ở những
chủng khác nhau. Một số chủng được sử dụng để đường hóa tinh bột trong sản
xuất rượu hoặc mật-bột siro glucose. Mốc này có thể chòu được pH thấp, nhiệt
độ thích hợp là 30-33
o
C và dễ phát triển trên môi trường tinh bột
Aspergillus niger có hàm lượng ecgoxterin khá cao ( là loại sterin chủ yếu
của nấm) . Đây là loài vi sinh vật hiếu khí, có khả năng phân giải cellulose
mạnh mẽ
Loài aspergillus đang được ứng dụng rộng rãi để thu nhận enzyme và acid
hữu cơ. Trong đó, chủng Aspergillus niger được nghiên cứu kỹ và đã được đưa
qua các quá trình sản xuất. Chủng này trong quá trình phân huỷ các chất
glucid và các chất khác có khả năng tích luỹ một lượng khá lớn enzyme và
acid hữu cơ.
Chủng Aspergillus phát triển mạnh trên môi trường thạch malt và tạo
thành bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những
cuống bào tử có vô số những bào tử. Cuống bào tử có hai phần: phần thứ nhất
dài và to, khoảng 2-3 micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen.
 Giới thiệu về Aspergillus awamori
18
Aspergillus Awamori
Aspergillus Awamori có khả năng sinh nhiều dextrinase và
glucomylase sinh ra ít hoặc trung bình.
 Giới thiệu về Saccharomyces fragilis
Saccharomyces Yeast Cells

Saccharomyces fragilis là loài vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, thuộc
lớp nấm túi. Sinh bào tử nang
Saccharomyces fragilis có hàm lượng ecgoxterin khá cao ( là loại sterin
chủ yếu của nấm)
Thành tế bào dày khoảng 25nm (chiếm 25% khối lượng khô của tế bào),
có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan. Trong thành tế bào còn chứa
10% protein (tính theo khối lượng khô), trong đó có một phần là các enzyme.
19
Ngoài ra, trên thành tế bào còn có một lượng nhỏ lipid, nước chiếm khoảng
75%. Khi loại bỏ 85% lượng nước từ nấm men ở nhiệt độ dưới 50
o
C hầu như
không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng
Lấy tế bào trần của nấm men rồi đưa vào trong dung dòch có áp suất thẩm
thấu thấp, ly tâm để lấy màng tế bào chất, rửa và ly tâm lại bằng nước cất và
quan sát dưới kính hiển vi, thấy màng tế bào chất có 3 tầng kết cấu khác
nhau. Chủ yếu là protein (50% khối lượng khô), lipid (40%, gồm lipid
glycerol-mono, di, triester, glycerol-phospho lipid, sterol) và hidratcarbon.
Nhân tế bào được bao bọc bởi một màng nhân, màng nhân có cấu trúc 2 lớp
và có rất nhiều lỗ thủng. AND cuả ty thể là một phân tử dạng vòng có khối
lượng phân tử là 50 x 10
6
Da. Khi già sẽ xuất hiện không bào, chứa các
enzyme thủy phân polyphosphate, lipoid, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi
chất trung gian.
Saccharomyces fragilis sinh sản vô tính bằng phương pháp nảy chồi. Ở
điều kiện thuận lợi, Saccharomyces fragilis sinh sôi nảy nở nhanh. Khi một
chồi xuất hiện, enzyme thủy phân sẽ làm phân giải phần polysaccharide của
thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng
hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên, khi đó sẽ xuất

hiện một vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ. Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào
mẹ ở chỗ tách ra còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang
một vết sẹo
Saccharomyces fragilis có khả năng lên men glucose, saccharose,
galactose, lactose và raffinose trong môi trường thuận lợi
Saccharomyces fragilis là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong
ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn. Quá trình nuôi dưỡng
Saccharomyces fragilis là quá trình hiếu khí vì vậy người ta phải thổi vào bồn
lên men một lượng khí rất lớn
Nguyên liệu chính dùng sản xuất nấm men là mật rỉ. Trong quá trình nuôi
người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồn lên men theo lượng cồn có
trong môi trường lên men. Nếu lượng mật nạp vào nhiều quá nấm men sẽ
không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khến nồng độ
cồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu lượng mật nạp vào quá ít
nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng cho sinh trưởng
Chất lượng của nấm men phụ thuộc vào công dụng của nó. Nếu sản xuất
men bánh mì thì năng lực sinh khí trong bột (hoạt tính) là thông số cần kiểm
soát, nếu nấm men dùng cho công nghiệp cồn thì khả năng sản xuất cồn, khả
năng chòu nồng độ cồn cao là quan trọng.
Hiên nay nhờ vào tiến bộ của công nghệ gen nên người ta có thể tạo ra
các chủng nấm men phù hợp với các công dụng của nó và cho năng suất cao
20
(dựa trên 1 kg nguyên liệu chính). Tuy nhiên công nghệ kiểm soát quá trình
lên men vẫn đóng vai trò quan trọng để sản xuất các mẻ men chất lượng và
sản lượng cao
 Giới thiệu về Penicillium:
Nấm này thuộc lớp nấm túi. Sợi có vách ngăn, khi phát triển sinh bào tử
trong mốc như cái chổi xể và bào tử có màu xanh. Tất cả các loài của giống
này lúc đầu phát triển sợi có màu trắng, sau là xanh-xám và cuối cùng là
nâu-xám. Cuống đính bào tử có vách ngăn và có hình cái chổi, phần cuối là

tế bào hình chai cùng với các đính bào tử. Khi rụng các bào tử bính có màu
xanh lục
Mốc này thấy ở mọi chỗ, thấy cả trên thực phẩm. Bào tử của chúng có
nhiều trong không khí, rau quả, ở các loại hạt và thóc malt, đặc biệt là ở các
loại hạt bò vỡ. Để phát triển, mốc này yêu cầu dinh dưỡng ở mức tối thiểu
nhưng điều trước tiên là độ ẩm và khoảng nhiệt độ rất rộng, ở các kho nhiệt
lạnh nhiệt độ trên dưới 0
o
C ta vẫn thấy mốc này phát triển
Penicillium thường sống ký sinh ở phôi các loại hạt, phá hỏng phôi và đi
sâu vào trong phá hỏng hạt. thóc malt, mốc này làm hỏng hạt thóc, thay đổi
màu sắc, mùi vò, làm giảm hoạt lực diastase và nặng sẽ làm hỏng hạt, các
enzyme của thóc malt và không thể dùng nấu bia được
Penicillium dễ sinh enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease,
pectinase…) và có một số loài có khả năng sinh chất kháng sinh Penicllin
21
Penicillium
Conidia: bào tử
Sterigmata: đính bào tử
Metula: cuống sinh bào tử
III. NUÔI CẤY THU NHẬN PECTINASE:
Trình tự tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme
1. Nguyên liệu:
• Cám gạo (%w/w)
- Tinh bột: 16
- Chất xơ: 10,7
- Protein: 15,3
- Lipid: 20,1
- Tro: 9,6
- Các chất khác: 28,4

• Nước chiết cà rốt
- Tinh bột: o%
- Chất xơ: 1%
- Pectin: 0,4%
- Protein: 1,5-2%
- Đường: 6,5%
• Bã mía
22
- Protein: 0,5%
- Chất xơ: 75%
- Tro:3,4%
- Đường tổng: 10,4% (trong đó 3,5% là đường khử)
• Cám mì
- Protein: 15,7%
- Chất xơ: 8,1%
- Đường tổng: 16,7% (trong đó 5,2% là đường khử)
- Tro: 4,6%
2. Chuẩn bò môi trường:
2.1. Cơ sở lý thuyết:
Đây là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống cũng như
khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Môi trường cần chứa đầy đủ
các chất C, N, H, O, các chấtvô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng
khác.
• Nguồn carbon:
Quá trình tổng hợp enzyme pectinase có liên quan đến chất cảm ứng
pectin. Pectin trong môi trường dinh dưỡng các giống vi sinh vật có khả
năng tổng hợp enzyme pectinase ngoài tác dụng làm chất cảm ứng còn là
nguồn carbon.
Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ
đường khác nhau. Với vi khuẩn, xạ khuẩn người ta thường dùng 0,5-0,2%

đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3-10% đường. Hầu
hết chúng chỉ đồng phân hóa được các loại đường ở dạng đồng phân D
Sử dụng hỗn hợp một số polysaccharide và pectin để nuôi cấy vi sinh vật
thì hoạt lực của pectinase ngoại bào có thể tăng lên 4-6 lần so với khi nuôi
cấy không có pectin.
Chất pectin cảm ứng có thể là bột cà rốt, bột táo, bột linh lăng…
Giống Aspergillus niger được nuôi cấy trên môi trường với những nguồn
carbon khác nhau như: pectin, tinh bột, lactose, saccharosse, maltose,
galactose nồng độ 2, 4, 6% sẽ cho pectinase có hiệu suất cao. Tuy nhiên
trên môi trường nuôi cấy chỉ có monosaccharide và glycerine thì hoàn toàn
không thể sinh tổng hợp enzyme này.
Đường glucose có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp enzyme pectinase
trên môi trường nuôi cấy, là pectin và lactose đối với loài Asp.niger,
Asp.awamori.
Tác dụng ức chế còn thấy ở fructose và saccharose với nồng độ cao
23
Vi sinh vật dò dưỡng nguồn thức ăn cacbon làm cả 2 chức năng: nguồn
dinh dưỡng và nguồn năng lượng
Trong công nghiệp lên men nguồn rỉ dường là nguồn cacbon rẻ tiền rất
thích hợp sử dụng đối với các loại vi sinh vật khác nhau.
• Nguồn Nitơ:
Nguồn Nito dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH
3
và NH
4
+
Nếu dùng kết hợp Nitơ hữu cơ với vô cơ sẽ có tác dụng tốt đến quá tình
sinh tổng hợp pectinase. Muối nitrate là nguồn thức ăn Nito thích hợp đối
với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều nấm
men và vi khuẩn. Và muối nitrate kim loại kiềm lại kìm hãm tổng hợp

enzyme này do các ion kim loại kiềm sẽ làm kiềm hóa môi trường. Để
tránh hiện tượng này, người ta thường sử dụng muối NH
4
NO
3
để làm nguồn
Nito cho nhiều loài vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH
4
+
thường được hấp thụ
trước rồi mới đến gốc NO
3
-
Những hợp chất Nitơ hữu cơ: nước chiết từ bột lac, cao ngô, đậu tương,
mầm mạch, cám, pepton…
Những hợp chất Nitơ vô cơ: amone sulfat (NH
4
)
2
SO
4
, amone phosphate
(NH
4
)
3
PO
4
, amone nitrate NH
4

NO
3
.
- Đối với Asp.niger, nguồn N tốt nhất để tổng hợp pectinase là phosphate
diamone, muối này cho kết quả còn trội hơn khi dùng các nguồn N hữu cơ
như pepton, cazein thuỷ phân.
- Đối với Asp.awamori, nguồn N vô tốt nhất là amone sulfat. Các nguồn
N hữu cơ: pepton, cazein thuỷ phân hoàn toàn ức chế sự tạo thành enzyme
pectinase ở nấm mốc này.
- Đối với nấm mốc Asp.foetidus thì amone sulfat, nước chiết cám, nước
chiết nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực polygalacturonase.
Nguồn Nito hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là
pepton , là chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào
đó
Nói chung, tỷ lệ thích hợp nhất giữa C và N đối với tổng hợp enzyme
pectinase dao động trong khoảng 7:1 – 13:1. còn tỷ số giữa pectin và C là
1:2, 2:2, 3:2, 4:2.
• Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sự
sinh trưởng
Ngoài Carbon, Nitơ, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng đến sự sinh
tổng hợp các enzyme pectinase mà trước tiên là ảnh hưởng đến trạng thái
sinh lý của vi sinh vật, trong đó phospho là cấu tử vô cơ cần thiết cho môi
trường.
24
Các nguyên tố khoáng dùng trong tổng hợp pectinase: K, Ca, Mg, Fe,
Na.
• Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp
nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều có ảnh
hưởng đến sự hình thành enzyme pectinase.
Sự tổng hợp nên enzyme endo-PG, exo-PG và PMG thường xảy ra với

sự sinh trưởng của nấm mốc, chỉ có pectinesterase là bò chậm lại do tác
dụng ức chế của các sản phẩm thuỷ phân pectin.
Polygalacturonase được tổng hợp nên bởi các tế bào sau 8h sinh trưởng
đầu tiên, thì pectinesterase lại được tạo nên bởi các tế bào thuần thục hơn
từ giờ thứ 6 đến thứ 26 của sự phát triển nấm mốc.
Điều kiện nuôi cấy không những ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa
pectinesterase và polygalacturonase mà còn ảnh hưởng đến sự tân tạo ra
những enzyme khác kèm theo như protease, cellulose…
2.2. Môi trường nuôi cấy:
Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme
pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm.
Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối amonium, phosphoric…
Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%.
• Đối với Asp.awamori
Mầm mạch: 0,5%
(NH
4
)
2
SO
4
: 0,7%
KH
2
PO
4
: 0,1%
MgSO
4
: 0,05%

Bã củ cải: 4%
• Đối với Asp.niger
Cám gạo: 70%
Trấu nhỏ: 27,5%
Muối (NH
4
)
2
SO
4
: 2,5%
Độ ẩm: 50% - 55%
Thời gian nuôi: 42h
Dòch chiết cà rốt: 25% so với lượng chất lỏng thêm vào
• Đối với Clostridium pectinofermentants 15
Bã củ cài: 2%
(NH
4
)
2
SO
4
: 0,75%
KH
2
PO
4
: 0,1%
CaCO
3

: 0,3%
Nước chiết ngô: 0,5%
25