tiểu luận môn học xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong lá trinh nữ hoàng cung bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao và điện năng di mao quản

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
Khoa Chăn Nuôi – Thú Y
Môn: Dược Phân Tích
Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong lá
trinh nữ hoàng cung bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao và điện
năng di mao quản
Sv thực hiện:
Ngô Thị Uyên Phương
Trần Thị Thu Thảo
Nguyễn Thị Cẩm Tiên
Triệu Thu Nghiêm
Huỳnh Phú Quý
Huỳnh Thị Kim Thu
GVHD: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG
I. ĐẶT VẤN ĐỀ.

Trinh nữ hoàng cung hay Náng lá rộng, Tỏi
lơi lá rộng, Tây nam văn châu lan, Tỏi Thái
Lan, tên hán văn là Vạn châu lan hay Thập
bát học sỹ

Danh pháp khoa học:Crinum latifolium- là một
loài thực vật có hoa trong họ Amaryllidaceae.

Được miêu tả khoa học đầu tiên năm 1753.

Cây Trinh nữ hoàng cung có nguồn gốc từ Ấn
Độ

Các nước vùng Đông Nam Á như Thái Lan,
Lào, Malaysia, Việt Nam và phía Nam Trung

Quốc…
Phân loại khoa học
Giới (regnum) Plantae
(không phân
hạng)
Angiospermae
(không phân
hạng)
Monocot
Bộ (ordo) Asparagales
Họ (familia) Amaryllidaceae
Chi (genus) Crinum
Loài (species) C. latifolium
Điều trị u phì đại
lành tính tuyến
tiền liệt
Hỗ trợ điều trị u
xơ tử cung

Nhóm hợp chất flavonoid cũng được phân lập và chứng minh có công
dụng chống oxy hóa:
Chất đối chiếu:

Astragalin (98,25%) và isoquercitrin(98,14%) được
phân lập và xác định cấu trúc. Xác định độ tinh khiết
bằng phương pháp HPLC.

Chuẩn nội sử dụng phương pháp CE là
quercetrin (91,34%) do viện kiểm nghiệm
thuốc tp.Hồ Chí Minh cung cấp.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu:
Astragalin, isoquercitrin trong cao flavonoid chiết từ
lá TNHC. Lá TNHC được thu hái tại huyện Tây Sơn
tỉnh Bình Định vào tháng 4 năm 2012 và định danh
bởi PGS. Võ Thị Bạch Huệ - khoa Dược, Đại học Y
Dược TP Hồ Chí Minh.
Trang thiết bị

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance 2695-2996

Máy điện di mao quản Agilent G7100A
Dung môi, hóa chất

Acenitril, methanol dùng cho HPLC

Acid hydrocloric, ethyl acetat

Natri hydroxyd, acid phosphoric,acid boric,
dinatri tetraborat
Phương pháp nghiên cứu

Cân chính xác 10g bột lá TNHC ( độ ẩm 12%)
cho vào cốc có mỏ 250 ml.

Ở 50 0C siêu âm 3 lần, mỗi lần 30 phút với
50ml cồn 70%.

Chiết xuất cao Flavonoid từ lá TNHC:


Dịch chiết cồn được loại tạp và thu hồi dung
môi đến 1/3 thể tích. Acid hóa dịch chiết bằng
HCl 1% đến pH 3-4.

Chiết với 10 ml ethyl acetat (x3 lần), gạn lấy
lớp ethyl acetat để bay hơi đến rắn thu được cao
Flavonoid.
Chuẩn bị mẫu phân tích HPLC

Pha dung dịch đối chiếu
Pha dung dịch chất đối chiếu trong pha động với
nồng độ : Astragalin 250 (µg/ml)
Isoquercitrin 100 (µg/ml)

Dung dịch thử
Hòa tan toàn bộ cao Flavonoid và thêm vừa đủ bằng
pha động tói khi bình được 10 ml.
Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dịch được tiêm vào hệ
thống HPLC.

Điều kiện sắc ký
Cột Phenomenex C8, 250 x 4,6,mm.
Pha động: acetonitril-acid phosphoric 0,1% (20:80).
Nhiệt độ cột: 40 0C. Tốc độ dòng: 1ml/phút.
Chuẩn bị mẫu phân tích CE

Dung dịch điện di nền dinatri tetraborat

Hòa tan 0,8581 g dinatri tetraborat vào 40 ml nước,
thêm 5 ml methanol, điều chỉnh pH đến 9,0 bằng acid

boric, thêm nước để được 50 ml.
Dung dịch đối chiếu
Pha dung dịch đối chiếu trong methanol
Nồng độ của : astragalin 250 (µg/ml)
isoquercitrin 100 (µg/ml)
Thêm vào dung dịch đối chiếu một lượng
chuẩn nội quercetin đạt nồng độ 100 (µg/ml)

Dung dịch thử

Toàn bộ cao Flavonoid được hòa tan và điền đầy bằng
methanol trong bình định mức 10 ml.

Lọc qua màng lọc 0,22 µm, siêu âm 10 phút trước khi
tiêm vào hệ thống CE.
Điều kiện điện di

Cột mao quản silica nung chảy :
Chiều dài tổng cộng: 64,5 cm
Chiều dài hiệu quả: 56 cm
Đường kính trong: 50 µm
Thể tích tiêm mẫu: 50 mbar’ x5 giây
Điện thế: 25 kV
Nhiệt độ cột: 25 0C

Dung dịch đệm dinatri tetraborat 45 mM có 10% methanol,
pH 9,0.

Bước sóng phát hiện cả hai phương pháp: 264 nm.
Khảo sát tính phù

hợp của hệ thống.

Đảm bảo tính lặp lại của thiết bị.

Thực hiện trên mẫu đối chiếu và mẫu thử.

Tiêm 6 phần liên tiếp.
Mẫu Mẫu đối chiếu Mẫu thử
Thông số Isoquercitrin Astragalin Isoquercitrin Astragalin
TR TB 11,9 18,24 11,81 18,25
RSD (%) 0,94 0,84 1,22 1,41
S TB 3381504 8045980 3725993 7636722
RSD (%) 1,52 1,02 1,48 1,29
RS TB - 13,5 - 13,38
RSD (%) - 0,57 - 1,00
H TB 244518 360133 275736 423088
RSD (%) 1,32 0,95 1,68 1,57
α TB - 1,61 - 1,61
AF TB 1,12 1,10 1,09 1,07
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu đối chiếu xác định hàm
lượng astragalin và isoquercitrin trong cao flavonoid chiết từ lá TNHC bằng HPLC.
III. Kết quả và thảo luận
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu định lượng
astragalin và isoquecitrin trong cao flavonoid chiết từ TNHC bằng CE.
Mẫu đối chiếu Mẫu thử
Thông số Astragalin Isoquercitrin Astragalin Isoquercitrin
TR TB 11,12 12,65 11,05 12,60
RSD (%) 0,32 0,45 1,06 1,30
F TB 4,34857 1,73237 3,60148 1,8006
RSD (%) 0,016 0,013 1,11 1,65

RS TB - 12,8 5,01 11,84
RSD (%) - 0,6 1,00 0,84
AF TB 1,31 1,06 1,43 1,28
RSD (%) 1,05 1,28 1,02 1,33
Thẩm định quy trình
1. Tính đặc hiệu
Sắc ký mẫu trắng, mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu, mẫu thử thêm
hỗn hợp đối chiếu theo điều kiện sắc ký đã chọn.
Kết quả: sắc ký đồ HPLC và điện di đồ CE mẫu trắng không có
pic có thời gian lưu trùng với các pic của mẫu đối chiếu.
Sắc ký đồ HPLC và điện di đồ CE của mẫu thử của các pic có
thời gian lưu tương đương với các pic của mẫu đối chiếu.
Khi thêm vào mẫu thử một lượng chất đối chiếu thì có sự tăng
lên về diện tích (hoặc tỷ số diện tích) trong mẫu thử. Phổ UV tại
thời gian lưu của các pic trong mẫu thử giống mẫu đối chiếu.
2. Tính tuyến tính
Pha 6 dung dịch đối chiếu có nồng độ từ 50 đến 1000
(µg/ml)
Độ chính xác:
Thực hiện 6 lần định lượng trên 6 mẫu thử cùng nồng độ và
điều kiện.
Độ chính xác trung gian:
Thực hiện 6 lần định lượng trên 6 mẫu thử cùng nồng độ
trong 6 ngày liên tiếp.

Độ đúng:
Dùng phương pháp trên chuẩn.
Tiến hành sắc ký và điện di theo điều kiện đã chọn.
Isoquercitrin Astragalin
Phương trình hồi qui ŷ = 34148588x ; R2 = 0,9995 ŷ= 31446121x; R2 =0,9991
Khoảng xác định 100-250 (µg/ml) 250-600(µg/ml)
Độ lặp lại (n =6) RSD%= 1,72 RSD% =1,60
Độ chính xác trung
gian
RSD%= 1,99 RSD% = 2,21
Độ đúng (n =9) 103,58% (RSD = 1,23%) 99,89 % ( RSD = 2,29%)
Bảng 3: Kết quả thẩm định quy trình định lượng isoquercitrin,
astragalin bằng HPLC.
Isoquercitrin Astragalin
Phương trình hồi qui ŷ = 15,849x ; R2 = 0,9985 ŷ= 14,274x; R2 =0,9982
Khoảng xác định 100-300 (µg/ml) 250-600(µg/ml)
Độ lặp lại (n =6) RSD%= 1,79 RSD% =2,16
Độ chính xác trung gian RSD%= 2,32 RSD% = 3,15
Độ đúng (n =9) 102,54% (RSD = 1,23%) 99,89 % ( RSD = 2,21%)
Bảng 4: Kết quả thẩm định qui trình định lượng isoquercitrin, astragalin bằng CE
Các hệ số R2 đều lớn hơn 0,99; vì vậy Astragalin và Isoquercitrin có sự tuyến tính giữa
nồng độ Astragalin, isoquercitrin và diện tích pic ( hoặc tỉ số diện tích pic) trong
khoảng nồng độ từ 50 đến 1000(µg/ml).
Các giá trị RSD của kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian đều nhỏ hơn
mức cho phép là 5,3%[1,2]. Như vậy, quy trình đạt độ chính xác.
Tỷ lệ phục hồi các chất đều nằm trong khoảng cho phép từ 90-107%[1,2].
Astragalin
Hàm lượng(ppm)
-định lượng bằng
HPLC

Hàm
lượng(ppm)
-định lượng
bằng CE
279,99 282,85
276,06 274,65
278,75 292,75
274,86 288,00
268,40 271,01
286,91 273,11
TB: 277,49 TB: 280,40
RSD: 2,21% RSD: 3,15%
Isoquercitrin
Hàm lượng(ppm)
-định lượng bằng
HPLC
Hàm
lượng(ppm)
-định lượng
bằng CE
125,8 130,95
124,7 132,06
130,0 129,45
124,7 131,86
125,9 124,30
130,1 127,48
TB: 126,87 TB: 129,35
RSD: 1,99% RSD: 2,32%
Bảng 5: Kết quả định lượng astragalin và isoquercitrin trong lá
TNHC bằng phương pháp HPLC và CE(n=6)

Kết quả phân tích Anova không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa kết quả định lượng
Astragalin và isoquercitrin bằng phương pháp HPLC và CE.
IV. BÀN LUẬN
•
Phương pháp HPLC:

Pha động:
+ Cột C8 (250x4,6 mm) ở
40oC.
+ Acetonitril-acid phosphoric
0,1% (20:80).
+ Tốc độ dòng: 1ml/phút.

Methanol không rửa giải được
các chất cần định lượng.

•
Phương pháp CE:

Các thông số ảnh hưởng:
+ Hệ đệm: Borat, phosphat.
+ pH: 8,5; 9,0; 9,5.
+ Nồng độ: 30 – 50 mM.

Điện thế: 20 – 30 kV.

Nhiệt độ cột: 20- 30oC.

Cần thêm methanol vào.


Điện di đồ: đệm Borat (45mM), pH
9, 10% methanol, 25oC, 25 kV.
Đầy đủ yêu cầu về:
─ Tính tuyến tính.
─ Khoảng xác định.
─ Độ chính xác.
─ Độ đúng.
BÀN LUẬN
Lựa chọn astragalin và isoquercitrin làm chất đối
chiếu là phù hợp vì chiếm hàm lượng cao trên sắc ký đồ
và điện di đồ của mẫu thử ( 264; 346 nm của astragalin
và 256; 353 nm của isoquercitrin).

HPLC: isoquercitrin được rửa giải trước với hệ sắc
ký pha đảo.

CE: astragalin được rửa giải trước (theo đúng cơ
chế hoạt động của phương pháp CE).
BÀN LUẬN