TIỂU LUẬN- KỸ THUẬT GEN TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH SỚM Ở NGƯỜI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN
KỸ THUẬT GEN TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH
SỚM Ở NGƯỜI
GVHD: PGS.TS. Khuất Hữu Thanh
SVTH : Nguyễn Thị Hiền
Nguyễn Thị Láng
Kỹ thuật gen trong chuẩn đoán một số bệnh

Ung thư vòm họng do virut Epstein-Barr

Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis

Sốt xuất huyết

chẩn đoán trước sinh bệnh
Teo cơ tủy(SMA)
Loạn dưỡng cơ Duchenne(DMD)
Bệnh alpha- Thalassemia
Tăng thượng thận bẩm sinh(CAH)
….
Chuẩn đoán bệnh
Trực tiếp
Quan sát bệnh phẩm qua kính hiển vi
Nuôi cấy, phân lập vi sinh vật gây bệnh
Huyết thanh bệnh nhân
Kháng nguyên đặc hiệu của vsv trong
mẫu bệnh phẩm
ứng dụng kỹ thuật gen, phát hiện DNA,
RNA của vsv trong mẫu bệnh phẩm

Kỹ thuật gen

Gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền
chiếm một locus nhất định trên nhiễm sắc thể và xác định
một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất
di truyền mã hóa một tính trạng nhất định. Các gen là
những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản
phẩm riêng lẻ như các mRNA được sử dụng trực tiếp cho
tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các chuỗi
polypeptide để gắn lại tạo ra protein có hoạt tính sinh học.
Ngoài ra, gen còn mã hóa cho các tRNA, rRNA,
mRNA…
Kỹ thuật gen - Phương pháp PCR
PCR (polymerase chain reaction): “phản ứng chuỗi
trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen”
Nguyên lý phương pháp PCR

Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase.

Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng
hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.

Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được
thiết kế chuyên biệt, chủ động.
Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật Multiplex PCR

Là phương pháp PCR sử dụng đồng thời cùng 1 lúc
nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau
Ung thư vòm họng


Nguyên nhân: có rất nhiều
giả thiết, nhưng chủ yếu
được chia thành ba nhóm:
do virut Epstein-Barr, do
di truyền và do các yếu tố
môi trường, tập quán ăn
uống, hoá chất
Virut Epstein-Barr

Hệ gen của EBV là chuỗi
ADN xoắn kép, mạch hở,
kích thước khoảng 172 kb.
Hệ gen của EBV gồm 6 tổ
hợp gen mã hóa cho các loại
protein kháng nguyên, ký
hiệu là EBNA (EBNA-1,
EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-
3B, EBNA-3C và EBNA-
LP) và 3 tổ hợp gen mã hóa
cho protein màng là LMP-1,
LMP-2A và LMP-2B
Trình tự mARN gen LMP-1 của EBV (1.116 bp)
Phản ứng PCR

LMP1F (mồi xuôi):
5’-ATGGAACGCGACCTTGAGAG-3’

LMP1R (mồi ngược):
5’-TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC-3’


Sản phẩm của toàn bộ gen LMP-1 có kích thước 1,3 - 1,35 kb
Chuẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc

Theo thông báo của Tổ
chức Y tế Thế giới, bệnh
lao đang là vấn đề khẩn
cấp toàn cầu, mỗi năm trên
thế giới có thêm gần 9
triệu người mắc bệnh lao
(trong đó có 1 triệu là trẻ
em) và gần 2 triệu người
chết do lao.
Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis

Tách chiết DNA trong
mẫu đàm bệnh nhân
/>Các hệ mồi, mẫu dò nhằm phát hiện các kiểu đột biến
katG/315/AGC -> ACC, rpoB/516/GAC -> GTC và
emb/306/ATG -> GTG/CTG/ATA/ATC/ATT
Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi
và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

katG/315/AGC ->ACC

rpoB/516/GAC -> GTC
Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi
và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

emb/306/ATG ->GTG (biểu đồ màu xanh)


emb/306/ATG ->ATA (biểu đồ màu đỏ)
Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi và mẫu dò
nhằm phát hiện đột biến

katG/315/AGC ->ACC

rpoB/516/GAC -> GTC
Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi
và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

emb/306/ATG ->GTG (biểu đồ màu xanh)

emb/306/ATG ->ATA (biểu đồ màu đỏ)
Kết quả
Cả ba biểu đồ: tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín
hiệu nền từ mẫu có nồng độ amplicon 107 copy/ml
với chu kỳ ngưỡng Ct giảm dần đến mẫu có
nồng độ 102 copy/ml. Mẫu có nồng độ 10
copy/ml thì có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn
tin hiệu nền.
Chuẩn đoán sốt xuất huyết

Sốtxuất thuyết là do virus Dengue (có 4 type: 1, 2, 3, 4). Là
bệnh lý nguy hiểm đe doạ tính mạng cần được chẩn đoán phát
hiện sớm.

Phương pháp ELISA phát hiện IgM không thể giúp chẩn đoán
sơm nhiễm Dengue (phải sau ngày thứ 4 của bệnh)


RT-PCR Dengue có thể giúp chẩn đoán sớm SXH ngay trong
những ngày đầu của bệnh, và còn định được type Dengue

Chẩn đoán phát hiện sớm SXH rất có giá trị để điềutrị và theo
dõi bệnh
Chẩn đoán trước sinh bệnh thiếu máu
huyết tán Alpha - Thalassemia

Alpha -Thalassemia: bệnh di truyền lặn NST thường do
đột biến gen HbA, nằm trên cánh ngắn NST 16(16p13.3)
gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi alpha globin.

Alpha -Thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố
phổ biến nhất, là nguyên nhân hàng đầu gây hiện tượng
phù thai.
Chẩn đoán trước sinh bệnh
Alpha-Thalassemia

Vùng gen α-globin gồm 2 gen: HbA1 và HbA2

Các đột biến thường gặp gây Alpha-Thalassemia gồm:
mất đoạn lớn dạng SEA, thailand, philipin, α4.2, α3.7
và các đột biến điểm HbQs, HbCs

Đột biến trên vùng gen α-globin gồm 2 nhóm: gây
mất hoàn toàn số lượng chuỗi α globin và làm giảm số
lượng chuỗi α globin
Chẩn đoán trước sinh bệnh
Alpha-Thalassemia
Đối tượng nghiên cứu


Sản phụ có thai từ tuần 15-25

Hình ảnh siêu âm thai bất thường

Tiền sử sinh con bất thường

Tiền sử gia đình hoặc người thân mắc các bệnh
như teo cơ tủy, tăng sản thượng thận bẩm sinh
Kỹ thuật tiến hành

Nuôi cấy tế bào dịch ối: dịch ối được nuôi cấy trong dung dịch
Amniomax Fluid. Sau 10-14 ngày, thu hoạch các tế bào dịch ối
và rửa sạch bằng dung dịch PBS 1X

Tách chiết DNA từ mẫu ngoại vi và tế bào dịch ối sau nuôi cấy

Kỹ thuật Multiplex PCR: nhận biết sự mất đoạn của 5 đột biến
mất đoạn lớn