Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm

Đồ án tốt nhiệp
MỤC LỤC
1
Đồ án tốt nhiệp
BẢNG CHÚ GIẢI CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ
1 B. Bacillus
2 BĐN Bã đậu nành
3 cfu Số đơn vị khuẩn lạc (colony forming units)
4 DNS Dinitrosalisillic
5 DNA Acid deoxyribonucleic
6 HP Đơn vị hoạt độ protease
7 OD Mật độ quang (Optical Density)
8 TCA Acid trichloacetic
9 SPSS
Phần mềm xử lý thống kê
(Statistical Package for the Social Sciences)
10 UI Đơn vị hoạt độ amylase
2
Đồ án tốt nhiệp
DANH MỤC BẢNG
3
Đồ án tốt nhiệp
DANH MỤC HÌNH ẢNH
4
Đồ án tốt nhiệp
PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong công nghiệp thực phẩm, bên cạnh quá trình tạo ra các chính phẩm có
chất lượng, việc tận thu các phế phụ phẩm là rất cần thiết. Bên cạnh có ý nghĩa
về mặt bảo vệ môi trường, việc xử lý phế phụ phẩm sẽ mang lại hiệu quả kinh tế

cho doanh nghiệp. Một trong những phụ phẩm của công nghiệp thực phẩm phải
kể đến là bã đậu nành. Bã đậu nành là phụ phẩm chủ yếu thu được sau quá trình
chế biến đậu nành thành sữa đậu nành.
Nước ta có điều kiện tự nhiên thuận lợi cùng với kinh nghiệm canh tác
nông nghiệp của nông dân nên diện tích trồng và sản lượng đậu nành thu được
khá cao qua các năm. Tổng cục thống kê Việt Nam và Bộ Nông nghiệp-Phát
triển Nông thôn cho biết: năm 2012 diện tích trồng đậu nành là 119,6 nghìn ha
với tổng sản lượng thu được là 173,7 nghìn tấn. Năm 2013, diện tích trồng đậu
nành là 117,8 nghìn ha với tổng sản lượng 168,4 nghìn tấn. Năm 2014, diện tích
trồng sẽ đạt 120 nghìn ha, sản lượng dự kiến là 176,4 nghìn tấn. Cùng với diện
tích và sản lượng đậu nành không ngừng tăng lên thì lượng bã đậu nành thu
được trong sản xuất sữa đậu nành dự báo cũng sẽ tăng theo.
Hiện nay, một lượng lớn đậu nành được sử dụng để sản xuất sữa đậu nành.
Ở nước ta có các thương hiệu sữa đậu nành lớn như: Vinasoy, Vinamilk, Tribeco.
Với công suất 120 triệu lít/năm ở nhà máy Vinasoy (Quảng Ngãi) và 90 triệu
lít/năm ở nhà máy Vinasoy (Bắc Ninh), các nhà chuyên môn nhận định: Vinasoy
đang dẫn đầu năng lực sản xuất về sản phẩm sữa đậu nành. Tổng lượng bã đậu
nành thải ra hằng năm riêng hai nhà máy của Vinasoy có thể đạt hơn 20 nghìn
tấn/năm.
Bã đậu nành chứa một lượng lớn protein, glucid, chất béo và chất xơ. Vấn
đề đặt ra là bã đậu nành nếu xử lý bằng cách thủy phân các thành phần phức tạp
thành đơn giản, tăng khả năng tiêu hóa và kéo dài thời gian bảo quản thì bã đậu
nành sẽ có nhiều ứng dụng hơn nữa trong ngành thực phẩm, thức ăn gia súc,
phân bón,
Kết quả đạt được trong việc khảo sát khả năng thủy phân bã đậu nành của
nhóm nghiên cứu Đỗ Thị Bích Thủy cho thấy: 2 chủng vi khuẩn thuộc giống
Bacillus là Bacillus subtilis DC5 và Bacillus amyloliquefacien N1 có khả năng
xử lý bã đậu nành tốt [7], [18]. Từ kết quả đạt được, chúng tôi tiếp tục các
nghiên cứu tiếp theo. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành: “ Nghiên cứu xây
dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp. ở quy mô

phòng thí nghiệm”.
PHẦN 2
5
Đồ án tốt nhiệp
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về bã đậu nành (okara)
2.1.1. Sơ lược về bã đậu nành
Bã đậu nành (BĐN) hay còn gọi tắt là bã đậu: là phần rắn còn lại sau khi
lọc trong quá trình sản xuất đậu phụ, sữa đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành
khác.
Trên thế giới, từ ngữ thông dụng để chỉ bã đậu nành là “okara”, thuật ngữ
này xuất phát từ Nhật Bản (phát âm theo tiếng Nhật là “oh-KAR-uh”) [53].
Hình 2.1. Bã đậu nành được công ty Vinasoy (Quảng Ngãi) cung cấp
Okara là thứ bã màu trắng hoặc trắng ngà bao gồm các phần không hòa tan
của hạt đậu nành còn lại, khi hạt đậu nành xay nhuyễn được lọc trong sản xuất
sữa đậu nành và đậu phụ. Khi sấy khô, bã đậu nành có màu vàng [33].
Okara là một sản phẩm phụ từ ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành và
đậu phụ. Nó chứa protein, chất xơ có giá trị và có thể được sử dụng trong các
sản phẩm thực phẩm để đáp ứng nhu cầu của thị trường. Tuy nhiên, chúng ta
phải xử lý một cách nhanh chóng để duy trì được các tính chất của nó. BĐN
chứa hầu hết cacbohydrate, một phần protein và một lượng nhỏ phần dầu của hạt
đậu nành. Bã ướt giống như mùn cưa ẩm, nó được cho là giống với cơm dừa về
kết cấu và hình thức, thường được sử dụng như một thành phần thực phẩm trong
món súp Nhật Bản, salad và các món ăn được chế biến từ thực vật [38].
2.1.2. Quy trình sản xuất sữa đậu nành tại công ty Vinasoy
Là một trong những công ty phát triển mạnh về sản phẩm sữa đậu nành,
Vinasoy đã và đang đứng vững trên thị trường ngành sữa Việt Nam. Với tầm
nhìn “trở thành và được công nhận là công ty hàng đầu về những sản phẩm dinh
6
Đồ án tốt nhiệp

dưỡng từ đậu nành tại những thị trường Vinasoy có hoạt động kinh doanh”,
Vinasoy đã tạo ra một thương hiệu vững chắc và được người tiêu dùng ở nước ta
tin cậy.
Với công nghệ sản xuất được đầu tư hiện đại, quy trình công nghệ sản xuất
sữa đậu nành của Vinasoy theo sơ đồ hình 2.2 [55]:
Nguyên liệu
đậu nành hạt
Làm sạch/Phân loại
Khử hoạt tính enzyme
Trích ly
Nghiền
Dịch đậu nành
Nước
Đường
Phụ gia
Hương
Hòa trộn
Phân phối
Lưu kho
Đóng thùng
Dán ống hút
Đóng gói vô trùng
Trữ lạnh
Tiệt trùng (UHT)
Đồng hóa
Bã đậu nành
7
Đồ án tốt nhiệp
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu nành ở công ty Vinasoy (Quảng Ngãi)
Đậu nành nguyên liệu được cung cấp bởi các nhà cung cấp có uy tín với

nguồn gốc rõ ràng, đáp ứng yêu cầu chế biến và vệ sinh thực phẩm. Hạt đậu
nành được qua hệ thống làm sạch-phân loại để loại bỏ các tạp chất và phân loại
hạt. Qua quá trình nghiền thô và nghiền tinh với nước nóng, đậu nành hạt
chuyển sang dạng dịch, các chất dinh dưỡng được hòa tan. Hệ thống ly tâm sẽ
trích ly phần lớn các tinh chất có trong đậu nành.
Các enzyme không có lợi cho sản phẩm như lypoxygenase và anti-tripsin
được loại bỏ hoàn toàn qua quá trình xử lý nhiệt và bài khí. Dịch đậu nành thu
được được hòa trộn các thành phần nguyên liệu khác như: đường, nước, dịch mè
đen nguyên chất, hương liệu, phụ gia, để tạo ra sản phẩm có thành phần dinh
dưỡng hài hòa, cân đối. Đồng thời, quá trình đồng hóa giúp đồng nhất các thành
phần trong sữa. Chế độ xử lý tiệt trùng hiện đại UHT đảm bảo tiêu diệt vi khuẩn
gây hại mà vẫn giữ nguyên hương vị của sản phẩm. Sản phẩm được đóng gói vô
trùng trong bao bì hộp giấy phù hợp với tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm để
phân phối ra thị trường tiêu thụ.
Trong quá trình sản xuất, sau khi trích ly thu được dịch sữa đậu nành, phần
bã tách ra chính là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất. Phần lớn BĐN được
bán lại cho các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi. Đây là đối tượng nghiên cứu
trong bài.
2.1.3. Thành phần hóa học của bã đậu nành
Okara là một sản phẩm phụ từ ngành công nghiệp sữa đậu nành. Okara thô còn
gọi là bột đậu nành, là một vật liệu có màu vàng nhạt, gồm các chất không hòa tan từ
hạt đậu nành còn lại trong túi lọc khi đậu nành xay nhuyễn được lọc cho các sản xuất
sữa đậu nành (O'Toole,1999). Okara được làm giàu từ các polysaccharides ở thành tế
bào của hạt đậu nành. Đặc tính của sản phẩm phụ này là bao gồm cả protein, dầu,
8
Đồ án tốt nhiệp
chất xơ, thành phần khoáng, các monosaccharides và oligosaccharides cũng có thể
được tìm thấy trong đó [37].
Okara có ít chất béo, nhiều chất xơ gồm: cellulose, hemicellulose và lignin, và
cũng chứa protein, canxi, sắt, và riboflavin. Trên cơ sở okara khô chứa 24%

protein, 8÷15% chất béo, và 12÷14,5% chất xơ thô, ít tinh bột hoặc carbohydrate
đơn giản (O'Toole, 1999) [25].
Okara ướt từ sản xuất sữa đậu nành có độ ẩm khoảng 80%. Okara sau
quá trình ly tâm có thể có độ ẩm nhỏ hơn 65%. Hàm lượng protein của bã đậu
nành khác nhau tùy từng loại và phải được kiểm tra để xác định chính xác tỷ
lệ phần trăm. Một số nguồn tin cho rằng BĐN khô có 24÷40% protein đậu
nành, nhưng theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (Cẩm nang “Dinh dưỡng người,
thông tin dịch vụ Nông nghiệp số 16/8”) okara ướt có khoảng thành phần
dinh dưỡng trên bảng 2.1:
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trên 100 gam BĐN ướt.
Thành phần Giá trị Đơn vị
Năng lượng 77 Kcal
Nước 81,6 g
Protein 3,2 (16% chất khô) g
Cacbohydrate 12,5 g
Chất xơ 4,1 (21% chất khô) g
Canxi 80 mg
Sắt 1,3 mg
Thiamin (B1) 0,02 mg
Riboflavin (B2) 0,02 mg
Niacin (B3 hay PP) 0,1 mg
Các giống đậu nành khác nhau cũng như quá trình sản xuất các sản phẩm
từ đậu nành khác nhau sẽ cho ra BĐN với mức chất dinh dưỡng có phần khác
biệt nhau. BĐN giàu chất xơ và protein, nó cũng chứa isoflavone. Do các thành
phần đặc biệt này mà BĐN có tiềm năng lớn cho việc sử dụng trong ngành công
nghiệp thực phẩm như một thành phần chức năng [33].
Thành phần tương đối, khoáng chất và vitamin trên cơ sở chất khô của bã
đậu nành trên 3 giống đậu nành khác nhau được thể hiện qua bảng 2.2:
Bảng 2.2. Thành phần tương đối, khoáng chất và vitamin trên cơ sở chất khô
của BĐN của 3 giống đậu nành khác nhau [41]

Các thành phần tương đối (g/100g) Vitamin (mg/g)
9
Đồ án tốt nhiệp
Giống Protein
Chất
béo
Cacbohydrates
Phytic
acid
Chất
xơ
Thiamin
(B1)
Riboflavin
(B2)
Nicotinic
acid
(B3)
Edgar 28,4 9,6 5,3 0,5 56,6 0,59 0,04 1,01
Hutton 25,4 10,9 3,8 1,2 1,2 0,49 0,03 0,82
Prima 26,2 9,3 4,6 0,9 0,9 0,48 0,03 1,04
Khoáng chất (mg/100g)
Tro Ca Mg Fe Na K Cu Zn
Edgar 3200 260 163 6,2 16,2 1046 1,1 3,8
Hutton 3700 428 158 7,2 19,1 1094 1,1 3,5
Prima 3000 286 165 8,2 18,4 1233 1,2 6,4
Trong thành phần cacbohydrates của BĐN có chứa: rafinose và stachyose
là hai thành phần đường phức tạp khó tiêu hóa. Theo tác giả Nguyễn Đức Lượng
thì BĐN có thành phần hóa học như sau [9]:
+ Protein: 3÷4%

+ Lipid: 1÷2%
+ Glucid: 5÷6%
+ Độ ẩm: 8÷90%
Thành phần trong BĐN của Vinasoy (Quảng Ngãi) được Nguyễn Thị
Thanh Tịnh (Đại học Bách Khoa Đà Nẵng) phân tích vào năm 2012, thể hiện
dưới bảng sau [20]:
Thành phần hóa học bã đậu nành (g/100g)
Protein Xenluloza Đường tổng Đường khử Photpho
6,46 79,37 3,82 0,12 0,092
Theo công bố của Li Bo và cộng sự (2012) thì thành phần hóa học của
okara sẽ phụ thuộc vào số lượng giai đoạn nước chiết xuất từ đậu nành và lượng
nước tiếp tục được bổ sung để trích xuất các thành phần chiết dư. Nó cũng phụ
thuộc vào các giống đậu nành và các phương pháp sản xuất, gồm: 46,3% chất
xơ, 17,8% protein, 5,9% lipid, tro 3,9%, 2,6% đường khử, 0,22% flavone và
6,7% ẩm. Một số thành phần của đậu nành khác cũng có khả năng hiện diện
trong bã đậu nành, bao gồm: isoflavones, lignans, phytosterol, counestans,
saponin và phytates [36].
Đối với bã đậu nành được cung cấp từ nhà máy sữa đậu nành Vinasoy
(Quảng Ngãi), chúng tôi đã xác định được một số thành phần như sau:
+ Protein thô (protein toàn phần): 4,252%.
10
Đồ án tốt nhiệp
+ Hàm lượng đường khử: 0,035%.
+ Độ ẩm: 84,9%
2.1.4. Ứng dụng của bã đậu nành
Bã đậu nành chỉ là một phế phụ phẩm, tuy nhiên hàm lượng chất dinh
dưỡng chứa trong nó là rất cao. Đặc biệt là thành phần protein còn lại có thể lên
đến 4% hoặc cao hơn tùy giống đậu nành và điều kiện sản xuất các sản phẩm từ
đậu nành. Đó là một trong những nguồn nguyên liệu cho ngành chăn nuôi và cả
ngành hóa thực phẩm.

Một số ứng dụng của bã đậu nành: [38]
 Làm thức ăn chăn nuôi: hầu hết bã đậu nành được sử dụng làm thức ăn chăn
nuôi cho các hộ chăn nuôi ở gần cơ sở sản xuất đồ uống từ đậu nành. Vì: bã đậu
nành cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cho quá trình chăn nuôi; các nhà chăn
nuôi có nhu cầu cần sử dụng bã đậu nành trong chăn nuôi; sử dụng bã đậu nành
nhằm làm giảm chi phí thức ăn và tận dụng nguồn nguyên liệu tại chỗ.
 Làm chất nền (cơ chất) cho quá trình lên men: Tiềm năng sử dụng bã đậu nành
như một cơ chất cho quá trình lên men ethanol hoặc sản xuất metan đã được
xem xét và có tính khả thi.
 Làm phân bón: trong trường hợp nhu cầu chăn nuôi là không đủ lớn để sản xuất,
okara có thể chuyển hướng để xử lý tạo các chất dinh dưỡng cho cây trồng và
đất.
 Làm thức ăn cho thú cưng: okara có thể được sử dụng trong thức ăn cho thú
cưng vì nó chứa hàm lượng lớn các chất và protein. Để sử dụng được, nó phải
được sấy khô và tạo thành dạng hạt để dễ dàng đưa vào thức ăn cho thú nuôi.
 Làm thực phẩm: okara có thể sử dụng trong một loạt các sản phẩm thực phẩm.
Nó có thể sử dụng ở dạng ướt, dạng khô hoặc như là một trong các sản phẩm
thực phẩm dạng bột nhão khác.
Polysaccharides từ chất xơ rất quan trọng trong số các hợp chất chức năng
có vai trò được biết đến trong nhiều quá trình sinh lý và ngăn ngừa các bệnh
khác nhau. Trong những năm gần đây, đã có một xu hướng tìm kiếm các nguồn
chất xơ mới có thể được sử dụng như là thành phần trong các ngành công nghiệp
thực phẩm. Okara khô chứa khoảng 50% chất xơ và 25% protein, do đó, nó là
một nguồn chất xơ tuyệt vời, như vậy có thể được thêm vào các loại thực phẩm
khác nhau [38].
Okara là một loại thực phẩm đã được nhắc đến từ lâu, nhưng khả năng ứng
dụng của nó chỉ theo quy mô nhỏ. Mặc dù được sử dụng trong một số sản phẩm
thương mại từ những năm 1970, nhưng nó vẫn không được sử dụng rộng rãi trên
11
Đồ án tốt nhiệp

thế giới. Các cơ sở sản xuất đồ uống từ đậu nành với quy mô lớn không sử dụng
hoặc bán bã đậu nành cho các mục đích thực phẩm.
Theo Catharina và cộng sự (1999) thì việc sử dụng chính của okara là làm
thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, có những cách khác nhau để sử dụng okara làm
thực phẩm. Ví dụ, trong một số vùng của Trung Quốc, okara được muối cùng
gia vị và phục vụ như dưa chua, hoặc đơn giản làm thành một món ăn với thịt và
rau. Ở nhiều vùng khác của Trung Quốc, okara được ép thành bánh và để lên
men trong khoảng 10÷15 ngày cho đến khi các bánh đậu được bao phủ bằng
màu trắng của sợi nấm Rihizopus. Các loại bánh được phơi khô dưới ánh nắng
mặt trời và sau đó chiên hay nấu với rau. Một sản phẩm tương tự cũng phổ biến
ở Indonesia gọi là tempeh-gembus. Đôi khi, okara có thể trộn với đậu nành trước
khi lên men. Nhận thức thấy những lợi ích của chất xơ trong sức khỏe con
người, nên sự quan tâm ngày càng tăng trong việc sử dụng okara như một thành
phần thực phẩm. Ví dụ, có thể dễ dàng sấy khô okara bằng thiết bị sấy trống
quay cho sản phẩm khô, sau đó bã đậu nành khô có thể được tiếp tục xay thành
bột trước khi được sử dụng như một thành phần thực phẩm nhiều chất xơ [28].
Qua đó cho thấy, bã đậu nành là phụ phẩm có tiềm năng lớn trong sản xuất
thực phẩm, hóa học, bên cạnh việc sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi.
2.1.5. Tình hình nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành trong nước
Với hàm lượng protein khá cao cùng với thành phần khoáng chất phong
phú, lại chứa lượng lớn chất xơ, nên nhiều nhà khoa học nhận thấy đây là một
phụ phẩm có tiềm năng nghiên cứu ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và
hóa học, không chỉ đơn thuần là làm thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, những
nghiên cứu ứng dụng từ bã đậu nành ở nước ta là không nhiều, đặc biệt là những
nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành trong thực phẩm.
Từ những phân tích thành phần của bã đậu nành, những năm gần đây, ở
nước ta đã có một số đề tài nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành:
Năm 2004, Ngô Đại Nghiệp (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ
trẻ) đã nghiên cứu “Tận dụng bã đậu nành từ công nghiệp sản xuất sữa đậu nành
chế biến tương xay và một số sản phẩm phụ” và đề tài “Nghiên cứu sản xuất

tương xay từ bã đậu nành”. Kết quả kiểm nghiệm cho thấy tương thành phẩm có
giá trị dinh dưỡng cao. Phương pháp chế biến này đã tận dụng nguồn tài nguyên
phế liệu dồi dào, rẻ tiền để chế biến thành loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao, có lợi cho sức khỏe và góp phần bảo vệ môi trường [48].
Bã đậu nành đã qua xử lý kỹ thuật có thể thay thế 10÷17% bột mì trong sản
xuất bánh mì, cookie và cracker. Đồng thời, làm cho bánh giàu chất xơ, một
thành phần dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, Đó là kết quả của đề tài “Nghiên
cứu công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ” do
12
Đồ án tốt nhiệp
Lại Mai Hương (Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh) làm chủ nhiệm đề
tài thu được từ năm 2007 [47].
Năm 2013, Nguyễn Thị Thanh Tịnh đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá
trình thuỷ phân và lên men axit xitric từ bã đậu nành bằng Aspergillus oryzae
và Aspergillus niger”. Đề tài đã thu được một số kết quả: sau khi khảo sát
thời gian thủy phân thì nhận thấy với thời gian là 6 ngày, hiệu quả quá trình
lên men axit xitric cao nhất là 8,24g/100g bã, đã đề xuất quy trình công nghệ
thủy phân - lên men axit xitric từ bã đậu nành sử dụng nấm mốc Aspergillus
oryzae thủy phân cơ chất và Aspergillus niger để lên men tạo axit xitric. Kết
quả nghiên cứu này có ý nghĩa trong việc góp phần làm giảm thiểu các vấn đề
xử lý chất thải trong công nghiệp thực phẩm và đồng thời sản xuất axit hữu
cơ có tầm quan trọng, có giá trị cho ngành công nghiệp thực phẩm cũng như
các ngành công nghiệp khác [20].
Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí
nghiệm hoặc chỉ ứng dụng ở một số cơ sở nhỏ, chưa được ứng dụng và phát
triển như một quy trình sản xuất công nghiệp.
Các thành phần hóa học trong bã đậu nành như các loại đường (rafinose,
stachyose) và chất xơ đều là những thành phần khó tiêu hóa ở người và động
vật. Việc sử dụng các chủng vi khuẩn, để thủy phân các thành phần này thành
các thành phần đơn giản hơn sẽ góp phần xử lý BĐN và ứng dụng sản phẩm

thủy phân này trong các ngành công nghiệp khác mà đặc biệt là trong công
nghiệp thực phẩm.
2.1.6. Tình hình nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành ở nước ngoài
Hằng năm, một lượng rất lớn BĐN được tạo ra trên toàn thế giới. Tại Nhật
Bản khoảng 800.000 tấn, ở Hàn Quốc khoảng 310.000 tấn, và ở Trung Quốc
khoảng 2.800.000 tấn BĐN được tạo ra từ ngành công nghiệp sản xuất đậu hũ
mỗi năm.
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên các thành phần hóa học, dinh dưỡng
và việc sử dụng okara. Tuy nhiên, rất ít báo cáo được tìm thấy trong các tài liệu có
nêu về các đặc điểm cấu trúc của polysaccharides trong okara. Các kiến thức về cấu
trúc có thể giải thích các mối quan hệ chức năng và cấu trúc của polysaccharides
okara cũng như cho phép sử dụng okara trong thực phẩm chức năng khác nhau.
Mục đích của việc này là để điều tra các đặc điểm cấu trúc của polysaccharides từ
okara thông qua khai thác liên tục với các giải pháp khác nhau. Li Bo và cộng sự
(2012) đã xác định được một số đặc điểm cấu trúc của polysaccharides của BĐN,
từ những kết quả đã chỉ ra trong BĐN có thể chứa galactan, arabinan,
13
Đồ án tốt nhiệp
arabinogalactan, xylogalacturonan, rhamnogalacturonan, xylan, xyloglucan và
cellulose [36].
Gần đây, trong một số thí nghiệm đã cho thấy okara là một nguồn tiềm
năng của các thành phần chống oxy hóa (Amin & Mukhrizah, 2006), thấy rằng
một sản phẩm thủy phân protease từ okara có khả năng hoạt động chống oxy hóa
(Yokomizo, Takenaka, và Takenaka, 2002). Kết quả nghiên cứu của Préstamo và
cộng sự (2007) đã kiểm tra được tác động của okara ở chuột đã kết luận rằng:
okara có thể có ích như một thành phần phụ bổ sung vào khẩu phần ăn và có thể
bảo vệ môi trường ruột về khả năng chống oxy hóa và probiotic (Jimeınez-
Escrig, Tenorio, Espinosa-Martos, & Rupérez, 2008). Trong mô phỏng các điều
kiện sinh lý, okara có thể giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng
(Jiménez-Escrig và cộng sự, 2010). Đặc biệt, protein được cô đặc từ okara và

thu được kết tủa, tiếp theo cho enzyme thủy phân để giải phóng peptide có hoạt
tính sinh học tiềm năng [37].
Wua Jinhong và cộng sự (2012) đã tiến hành thủy phân BĐN bằng chế
phẩm viscozyme L để thu các oligosaccharides của BĐN, sản lượng thu được
sau thủy phân có thể đạt tối đa 10%. Các oligosaccharides này có đặc tính và
chức năng sinh học như chất chống oxy hóa, có khả năng ứng dụng trong thực
phẩm chức năng và các ứng dụng khác trong thực phẩm sẽ tiếp tục được nghiên
cứu trong tương lai [44].
Xu và cộng sự (2012), đã tiến hành nghiên cứu quá trình lên men BĐN tạo
sản phẩm “meitauza” (là từ gọi chung cho sản phẩm BĐN lên men ở Trung
Quốc) từ hai chủng nấm mốc Actinomucor elegans và vi khuẩn Zymomonas
mobilis. Nghiên cứu tập trung vào những thay đổi về hóa học, vật lý và sự thay
đổi cấu trúc của hệ vi sinh vật để đo lường sự phát triển của hai chủng vi khuẩn
đã sử dụng và đánh giá chất lượng sản phẩm [43].
BĐN tươi có độ ẩm lớn cùng với hàm lượng chất dinh dưỡng trong đó rất
phù hợp cho vi khuẩn gây thối phát triển. Do đó, vấn đề bảo quản BĐN là vấn
đề được quan tâm. Nhiều tác giả ở nước ngoài (Chung và cộng sự, 1978;
Fujigami và cộng sự, 1980; Hirotsuka và cộng sự , 1987) đã nghiên cứu chế độ
sấy để kéo dài thời gian bảo quản BĐN.
Một số công trình nghiên cứu khác lại tập trung thu nhận các hợp chất dinh
dưỡng và hợp chất có tính chất công nghệ khác trong BĐN: Viswanathan và
cộng sự (2012) đã nghiên cứu khả năng tách chiết protein từ BĐN sau khi
nghiền. Công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, với kích thước BĐN sau nghiền
nhỏ hơn 75 µm sẽ cho hiệu suất tận thu protein cao nhất [42]. Chan và cộng sự
(1999) chỉ ra rằng, protein trong BĐN có tỷ lệ cân đối của các axit amin. Do tác
14
Đồ án tốt nhiệp
dụng nhiệt nên protein trong BĐN còn lại của quá trình chế biến sữa đậu nành bị
biến tính và mất đi một số chức năng công nghệ. Vì vậy, Chan và cộng sự đã
tiến hành nghiên cứu phương pháp tách chiết protein từ BĐN để tăng khả năng

tiêu hóa chúng, khả năng tạo bọt và tạo nhũ của sản phẩm [29].
Từ tổng quan trên cho thấy: nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng BĐN đã
được thực hiện bởi các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới, có thể nói BĐN
là một phụ phẩm đầy tiềm năng trong ngành thức ăn chăn nuôi và công nghiệp
thực phẩm.
2.2. Tổng quan về Bacillus sp.
Từ “Bacillus” nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi quan
sát dưới kính hiển vi. Nó xuất phát từ Tiếng Latin, có nghĩa là hình que. Do đó,
một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn. Bacillus là một chi thuộc các trực
khuẩn gram dương sinh nội bào tử. Trong phân loại khoa học, nếu xếp đầy đủ
theo thứ tự từ giới đến chi sẽ là: giới: Bacteria; ngành: Firmicutes; lớp: Bacillii;
bộ: Bacillales; họ: Bacillaceae; chi: Bacillus [54].
(a) (b)
Hình 2.3. Hình ảnh tế bào vi khuẩn B. subtilis (hình a), vi khuẩn B. coagulans
(hình b) (Nguồn:[50],[51])
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả
trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ
19. Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả
năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường
sống. Bacillus phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến
dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại
Dương [21].
Đặc điểm của các loài thuộc chi Bacillus là có tế bào hình que, thẳng, thay
đổi nhiều về kích thước (nhỏ, trung bình hoặc lớn; 0,5÷1 x 2÷10µm) và có hình
dạng (dày hoặc mỏng). Chúng đứng đơn độc hoặc thành chuỗi, có thể di động
15
Đồ án tốt nhiệp
hoặc không di động, ưa ấm hoặc ưa lạnh, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Tất
cả đều tạo thành nội bào tử có hình cầu hoặc hình oval nhỏ hoặc lớn (mỗi tế bào
hình thành một bào tử). Bào tử của chúng có khả năng kháng nhiệt. Bacillus gồm

nhiều loài và có vai trò quan trọng trong thực phẩm. Enzyme ngoại bào từ một số
loài và chủng thuộc chi này có khả năng thủy phân hydratcacbon, protein, lipid và
được sử dụng trong chế biến sinh học thực phẩm. Chúng có mặt trong đất, bụi và
các sản phẩm thực vật (đặc biệt là các đồ gia vị). Ngoài ra, một số loài trong chi
này có thể gây bệnh phát sinh từ thực phẩm khi chúng tồn tại trong thực phẩm,
điển hình nhất là B.cereus. Và có thể gây hư hỏng thực phẩm, đặc biệt là thực
phẩm đóng hộp (các loài thường thấy là B.coagulans, B.stearothemophilus) [1].
Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus thường gặp: B. amyloliquefaciens,
B. anthracis, B. cereus, B.coagulans, B.lichenifomis, B. pumilus, B. sphaericus,
B. subtilis, B. thuringensis, B.stearothemophilus.
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về
hình thái. Các loài thuộc Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh
vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao trùm
hàng loạt lĩnh vực: từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ
lên men hiện đại, sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ
phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu. Chính vì
lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về chi Bacillus này cũng
như mở rộng ứng dụng của chúng đối với đời sống con người [45].
Bên cạnh các loài vi khuẩn gây bệnh cho con người như B. anthracis và B.
cereus, nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B. subtilis, có tiềm năng
sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong nông nghiệp và
trong công nghiệp thực phẩm. Vì lẽ đó, Bacillus đã được quan tâm nghiên cứu ở
mọi cấp độ trong tế bào như giải mã trình tự genome. Nghiên cứu cơ chế điều
hòa biểu hiện enzyme và protein, sàng lọc các chất hoạt tính sinh học từ các sản
phẩm trao đổi chất bậc hai cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại
trong phân loại vi sinh vật ở cấp độ loài và dưới loài [21].
Trong nhiều thập kỷ qua, các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus như: B.
amyloliquefaciens, B. subtilis, B. lichenifomis được sử dụng để sản xuất các
enzyme ngoại bào theo quy mô công nghiệp cũng như làm thành phần chính
trong nhiều sản phẩm hỗ trợ tiêu hóa (men vi sinh). Trong bài này, tôi sử dụng

hai giống vi khuẩn thuộc chi Bacillus để nghiên cứu xử lý bã đậu nành, đó là: B.
subtilis DC5 được phân lập từ dưa cải muối chua và B. amyloliquefaciens N1
được phân lập từ sản phẩm nem chua ở Huế.
16
Đồ án tốt nhiệp
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis (B. subtilis)
2.3.1. Lịch sử phát hiện
B. subtilis đầu tiên được đặt tên là Vibrio subtilis bởi Christian Gottfried
Ehrenberg. Sau đó, vào năm 1872 được Ferdinand Cohn (nhà khoa học cùng
thời với Roberi Koch) đổi tên thành B. subtilis [46].
B. subtilis được phát hiện trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Ban đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh
sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi trong thế chiến 2. Từ những năm 1949 đến 1957,
khi Henry, Albot và cộng sự tách được chủng B. subtilis thuần khiết thì ứng
dụng của vi khuẩn này mới trở nên rộng rãi. Từ đó, thuật ngữ “subtilis therapy”
có nghĩa là “thuốc subtilis” ra đời. B. subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến
và được xem như là sinh vật điều trị các chứng bệnh về rối loạn đường tiêu hóa,
các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy, [17]
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng sử dụng của chủng vi khuẩn này
là rất lớn trong nông nghiệp, thực phẩm, y học, xử lý môi trường. B. subtilis
ngày nay được phân lập từ nhiều nguồn như: đất vườn, một số sản phẩm thực
phẩm lên men, nước thải trong chế biến thủy hải sản,
2.3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của B. subtilis
Theo phân loại vi khuẩn của Bergey (1974), B. subtilis thuộc:
- Giới: Bacteria
- Ngành: Firmicutes
- Lớp: Bacilli
- Bộ: Bacillales
- Họ: Bacillaceae
- Giống: Bacillus

- Loài: Bacillus subtilis.
B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc hay kị khí theo điều
kiện thích nghi, chúng phân bố hầu khắp trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú
trong đất, thông thường đất trồng chứa khoảng 10 đến 100 triệu cfu/g. Đất nghèo
dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn B. subtilis rất hiếm.
Nước và bùn ở cửa sông cũng như ở nước biển cũng có bào tử và tế bào của B.
subtilis [19].
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương. Kích thước từ
0,5÷0,8 x 1,5÷3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi. B. subtilis có khả năng di
động, tế bào có từ 8 đến 12 tiên mao.
17
Đồ án tốt nhiệp
Hình 2.4. Hình thái vi khuẩn B.subtilis (độ phóng đại 1000) [50]
Một đặc điểm quan trọng của vi khuẩn B. subtilis là khả năng hình thành
bào tử. B. subtilis có khả năng sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn
và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8÷1,8 µm. B. subtilis có khả năng hình
thành bào tử theo chu trình tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng
trong môi trường bị cạn kiệt, ). Sự tạo thành bào tử diễn ra gồm nhiều giai
đoạn, quá trình gồm các giai đoạn sau:
- Hình thành những búi chất nhiễm sắc thể,
- Tạo tiền bào tử,
- Hình thành 2 lớp màng ở tiền bào tử,
- Quá trình tổng hợp các lớp vỏ bào tử,
- Giải phóng bào tử.
Bào tử của vi khuẩn B. subtilis gồm một lớp màng ngoài cùng, bên dưới
lớp màng đó là vỏ. Vỏ chứa nhiều lớp, nhờ các lớp vỏ này mà thành phần bên
trong của vi khuẩn không bị tác động của áp suất thẩm thấu, nhiệt, Dưới vỏ là
lớp màng bên trong của bào tử và trong cùng là khối tế bào chất đồng nhất. Bào
tử giúp tế bào vi khuẩn sống tiềm sinh, vi khuẩn có thể ở trạng thái này trong
nhiều năm.

Bào tử có khả năng chống chịu nhiệt độ cao, chịu ẩm, không thuận lợi.
Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào mới
[4]. B. subtilis có thể hình thành lớp màng nhầy (giáp mạc) là một lớp nhầy
lỏng, sền sệt, không rõ bao quanh, còn gọi là capsule. Màng nhầy có thể quan
sát được khi nhuộm bằng mực tàu, sẽ thấy rõ nó nổi lên trên nền sẫm. Thành
phần chủ yếu của lớp màng nhầy này là polypeptid (chủ yếu là acid
18
Đồ án tốt nhiệp
polyglutamic). Chức năng của lớp vỏ nhầy này là bảo vệ, dự trữ, tích lũy và tăng
khả năng bám.
B. subtilis có khả năng sinh các enzyme thủy phân như: amylase, protease,
cellulase, để thủy phân protein, cacbohydrat, Phản ứng sinh hóa dương tính
khi thử catalase, có khả năng sử dụng và khử citrat, khả năng phân giải tinh bột
và một số loại đường như: arabinose, saccharose, manitol, glucose, maltose. B.
subtilis không có hoạt tính lecithinase [11], [24].
2.3.3. Khả năng sinh enzyme của B. subtilis
2.3.1.1. Enzyme nội bào của B.subtilis
Trong tế bào vi sinh vật nói chung và tế bào B. subtilis nói riêng đều có
những enzyme xúc tác các phản ứng hóa sinh. Các enzyme này sinh ra nhằm
tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất trong tế bào của chúng, giúp tế
bào sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên, các enzyme đang nói trên nằm trong tế
bào của vi sinh vật mà không di chuyển ra bên ngoài tế bào. Các enzyme này
chính là enzyme nội bào của vi khuẩn.
Các enzyme nội bào của B. subtilis gồm: các enzyme thủy phân như protease
nội bào, penicilin amidase, catalse, amylase, các enzyme tổng hợp như asparagin,
các enzyme tham gia vào quá trình oxy hóa-khử như dehydrogenase, oxydase, và
các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào.
2.3.1.2. Enzyme ngoại bào của B. subtilis
Hệ enzyme ngoại bào của B.subtilis rất phong phú và đa dạng gồm
protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase.

[31], [35].
Trong đó, enzyme amylase và protease ngoại bào của loài B.subtilis được
nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất.
 Khả năng sinh amylase của B. subtilis
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra B. subtilis là loài có khả năng sinh enzyme
amylase ngoại bào cao.
Theo nghiên cứu của Raul và cộng sự (2014), nhiệt độ và pH có ảnh hưởng
sâu sắc đến enzyme amylase sinh ra bởi một số loài B. subtilis. Nghiên cứu chỉ
ra rằng: nhiệt độ tối ưu là 40
o
C và pH là từ 7÷7,5 [40].
Theo công bố của Đỗ Thị Bích Thủy và cộng sự (2008), B. subtilis C10 có
khả năng sinh amylase ngoại bào cao, và sinh tổng hợp amylase ngoại bào cao là
tại pH= 8. Công bố nghiên cứu vào năm 2012 của Phạm Trần Thùy Hương và
Đỗ Thị Bích Thủy cho thấy chủng B. subtilis DC5 có khả năng sinh amylase
ngoại bào cao [6].
Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có 3 loại amylase được
biết đến nhiều nhất là: α-amylase, β-amylase và γ-amylase (còn gọi là
19
Đồ án tốt nhiệp
glucoamylase). β-amylase và γ-amylase là các exo-enzyme, vì chúng xúc tác
giải phóng maltose và glucose từ α-glucan. Còn α-amylase là một endo-enzyme
vì nó tác dụng thủy phân bên trong mối liên kết glucosid của α-glucan để tạo ra
các oligosaccharides với các mức độ trùng hợp khác nhau.
• α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC.3.2.1.1) đóng vai trò trung
tâm trong quá trình thủy phân tinh bột cả trong tự nhiên và trong công nghiệp.
Một lượng lớn enzyme trong nhóm này được thu nhận từ thực vật và vi sinh vật.
α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau: chúng có khả
năng xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 glucoside nội mạch ở bất kì vị trí nào và
không tuân theo một trật tự nào trong phân tử tinh bột mà không thể phân cắt

các mối liên kết α-1,6. Dưới tác dụng của α-amylase thì amylose bị thủy phân
khá nhanh, sản phẩm tạo thành chứa khoảng 13% glucose và 78% maltose. Tác
dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự, sản phẩm tạo thành
là các dextrin phân trử thấp như maltose, glucose, isomaltose và không cho phản
ứng màu với iod. α-amylase hầu như không tác dụng lên tinh bột nguyên thể và
tác dụng mạnh lên tinh bột đã hồ hóa [15].
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase qua 3 giai đoạn: [15]
+ Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử
cơ chất bị thủy phân, tạo thành một lượng dextrin phân tử thấp đồng thời độ
nhớt của tinh bột giảm nhanh.
+ Giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa được
tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo thành các dextrin phân tử thấp hơn.
+ Ở giai đoạn cuối cùng thì sản phẩm của sự thủy phân bao gồm một
lượng lớn maltose, maltotriose, glucose, và oloigosaccharides.
• β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase, EC.3.2.1.2) xúc tác thủy phân các liên
kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen, polysacchrides đồng loại, phân cắt tuần
tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch. Khi amylosepectin bị tác
động phân giải của enzyme này thì liên kết α-1,4 của chuỗi glucan trong phân tử
nhánh cao được giảm xuống nhưng sự phân cắt sẽ kết thúc khi gặp mối liên kết α-
1,4 glucoside đứng gần kề α-1,6 của chuỗi. β-amylase không thủy phân hạt tinh bột
nguyên mà thủy phân mạnh hồ tinh bột. β-amylase thủy phân 100% amylose thành
maltose, 54 đến 58% amylopectin thành maltose.
• γ-amylase hay còn gọi là glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase, EC.3.2.1.3):
thủy phân được liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu mạch không khử của mạch
tinh bột tạo ra đường glucose. Nó cũng có khả năng thủy phân maltose, isomaltose
và dextrin. B. subtilis hiếm khi sản xuất ra loại enzyme này.
 Khả năng sinh protease của B. subtilis
20
Đồ án tốt nhiệp
Theo nghiên cứu của Đỗ Thị Bích Thủy (2006), chủng B. subtilis có khả

năng sinh enzyme ngoại bào cao. Trong nghiên cứu, nguồn cacbon ảnh hưởng
đến khả năng sinh enzyme protease của B. subtilis lớn nhất là tinh bột. Nguồn
nitơ ảnh hưởng đến khả năng sinh protease là casein.
Đỗ Thị Bích Thủy (2006) cũng đã công bố nghiên cứu ảnh hưởng pH ban
đầu và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis.
Khả năng sinh protease cao nhất của loài này trong nghiên cứu là khi nuôi cấy ở
35
o
C và pH thích hợp nhất là 6 [14].
Protease là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide của protein thu được
theo phản ứng: [15]
Trong các enzyme công nghiệp, enzyme thủy phân chiếm 75% và protease
chiếm khoảng 60% tổng lượng enzyme được tiêu thụ trên thế giới.
Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (1984) đã đề nghị sử dụng
thuật ngữ peptidase để chỉ các enzyme thủy phân mối liên kết peptide (thuộc
phân nhóm E.C 3.4). Thuật ngữ protease được sử dụng một cách rộng rãi hơn
đồng nghĩa peptidase. Các peptidase bao gồm hai nhóm enzyme là:
- Endopeptidase xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide nội mạch.
- Exopeptidase xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide đầu mạch.
Dựa vào sự có mặt các nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động, các
protease được chia làm 4 nhóm sau: serin protease, cystein protease, aspartic
protease và metallo protease.
- Serin protease: Là những protease có nhóm -OH của gốc serin trong trung tâm
hoạt động, có vai trò đặc biệt quan trọng trong hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ phân biệt: Nhóm chymotrypsin và subtilisin.
Hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính.
- Cystein protease: các protease thuộc nhòm này có nhóm -SH trong trung tâm
hoạt động. Các enzyme nhóm này hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính.
- Aspartic protease: hầu hết đều thuộc nhóm pepsin. Nhóm này bao gồm các
enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic protease

có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và hoạt động mạnh ở vùng
pH trung tính.
- Metallo protease: là nhóm protein hoạt động mạnh ở pH trung tính, được tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc và các sinh vật bậc cao.
2.3.4. Giới thiệu về B. subtilis DC5
21
Đồ án tốt nhiệp
Bacillus subtilis DC5 được phân lập từ dưa cải muối chua ở Huế, là loài có
khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao.
Khi nghiên cứu về pH và môi trường nuôi cấy cho B. subtilis DC5 sinh
tổng hợp amylase ngoại bào cao, Phạm Trần Thùy Hương và Đỗ Thị Bích Thủy
(2012) đã công bố rằng: tại pH=5 là giá trị pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp
amylase ngoại bào cao của chủng B. subtilis DC5 trên môi trường thích hợp
(môi trường cơ bản có bổ sung 0,25% lactose). Thời gian nuôi cấy 24 giờ tạo
điều kiện thuận lợi cho B. subtilis DC5 sinh tổng hợp amylase ngoại bào trong
môi trường thích hợp, pH=5, nhiệt độ ban đầu là 35
o
C [6].
Hình ảnh khuẩn lạc B. subtilis DC5 sau 24 giờ và 48 giờ trên môi trường
thạch cơ bản:
Hình 2.5. Khuẩn lạc B. subtilis DC5 sau 24 giờ nuôi trên thạch cơ bản
Hình 2.6. Khuẩn lạc B. subtilis DC5 sau 48 giờ nuôi trên thạch cơ bản
2.4. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens)
2.4.1. Lịch sử phát hiện
22
Đồ án tốt nhiệp
B. amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả
năng sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, B. amyloliquefaciens được
xem như một dòng khác của loài B. subtilis hay là loài phụ B. subtilis subsp.
amyloliquefaciens.

Đến năm 1987, B. amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng
dựa trên kết quả lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B.
lichenfomis, B. pumilus [39].
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens được phân lập từ các hệ
sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau được công bố. Năm 2010, Borriss
và cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen
bằng microarray (microarray-based comparative genome hybridirazation), tính
tương đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt tính sinh học lipopeptide
và polypeptide giữa một nhóm B. amyloliquefaciens DSM 7 không có khả năng
và một nhóm B. amyloliquefacien FZB 42 có khả năng sống cộng sinh trong rễ
thực vật [27].
Ngày nay, nhiều nghiên cứu ứng dụng B. amyloliquefaciens đã được thực
hiện, đa phần là sử dụng loài này trên các môi trường và nhiệt độ thích hợp để
thu enzyme. Nguồn phân lập được B. amyloliquefaciens cũng đa dạng hơn.
2.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của B. amyloliquefaciens
Theo phân loại của Priest và cộng sự (1987), B. amyloliquefaciens thuộc:
- Giới: Bacteria
- Ngành: Firmicutes
- Lớp: Bacilli
- Bộ: Bacillales
- Họ: Bacillaceae
- Giống: Bacillus
- Loài: Bacillus amyloliquefaciens [49].
B. amyloliquefaciens là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, hiếu
khí, hình que và có khả năng di động. Chủng này được nghiên cứu ứng dụng để
sản xuất các chế phẩm sinh học như: chế phẩm kiểm soát bệnh trên thực vật
(Correa và cộng sự, 2009; Rao và cộng sự., 2006), enzyme (Peng và cộng sự .,
2003; Gangadharan và cộng sự., 2008)
Kích thước của tế bào B. amyloliquefaciens từ 0,7÷0,9 x 1,8÷3,0 µm, có
khả năng sinh nội bào tử, nội bào tử sinh ở trung tâm hoặc gần trung tâm tế bào.

Bào tử có dạng hình elip, kích thước nằm trong khoảng 0,6÷0,8 x 1,0÷1,4 µm
23
Đồ án tốt nhiệp
Hình 2.7. Hình ảnh khuẩn lạc B. amyloliquefacien N1
Theo công bố của Trịnh Thành Trung và cộng sự (2013), chủng B.
amyloliquefaciens subsp. Plantarum SP 1901 là vi khuẩn hiếu khí, hình que,
kích thước tế bào từ 3,2÷3,9 x 0,9÷1,0 µm, đứng riêng rẻ hoặc xếp đôi. Chủng
này có khả năng sinh nội bào tử hình trụ, thường nằm lệch về một phía tế bào
nhưng không làm biến dạng hình que đặc trưng của tế bào. Trên môi trường nuôi
cấy thạch cơ bản, khuẩn lạc dạng tròn, có màu trắng sữa. Bề mặt khuẩn lạc khô,
lồi và sần sùi. Mép khuẩn lạc có hình răng cưa [21].
Hoạt tính sinh hóa của B. amyloliquefaciens cho kết quả dương tính với:
oxidase, catalase, nitrate, thủy phân tinh bột, gelatin, casein, esculin, tween 40
và tween 60. Kết quả âm tính với: arginine hydrolase, lysine carboxylase,
ornithine decarboxylase [52].
Cũng như B. subtilis, nhiều nghiên cứu đã cho thấy loài B. amyloliquefaciens
cũng có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao. Trong đó có hai loại enzyme thủy
phân chính là amylase và protease.
2.4.3. Khả năng sinh enzyme của B. amyloliquefaciens
2.4.3.1. Enzyme nội bào của B.amyloliquefaciens
Cũng như loài B. subtilis và các loại vi sinh vật khác, B. amyloliquefaciens
cũng có một hệ enzyme nội bào để giúp quá trình sinh trưởng và phát triển tế
bào như: amylase, protease, catalsae, các enzyme tham gia vào quá trình oxy
hóa-khử: cacboxydehydrogenase, cùng các enzyme chuyển hóa vật chất trong
tế bào.
2.4.3.2. Enzyme ngoại bào của B.amyloliquefaciens
24
Đồ án tốt nhiệp
Bên cạnh hệ enzyme nội bào, hệ enzyme ngoại bào sinh ra của loài B.
amyloliquefaciens được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu thu nhận và

ứng dụng. Đáng quan tâm hơn cả là amylase và protease ngoại bào sinh ra của
loài này.
Nghiên cứu của Khosro và cộng sự (2006) cho biết: B. amyloliquefaciens
có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase,
phytase, nên được nghiên cứu rộng rãi. Hiện nay, chế phẩm enzyme amylase
từ loại vi khuẩn này chiếm khoảng 30% các enzyme tiêu hóa của thế giới sản
xuất [34].
 Khả năng sinh amylase của B. amyloliquefaciens
B. amyloliquefaciens được phân lập từ nhiều nguồn như: sản phẩm tôm
chua, ruột cá, nem chua, Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra B. amyloliquefaciens
có khả năng sinh amylase ngoại bào cao.
Một loài B. amyloliquefacien được phân lập từ tôm chua được nghiên cứu
cho thấy loài này có khả năng sinh amylase ngoại bào cao. Trần Thị Ái Luyến
đã nghiên cứu thu nhận chế phẩm amylase từ chủng B. Amyloliquefacien T9.
Nguồn nguyên liệu tự nhiên gồm: bột đậu nành, bột phế liệu tôm, bột sắn thô và
bột cá được sử dụng cho nghiên cứu do nguồn nguyên liệu này rẻ tiền, dễ kiếm
và có thể thay thế một lượng môi trường tương ứng với các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy sinh enzyme. Kết quả cho thấy: bột phế liệu
tôm và bột sắn thô là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho sự sinh tổng hợp amylase
cao và đạt hiệu quả kinh tế nhất. Thời điểm thu nhận ezyme đạt cực đại và điều
kiện nuôi cấy thích hợp là: 32 giờ, ở nhiệt độ 40
o
C, pH là 6,5. Nghiên cứu cũng
xác định một số tính chất của chế phẩm amylase thu được khi nuôi B.
amyloliquefacien T9 ở môi trường tự nhiên: khoảng nhiệt độ thích hợp cho
amylase hoạt động là 40÷70
o
C trong đó nhiệt độ tối thích là 50
o
C; khoảng pH

thích hợp là 5,0÷7,0 trong đó pH tối thích là 7,0 [8].
Khi thực hiện đề tài “nghiên cứu thu nhận và xác định một số tính chất chế
phẩm amylase ngoại bào từ chủng Bacillus amyloliquefacien R20 phân lập từ
ruột cá nục”, tác giả Hoàng Thị Thúy đã xác định được môi trường thích hợp để
nuôi cấy chủng B. amyloliquefacien R20 phân lập từ ruột cá nục sinh tổng hợp
amylase ngoại bào cao: Môi trường cơ bản có bổ sung thêm 0,5% tinh bột hòa
tan, pH ban đầu thích hợp là 7, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 40
o
C, thu nhận
enzyme sau 24 giờ nuôi cấy là thích hợp nhất [13].
 Khả năng sinh protease của B. amyloliquefaciens
Bên cạnh khả năng sinh amylase ngoại bào, B. amyloliquefaciens cũng có
khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào cao. Năm 2010, Võ Văn Quốc Bảo
và Đỗ Thị Bích Thủy đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh
25