Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ

Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TIỂU LUẬN
HỌC PHẦN: SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài:
DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ
- 1 -
Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:
PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Nguyễn Thị Ái Nhi
Lớp: LL&PP dạy học sinh học- K22
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Huế, 01/2014
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS
Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy giúp em nắm
vững kiến thức trên lớp học. Xin chân thành cảm ơn
các anh chị, các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài
Học viên :
Nguyển Thị Ái Nhi
- 2 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 5
CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP 6
CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR 8
II.1 Các enzyme cắt giới hạn 8
II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì? 8
II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn 8
II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn 8

II.2 Các vector thông dụng trong kỹ thuật di truyền 10
CHƯƠNG 3: CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ 11
III.1 Tế bào chủ nhân sơ 11
III.2 Tế bào chủ nhân chuẩn 12
III.2.1 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 12
III.2.2 Các tế bào chủ thực vật 13
III.2.3 Các tế bào chủ động vật 13
CHƯƠNG 4: TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC
DÒNG DNA TÁI TỔ HỢP 15
IV.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 15
IV.1.1 Tạo nguồn gen 15
a. Thu nhập DNA từ hệ gen ( thư viện gen) 15
b. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học 15
c. Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA) 16
IV.1.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 16
- 3 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
IV.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp 18
IV.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gen 19
CHƯƠNG V: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 21
V.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp với nghiên cứu bộ gen 21
V.2. Công nghệ DNA tái tổ hợp với y-dược học 22
V.2.1 Sản xuất các chế phẩm y-sinh học
bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 22
V.2.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền trong chuẩn đoán và điều trị 26
V.2.3 Kỹ thuật di truyền với hình pháp học 26
V.3 Kỹ thuật di truyền với các sinh vật biến đổi gen (GMOs) 27
- 4 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
MỞ ĐÂU

Vào năm 1972, các nhà khoa học tại trường Đại học Tổng hợp Stenford đã
tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng cách sử dụng enzyme giới hạn cắt
các phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau và nối các đoạn DNA đó bằng enzyme
nối ligase. Phương pháp này ngày càng được mở rộng, đến năm 1973- 1974, nhóm
nhà khoa học Cohen, Henlinski, Boyer đã tạo ra DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh
học. Kỹ thuật mới này được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm invitro để tạo
thành các DNA có hoạt tính, sau đó đưa và gắn vào phân tử DNA khác trong tế
bào sống.
8/1978 Boyer là người cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli. Các
thành tựu đầu tiên này đã mở ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó là
công nghệ DNA tái tổ hợp.
Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen
hay kỹ thuật gen…) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được
dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA.
Từ những lí do trên tôi chọn đề tài tiểu luận của mình là: “ DNA tái tổ hợp
và ứng dụng của nó”
- 5 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1
KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn
vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kĩ thuật ghép
nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài
khác nhau.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,
tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:
Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi cho tế
bào cho (ví dụ tế bào của người) để cung cấp DNA.
Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn được

gọi là phân lập gen.
Bước 3: Cắt cả hai đoạn DNA ( DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng
cùng một loại enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE)
Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị
cắt bởi một loại enzyme giới hạn.
Bước 5: Bổ sung enzyme nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh.
Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ ( ví dụ vi khuẩn E.coli và
nhân dòng.
Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp
và theo dõi hoạt động, biểu hiện gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho.
- 6 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Sơ đồ khái quát của quá trình tạo DNA tái tổ hợp:
- 7 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR
II.1 Các enzyme cắt giới hạn
II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì?
Enzym cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn
(restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu
trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù.
II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn
Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi khuẩn
E.coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được đưa vào (DNA
ngoại lai hay DNA lạ) mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân
cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số ít trường hợp DNA lạ đó mới không bị
phân cắt và nhờ đó có thể tái bản trong tế bào chủ. Các hiện tượng này xảy ra chủ
yếu khi các phage xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn.
Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn là
những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắt

giới hạn. Chúng đều đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ và
DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau. Cụ thể, các enzyme sửa đổi
(methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ bằng cách gắn thêm nhóm methyl ( -
CH
3
) ở một số baze nhất định trong đoạn nhận biết hay đoạn đích (target
sequence). Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hóa hoạt
tính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc hiệu chừng nào
nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giới hạn
- 8 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
đóng vai trò là rào cản bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm
nhập của các phage lạ.
II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn
Các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các vi khuẩn mà không có ở các
eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn thông dụng là tên hệ thống
được biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme
được chiết xuất. Chữ cái đầu tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái
tiếp theo viết thường để chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để
chỉ nòi hoặc chủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòi
người ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống.
Tính chất quan trọng nhất của enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa
là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc hiệu để cắt ở vị trí xác định. Tùy
theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại chính:
- Loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận
biết.
- Loại II bao gồm enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Các
enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng cho phép
thao tác các gen trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Đặc trưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thước ngắn, 4-8 cặp bazo và

có tính đối xứng xuôi ngược (palindrome)
Nhìn chung, các enzyme giới hạn khác nhau có hai kiểu cắt sau đây: cắt lệch
và cắt thẳng. Với kiểu cắt lệch tức là các vị trí cắt trên hai sợi của DNA sợi kép là
so le, tạo ra các đoạn DNA có các đầu sợi đơn gồm một số bazo bổ sung gọi là các
đầu dính (sticky ends). Các enzyme giới hạn như thế có vai trò to lớn trong việc
kiến tạo DNA tái tổ hợp invitro, ví dụ EcoRI và BamHI. Với kiểu cắt thẳng, tức cắt
cùng vị trí trên cả hai sợi của DNA sợi kép, tạo ra các đoạn DNA đầu bằng (blunt
ends), ví dụ Smal…
- 9 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Các enzyme giới hạn khác nhau có đoạn đích giống nhau, mặc dù vị trí và
kiểu cắt có thể giống hoặc khác nhau, gọi là các enzyme giới hạn tương ứng
(izoschizomers), ví dụ Smal và Xmal.
II.2 Các vector thông dụng trong kỹ thuật di truyền
Vector là phân tử DNA nguyên vẹn có kích thước bé hoặc vừa phải, đóng
vai trò là vật trung gian mang truyền đoạn DNA ngoại lai nghiên cứu vào trong tế
bào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con đường biến nạp (transformation) hoặc tải
nạp (transduction).
Có hai loại vector thông dụng là các plasmid và các phage.
Các plasmid vi khuẩn được sử dụng rộng rãi hơn cả, bởi vì chúng có đặc
điểm sau:
(i) Có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ và hoạt động (tái bản, biểu hiện gene)
bình thường
(ii) Có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng tinh chiết.
(iii) Số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khá cao.
(iv) Đặc biệt là, một số plasmid có chứa các gene kháng thuốc tiện lợi cho việc
theo dõi và phát hiện sự só mặt của plasmid tái tổ hợp trong vi khuẩn chủ.
Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda có nhiều ưu thế nhất,
bởi lẽ ở phần giữa của bộ gen có chứa một số gene không quan trọng và không liên
quan với sự tái bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn DNA mong muốn vào

đây. Các phage không chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi các phage
tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan dương tính ( positive plaques) trên
nền vi khuẩn.
- 10 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
CHƯƠNG 3: CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ
Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử dụng
như:
- Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng. Hệ thống tế
bào chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng.
- Dùng để biều hiện gen, đặc biệt ở các sinh vật nhân chuẩn bậc cao như
động vật, thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính phù hợp.
- Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.
Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một loại tế bào chủ thích hợp. Các tế bào chủ
có thể chia làm hai hệ thống chính. Đó là các tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủ
nhân chuẩn.
III.1 Tế bào chủ nhân sơ
Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân
giống, lại chấp nhận được nhiều vector. Vi khuẩn E.coli đáp ứng các yêu cầu của tế
bào chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen. Do
tính chất đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E.coli được nghiên cứu tỷ mỷ về cơ
chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau. Các nghiên cứu đó làm
cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và công nghệ di truyền.
E.coli là vi khuẩn gram âm, có hình que (dài khoảng 1 micromet), không
gây bệnh, thường gặp trong ruột người. E.coli có 1 nhiễm sắc thể (phân tử DNA)
dạng vòng nằm trong vùng nhân. Kích thước của các phân tử DNA này khoảng
4x10
6
cặp bazo. Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã được xảy
ra đồng thời. Sau khi mARN được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã mà

- 11 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
không qua các bước sữa đổi sau phiên mã vì gen của chúng không có các intron
(đoạn không mã hóa). Do vậy, E.coli được coi là tế bào chủ đơn giản nhất. Rất
nhiều thí nghiệm tách dòng gen ở các phòng thí nghiệm đang sử dụng E.coli là tế
bào chủ.
Ngoài E.coli, một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ cho
các thí nghiệm tách dòng gen như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces…tuy
nhiên những tế ào chủ này có những hạn chế nhất định. Những tế bào chủ này cần
đồi hỏi những vector thích hợp, nên việc đưa các DNA tái tổ hợp vào chúng gặp
nhiều khó khăn.
III.2 Tế bào chủ nhân chuẩn
Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E.coli làm tế bào chủ để
tách dòng gen vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng bao bọc NST. Do vậy các
gen ở sinh vật nhân chuẩn không thể biểu hiện được trong E.coli vì môi trường
khác với môi trường bình thường của gen sinh vật nhân chuẩn. Như vậy, nếu
chúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm tách
dòng thì khó có thể tin rằng E.coli mang DNA tái tổ hợp có thể sản sinh ra protein
có chức năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn.
Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân
chuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào
phức tạp như động vật, thực vật
III.2.1 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
Nấm men S.cerevisiae được sử dụng làm tế bào chủ một cách rộng rãi
trong công nghệ di truyền vì nhiều lí do:
- S.cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước khoảng 5
micromet) đã được nghiên cứu tỷ mỷ về đặc điểm di truyền, sinh lý. Nấm
men S.cerevisiae dễ nuôi cấy với quy mô lớn để thu sinh khối tế bào.
- 12 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó

- Một số S.cerevisiae có khởi điểm ( promoter) mạnh và có plasmid dùng
làm vector YAC biểu hiện gen.
- S.cerevisiae có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như đường
hóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ các hoạt tính sinh học.
- S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó, nếu
đưa gene lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ tinh sạch.
- S.cerevisiae là loài nấm men được sử dụng rộng rãi trong lên men bánh
mì, lên men rượu, bia. Do đó nó được công nhận là vi sinh vật an toàn,
hầu như không tạo ra độc tố.
- Hệ gen của S.cerevisiae có khoảng 1,35x10
7
cặp bazo đã được giải trình
tự vào năm 1996 và có kích thước nhiều hơn E.coli khoảng 3,5 lần.
Các vi nấm khác cũng được sử dụng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm tạo dòng
gen như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, hoặc pechia pastoris.
Vector biểu hiện gen ở tế bào S.cerevisiae cũng như ở sinh vật nhân chuẩn khác
chúng bao gồm khởi điểm (P- promoter), điểm kết thúc ( T- terminator), khởi điểm
sao chép của E.coli (ori E); khởi đầu sao chép ở tế bào Eukaryota ( ori
euk
); các gen
đánh dấu chọn lọc (ESM); các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn (MCS
multicloning site: điểm tách dòng)
III.2.2 Các tế bào chủ thực vật
Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong các
thí nghiệm thao tác gen. Tảo đơn bào, ví dụ như laoif Chramydomonas rainhardii
có tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của
tế bào thực vật. Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thí
nghiệm taho tác di truyền, trong công nghệ di truyền. Tuy nhiên, người ta cũng còn
dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp có thể dùng
làm tế bào chủ.

III.2.3 Các tế bào chủ động vật
- 13 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cần
thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng tế
bào chủ động vật. Các tế bào chủ động vật bao gồm:
- Tế bào thận của khỉ xanh Châu Phi (Afirican green monkey kidney)
- Tế bào thận chuột đồng nhỏ (Baby hamster kidney)
- Tế bào thận phôi người (Human embryonic kidney)
- Tế bào tử cung chuột bạch (Chinese hamster ovary)
- Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người.
- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans
- 14 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
CHƯƠNG 4: TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DÒNG DNA TÁI TỔ HỢP

Trong phần trước chúng ta đã biết có 2 yếu tố quan trọng trong công nghệ DNA tái
tổ hợp: khả năng sử dụng các enzyme để cắt nối các phân tử DNA invitro và hệ
thống các tế bào vật chủ để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với
số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ. Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên một
dòng tế bào chứa bản sao của một gen cần thiết, đó là tách dòng gen ( gene
cloning).
Một thí nghiệm tách dòng phụ thuộc vào mục tiêu chủ đạo của thí nghiệm và
nguồn nguyên liệu dùng để tách chiết axit nucleic cho việc tách dòng.
IV.1 Tạo plasmid tái tổ hợp
IV.1.1 Tạo nguồn gen
Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gen.
Có 3 phương pháp khác nhau để thu nhập gen:
a. Thu nhập DNA từ hệ gen ( thư viện gen)
Đây là phương pháp thường dùng ngay từ giai đoạn đầu tiên phát triển

công nghệ DNA tái tổ hợp. Toàn bộ các phân tử DNA của một loài sinh vật được
tách thành các đoạn nhỏ bằng cách lắc cơ học, hoặc dùng enzyme giới hạn. Công
đoạn sau đó là gắn các đoạn này vào plasmid. Phương pháp này được sử dụng ngân
hàng DNA của cả hệ gen. Ví dụ, việc lập ngân hàng hệ gen của người được tiến
hành như sau: Đầu tiên tách hệ gen người thành các đoạn DNA dài 300-400kb rồi
gắn vào các vector YAC, hoặc BAC để tạo dòng. Từ các dòng 300-400kb lại lại cắt
thành các đoạn DNA dài từ 30-40kb rồi gắn vào các cosmid. Từ đoạn 30-40kb lại
được cắt thành các đoạn DNA dài trung bình khoảng 4kb, sau đó gắng vào các
plasmid.
b. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học
- 15 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Muốn tổng hợp hóa học đoạn DNA hay một gen cần phải biết trình tự các
đoạn DNA hay gen đó. Sử dụng các máy tổng hợp DNA tự động (DNA
synthesizer). Phương pháp tổng hợp gen bằng con đường hóa học, ví dụ đầu tiên là
tổng hợp gen mã hóa cho hoocmon somarostatin co 14 axit amin được biểu hiện
trong vi khuẩn E.coli. Các nòi E.coli có thể sản sinh ra khoảng 3 triệu phân tử
hoocmon sinh trưởng người có hoạt tính tương tự hoocmon sinh trưởng tự nhiên.
c. Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA):
Đây là phương pháp tạo gen từ mARN nhờ enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase). Đầu tiên, từ mARN tổng hợp được cDNA mạch đơn. Nhờ
enzyme phiên mã ngược nên bất cứ gen nào có mARN, hoặc một đoạn
polyribonucleotit tổng hợp bằng con đường hóa học đều có thể tổng hợp cDNA.
Từ các cDNA mạch đơn có thể tạo thành cDNA mạch kép nhờ có enzyme DNA
polymerase. Các cDNA mạch kép được gắn vào plasmid để tạo ra plasmid tái tổ
hợp.
Ngân hàng DNA bổ trợ có nhiều ưu thế vì các dòng cDNA chứa đoạn trình
tự nucleotit chỉ gồm các đoạn mã hóa của một gen. Mặt khác, có thể tạo ra những
tế bào vi khuẩn chuyên hóa chỉ tạo ra một loại protein tương ứng với một mARN
cụ thể, từ đó sản phẩm tạo ra dễ được tinh sạch và được sản phẩm như mong

muốn.
IV.1.2 Tạo plasmid tái tổ hợp
Khi có các đoạn DNA hay cDNA mong muốn. Bước tiếp theo là gắn chúng
vào vector chuyển gen để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Có nhiều phương pháp gắn các
đoạn DNA, hoặc cDNA vào plasmid, hoặc các vector chuyển gen khác.
- Phương pháp dùng đầu dính:
Theo phương pháp này, đầu tiên cần xử lý DNA chứa đoạn gen mong muốn
và vector chuyển gen (như plasmid) bằng các loại enzyme giới hạn cắt tạo đầu
dính. Trộn lẫn DNA và vector chuyển gen đã bị cắt bằng cùng một loại enzyme
- 16 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
giới hạn như đã nêu trên. Bước tiếp theo là dung enzyme nối ligase để gắn các
đoạn cần nối với nhau. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc tạo
plasmid tái tổ hợp.
- Phương pháp dùng đoạn nối:
Các đoạn DNA hay ARN ngắn khoảng 10-20 nucleotit được tổng hợp bằng
con đường hóa học, gọi là đoạn oligonucleotit tổng hợp này cần có đoạn trình tự
nhận biết tương ứng với một loại enzyme giới hạn dùng làm đoạn nối. Các đoạn
nối được gắn vào 2 đầu của đoạn DNA lạ tạo thành đoạn DNA có 2 đoạn trình tự
tương ứng với điểm cắt của enzyme giới hạn. Bước tiếp theo là xử lý các đoạn
DBA lạ có gắn đoạn nối và xử lý vector chuyển gen bằng cùng một loại enzyme
giới hạn. Trộn chung vector và DNA đã được xử lý bằng enzyme giới hạn và gắn
chúng với nhau nhờ enzyme nối ligase.
- Phương pháp dùng enzyme terminal transferase:
Đây là phương pháp gắn đuôi oligo, một loại nucleotit, ví dụ CCCC (đuôi
dC) vào đầu 3’-OH của một mạch DNA, do đó tạo ra được mạch đơn thứ hai của
cDNA có đuôi bổ sung là GGGG. Khả năng tạo đuôi homopolymer là do enzyme
terminal transferase xúc tác. Ta có thể hình dung phương pháp này như sau:
+ Từ một phân tử mARN tạo ra mạch cDNA mạch đơn rồi tạo ra cDNA
mạch kép nhờ enzym phiên mã ngược và ADN polymerase.

+ Xử lý cDNA mạch kép để tạo dòng cDNA đầu bằng nhờ việc sử dụng
enzym S
1
nuclease.
+ Xử lý các dòng cDNA đầu bằng, bằng enzym terminal tranferase cùng với
oligo (dC) để tạo đầu mút 3’CCCCC.
+ Xử lý plasmid có đoạn trình tự nhận biết của enzym giới hạn REPstI bằng
enzym giới hạn PstI, sau đó ủ với enzym terminal transferase cùng với oligo (dG)
để tạo đuôi 3’GGGGG.
- 17 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
+Trộn lẫn các dòng cDNA và plasmid sau khi xử lý với nhau. Các đầu mút
của hai loại đuôi bổ trợ sẽ bắt cặp bổ sung với nhau. Do vậy, đoạn DNA lạ (từ
cDNA) bắt cặp với plasmid. Nhờ có enzym DNA polymerase I và ligase chúng sẽ
nối với nhau tạo ra plasmid tái tổ hợp.
IV.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp
Sau khi plasmid tái tổ hợp, hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước tiếp
theo là biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gen lạ, ví dụ biến nạp
vào E.coli. Biến nạp được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau.
- Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất: Xử lý tế bào vi khuẩn E.coli bằng
CaCl
2
lạnh, kẽm sốc nhiệt (42
o
C trong 2 phút) rồi ủ plasmid tái tổ hợp làm cho khả
năng dung nạp tăng lên hàng trăm lần. Sau khi plasmid mang đoạn DNA lạ biến
nạp chui được vào tế bào E.coli, chúng vẫn còn nguyên ven, đồng thời tế bào chủ
vẫn sống bình thường. Trong quá trình sinh trưởng của E.coli, plasmid tái tổ hợp
được sao chép tạo thành dòng DNA (gen) lạ. Để xác định tế bào chủ E.coli đã tiếp
nhận plasmid tái tổ hợp hay chưa, người ta gắn gen kháng với chất kháng sinh vào

plasmid tái tổ hợp. Nhờ đó có thể phát hiện sự dung nạp thông qua tính bền vững
với kháng sinh đã được đánh dấu.
- Phương pháp xung điện: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung
bằng máy điện biến nạp để biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ nhận. Lúc
đầu máy biến nạp được sử dụng để biến nạp vào tế bào động vật và sau đó là tế bào
thực vật. Hiệu quả biến nạp bằng xung điện rất cao và đoạn DNA biến nạp có kích
thước lớn (khoảng 25- 135kb). Tuy vậy tỉ lệ tế bào chủ được biến nạp chỉ sống sót
khoảng 50-70%.
- Phương pháp vi tiêm: Dùng một lượng nhỏ DNA tái tổ hợp tiêm thẳng
vào nhân tế bào chủ. Đây là phương pháp thông dụng để chuyển gen ở tế bào động
vật có vú. Nếu tế bào nhận là tế bào phôi thì chúng ta nhận được động vật chuyển
gen.
- 18 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
- Phương pháp dùng súng bắn DNA: Các hạt kim loại tungsten, hoặc vàng
cực nhỏ mang đoạn DNA, hoặc ARN, được bắn nhanh với tốc độ cao, xuyên qua
màng tế bào để đưa DNA hoặc ARN vào nhân tế bào nhận. Thực hiện thao tác này
bằng súng bắn DNA (còn gợi là súng bắn gen- gene gun). Phương pháp biến nạp
bằng súng bắn DNA được dùng nhiều khi chuyển gen ở thực vật.
Ngoài ra còn một số phương pháp khác nữa.
IV.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gen
Sau khi biến nạp DNA (gen) vào tế bào chủ nhận thì ở trong tế bào nhận,
DNA biến nạp được nhân bản m từ đó chúng tạo ra được dòng DNA (gen). Bước
tiếp theo chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gen mong muốn và sau đó tạo
điều kiện cho gen biểu hiện.
a. Chọn lọc dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu
Trong nhiều trường hợp, do sử dụng các loại enzym giới hạn khác nhau nên
tạo ra số lượng dòng DNA rất lớn, hoặc một loại enzym giới hạn có thể cắt ra
những đoạn gen không mong muốn. Trong khi đó các nhà nghiên cứu lại chỉ muốn
tách một dòng DNA cụ thể đặc hiệu.

Có 3 hướng chính để chọn lọc dòng DNA là lai axit nucleic dùng mẫu ARN
dò đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình, hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm
tùy theo tính chất của dòng gen.
Ví dụ, chọn lọc dòng mang đoạn DNA của ribosome bằng phương pháp lai
axit nucleic được tiến hành như sau:
- Các dòng ADN tái tổ hợp được phân bố đều trên mặt thạch của đĩa petri
chứa môi trường nuôi cấy.
- Đóng dấu các dòng này trên màng lọc nitro-cellulose, hoặc màng nilon
filter. Các tế bào sẽ vỡ ra và DNA thoát ra ngoài.
- Biến tính các dòng DNA bằng nhiệt độ cao.
- Nhúng màng lọc vào mẫu dò ARN đã đánh dấu phóng xạ.
- 19 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
- Các dòng chứa rARN tương ứng với mẫu dò ARN sẽ lai với nhau và tạo
thành đoạn mạch kép.
- Loại bỏ các phần không lai.
- Đặt miếng phim phát quang phóng xạ lên màng lai. Những phần xuất hiện
trên ảnh phóng xạ tự ghi biểu hiện tương ứng với các DNA bổ trợ với mẫu dò
ARN. Từ đó tách được dòng DNA mong muốn.
b. Biểu hiện của gen mong muốn
Muốn gen đã được tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vector biểu
hiện mang đầy đủ yếu tố phiên mã và dịch mã. Đối với các dòng gen ở động vật có
vú tạo ra sản phẩm là các protein có hoạt tính sinh học, chúng ta cần với số lượng
lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gen này trong tế bào E.coli cần
lưu ý một số nhân tố sau:
- Số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E.coli cần hợp lý.
- Phải có khởi điểm phiên mã mạnh.
- Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã.
- DNA tái tỏ hợp có sự ổn định lâu dài trong E.coli
- Không có sự phân giải protein của các enzym trong tế bào chủ.

- 20 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
CHƯƠNG V: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
V.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp với nghiên cứu bộ gen
Việc tách dòng tái tổ hợp cho phép nhận được một số lượng lớn bất kỳ
gene hoặc vùng điều hòa nào để tiến hành phân tích trình tự nucleotide, xác định
các vùng chức năng và chỉ ra các cơ chế hoạt động của chúng. Nhờ đó đã đưa lại
những hiểu biết mới về tổ chức và hoạt động của các bộ gen prokaryote (như các
khởi điểm tái bản , các vùng điều hòa phiên mã, các gen nhảy vv ) và ở các bộ
gen eukaryote (như các centromere, lelomere, các gene phân đoạn, các gen giả,
DNA lặp lại )
Bằng các thí nghiệm tạo dòng plasmid tái tổ hợp kinh điển ở vi khuẩn
E.coli, và bằng cách cải tiến sử dụng nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men này, người
ta đã thành lập các thư viện gen (gene library) hay thư viện bộ gen (genomic
library) trên cơ sở đó tiến hành lập bản đồ vật lý (physical map) và xác định trình
tự DNA bộ gen của nhiều sinh vật khác nhau, kể cả bộ gen người.
Đáng kể là, Dự án Bộ gene Người (Human Genome project = HGP) đã
chính thức đi vào hoạt động từ những năm 1990 do James Watson chủ trì cùng với
sự cộng tác của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Việc phân tích trình tự bộ gen
người đã được hoàn thành 4/2003, cho thấy bộ gen của chúng ta có trình tự đầy đủ
gồm 3.164.700.000 cặp bazo, chứa đựng khoảng 25.000 gene mã hóa protein chịu
trách nhiệm xây dựng nên một bộ protein (proteome) gồm khoảng 50.000 protein
khác nhau trong các tế bào. HGP thực sự là một trong những kỳ công thám hiểm vĩ
đại nhất trong lịch sử, lần đầu tiên HGP cho phép chúng ta đọc được toàn bộ thông
tin di truyền của tự nhiên đã làm nên con người.
Ngày nay những trình tự các nucleotic của các exon ( và intron) của những
gen đã được biết qua các ví dụ sau:
- 21 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
+ Gen của lopprotein lipase (LP): Một nhóm nhà khoa học Mỹ và Pháp đã

xác định được cấu trúc của gen mã hóa LP, một enzym có vai trò quan trọng trong
sự chuyển hóa Lipoprotein. LP có khoảng 30 Kb
+ Gen của bệnh nhầy nhớt (Mucoviscidosse): Mucoviscidosse là một bệnh
di truyền, trong đó những tuyến ngoại tiết, tiết ra một chất nhầy rất quánh. Bệnh
tác động chủ yếu lên tụy và những tuyến của biểu mô. Mồ hôi có nồng độ cao bất
thường của Cl
-
và Na
+
. Gen của Mucoviscidosse đã được biết và xác định trình tự
năm 1989, gồm 280 Kb. Gen này mã hóa một protein gồm 1480 acid amin có tên
là “CFTR”. CFTR tham gia vào sự vận chuyển Clo qua màng (từ trong ra ngoài tế
bào)
Gen của bệnh loạn dưỡng cơ của Duchenne (DMD): Gen này là gen dài
nhất được biết: nó gồm trên 2000 Kb và trên 75 exon.
V.2 Công nghệ DNA tái tổ hợp với y- dược học
V.2.1 Sản xuất các chế phẩm y-sinh học bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
Nếu như vào năm 1972, giáo sư Roger Guillemin (pháp) phải dùng tới
500.000 não cừu mới tinh chiết được vài miligram somatostatin, một hoocmon
sinh trưởng của vùng dưới đồi thị (với công trình này đã được giải nobel năm
1980), thì vào 10/1977 Hebert Boyer (Mỹ) đã chế tạo thành công hormon này từ
E.Coli bằng phương pháp DNA tái tổ hợp. Đến 8/1978 chính Boyer lại là người
cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli. Các thành tựu đầu tiên này đã mở
ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó là công nghệ DNA tái tổ hợp.
- 22 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Sau đó hàng loạt các chế phẩm khác như các hormon tăng trưởng của người
(HGH), bò (BGH), lợn (PGH), các vaccine và các interferon phóng chống căn
bệnh nan y ở người như ung thư, viêm gan và một số bệnh quan trọng ở gia súc
như hiện tượng “lở mồm - long móng” do virus gây ra tất cả đều được sản xuất

- 23 -
Hình. Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng
biệt
Hình. Cấu trúc của phân tử insulin
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
từ E.coli. Đặc biệt là sự ra đời của các hãng các công ty lớn đã đầu tư mạnh mẽ cho
sự phát triển của kỹ nghệ này. Nhờ vậy đã góp phần giải quyết một cách hiệu quả
nhiều vấn đề thực tiễn đặt ra trong y học, trong chăn nuôi- thú y, và nông nghiệp
nói chung vv
Hoocmon tăng trưởng của người (hGH: Human growth hormone): Là một
loại protein được tổng hợp và bài tiết bởi tuyến yên, có vai trò quan trọng đến sự
phát triển của trẻ em. Một số trường hợp “bệnh lùn” là do thiếu hụt hGH (lùn do
tuyến yên). Cũng như với trường hợp insulin, người ta không thể dùng GH nguồn
gốc bò vì công thức những GH của người và bò rất khác nhau. GH của bò không
có tác dụng đối với người. Việc sản xuất tuyến yên người chết cũng không thể thực
hiện được với nhiều lý do: thiếu nguyên liệu, nguy cơ lây nhiễm virus hoặc prion,
do đó phương pháp sản xuất này đối với hGH cuối cùng cũng đã bị loại bỏ (1988).
Hoocmon tăng trưởng dùng hiện nay là hoocmon được tổng hợp bởi những kỹ
thuật sinh học phân tử. GH gồm một chuỗi polypeptid có 191 acid amin và hai cầu
disunfur rất quan trọng trong cấu trúc không gian của GH. Một trong những
phương pháp tổng hợp hGH hiện nay nhằm tổng hợp DNA bổ sung (cDNA) và
thêm vào phía trước cDNA một trình tự mã hóa trình tự tín hiệu, để cho protein
không ở lại trong tế bào chất, mà được bài xuất vào khu vực quanh màng. Ở trong
khu vực này, những cầu disunfua được tạo thành. Bằng phương pháp gây áp lực
thẩm thấu, GH được thoát ra ngoài (không làm tan vi khuẩn)
Bên cạnh việc sản suất các hoocmon, vaccine nói trên, người ta còn sản
xuất được các kháng thể đơn dòng dùng để:
(i) Xác định vi khuẩn gây bệnh ( như thương hàn);
(ii) Xác định mức hoocmon từ đó đánh giá chức năng tuyến nội tiết hoặc sự thay;
đổi trong quá trình tổng hợp hoocmon do khối u gây ra;

(iii) Phát hiện một số protein có ý nghĩa trong chẩn đoán khối u hoặc một số tính
trạng trước khi sinh.
- 24 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
(iv) Phát hiện các thuốc bị cấm có trong máu,hoặc kiểm tra nồng độ thuốc có trong
máu và tổ chức nhằm đảm bảo liều thuốc sử dụng sao cho không vượt quá ngưỡng
gây độc v.v
Nhờ có tính đặc hiệu và chính xác cao và sử dụng dễ dàng, việc sản xuất
các kháng thể đơn dòng đã tạo nên một nhánh phát triển mau lẹ nhất của công nghệ
sinh học, và cùng với việc sản xuất văcxin chúng đã trở thành những phương tiện
quan trọng nhất trong chính sách y tế cộng động của các nước đang phát triển và
xét về lâu dài, việc ứng dụng các kháng thể đơn dòng có triển vọng chữa được
nhiều bệnh trong đó có các khối u ác tính.
- 25 -
Hình.Vaccin phòng tránh một số
ung thư
Hình: Sản xuất vaccin tả ở quy
mô lớn