Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử KIỂM SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (876.04 KB, 26 trang )
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài
KIỂM SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU
PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT
Gỉang viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:
PGS.TS. Nguyễn Bá Lộc Phạm Thị Hồng Hạnh
Lớp: LL&PPGD Sinh học K22
Huế, 2014
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Nguyễn Bá Lộc
đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu. Tôi cũng xin chận thành cảm ơn các anh, chị và các
bạn ở lớp sinh khóa 22 đã luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học
tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
MỤC LỤC
!"#$%&'(
)*)+,!'%-./!012%
3$456'7890:: 5&'()*)+,!':
;:
<=>=>?
@ABBCDBEFG
:HIJ770'- G
:HHI+ #2 5-*0KL)&%MNOFPQ0'RSPG
:H:T#Q0'5SU463V%WQ0'RSPN
:H?T3V%WQ0SPX
:HGSP0YZ7[7[\
:HN.,7R0SPZ]PS[#Y]^
::K_70'- `
::HK_'RSP)K3[80)`
::X>L)&Q0'RSP::
@AaCbBBcF@S<I@de:N
PHẦN I: MỞ ĐẦU
Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở
mức độ phân tử. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối liên hệ
giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ
qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách
thức điều hòa các mối quan hệ này. Như ta đã biết một gen được xem là
hoạt động khi thông tin đó được sử dụng để tạo ra sản phẩm cuối cùng là
protein hay phân tử ARN. Điều đáng ghi nhớ là thông tin chỉ được phiên
mã và dịch mã theo một chiều từ ADN sang ARN đến protein. Không xảy
ra hiện tượng thông tin truyền từ ADN sang thẳng protein hoặc từ protein
ngược trở lại acid nucleic. Việc trao đổi thông tin giữa các dạng acid
nucleic (giữa ADN và ARN) có thể xảy ra thuận nghịch. Ví dụ, ADN →
ARN (phiên mã xuôi từ ADN sang ARN), ARN → ADN (phiên mã ngược
từ ARN sang ADN – reverse transcription), ADN → ADN (tái bản ADN),
ARN → ARN (nhân bản ARN bởi ARN polymerase dựa trên khuôn ARN).
Một trong những quá trình quan trọng đó là sự phiên mã. Phiên mã ở sinh
vật nhân sơ khác với sinh vật nhận chuẩn đó là ở sinh vật nhân chuẩn, ARN
polymerase kết hợp với một số enzyme tham gia vào quá trình chế biến
ARN thông tin, điều này cho phép quá trình chế biến ARN thông tin có thể
diễn ra ngay khi khởi đầu sự phiên mã. Phân tử ARN thông tin mới đầu
được tạo thành có tuổi thọ ngắn, chưa được hoặc chỉ mới xử lý một phần
được gọi là tiền ARN thông tin (pre-mRNA) đến khi hoàn thành quá trình
chế biến thì gọi là ARN thông tin trưởng thành. Để tìm hiểu rõ hơn về quá
trình sửa đổi ARN sau quá trình phiên mã tôi đã chọn đề tài: “ KIỂM
SOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT ”
PHẦN II: NỘI DUNG
2.1. Kiểm soát sau phiên mã
2.1.1 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR của phân
tử ARNm
Phân tử ARNm có các vùng 5' không dịch mã (5’ UTR – 5’ Untranslated
Region) nằm phía trước mã khởi động (AUG) và vùng 3’ không dịch mã
(3’ UTR) nằm sau mã dừng. Đầu 5' không dịch mã có thể tạo cấu trúc cặp
tóc ngăn cản ribosome khởi động dịch mã. Ngoài ra, phần 5’ UTR có thể là
vị trí tương tác của một số protein repressor. Khi đó ribosome không thể
dịch chuyển trên sợi ARNm khiến cho quá trình dịch mã bị kìm hãm hoàn
toàn. Rõ ràng trong trường hợp này, ARNm vẫn được tổng hợp một cách
bình thường nhưng protein không được tạo ra. Cơ chế điều khiển quá trình
dịch mã do protein tương tác với đầu 5' của ARNm được gọi là "kiểm soát
dịch mã tiêu cực" (negative translational control).
Ở tế bào eukaryot, kiểm soát dịch mã tiêu cực được phát hiện đối với phản
ứng tổng hợp ferritin - protein làm nhiệm vụ tạo phức với các nguyên tử
sắt. Khi môi trường không có sắt, các phân tử ARNm ferritin bị aconitase
(protein repressor) bám vào đầu 5', do đó không có protein ferritin được
tổng hợp trong tế bào. Khi có sắt trong môi truờng, aconitase liên kết với
sắt và rời khỏi ARNm ferritin. Lúc này ferritin được tổng hợp với số lượng
lớn gấp 100 lần so với lúc ban đầu.
2.1.2 Độ dài của đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững của phân tử
ARNm
Hình 1: Độ dài đuôi polyA ảnh hưởng đến độ bền vững và quá trình dịch
mã trên phân tử ARNm. Đuôi polyA có thể được thêm vào hoặc cắt ngắn
đi, nhưng độ dài của nó không được ít hơn 30 nucleotide A.
2.1.3 Độ bền vững của ARNm
Trong tế bào vi khuẩn, các phân tử ARNm thường bị phân hủy rất
nhanh. Thời gian bán hủy của chúng thay đổi từ 3-5 phút ngay khi có hoặc
không có các chất cảm ứng trong môi trường. Do đó khi tế bào vi khuẩn
mọc và phân chia trong khoảng thời gian 20-30 phút, các ARNm cần được
tái tạo mới 5-10 lần trong mỗi lần phân chia. Khi tế bào yêu cầu một số
enzym, ARNm cần thiết để tổng hợp các enzym đó được phiên mã nhanh
chóng. Khi tế bào không còn nhu cầu, quá trình phiên mã dừng rất nhanh
và các phân tử ARNm lập tức bị phân hủy. Enzym nuclease chịu trách
nhiệm phân hủy ARNm đến nay vẫn chưa được xác định rõ ràng. Đối với
một số ARNm polycistronic của các operon như lac hoặc trp, chúng bị
phân cắt bởi endonuclease tạo ra các monocistronic tương ứng với từng gen
trong operon. Khoảng cách giữa các monocistronic không chứa mã di
truyền, do đó không được che chắn bởi ribosome nên chúng dễ bị cắt bởi
endonuclease. Các ARNm prokaryot được tổng hợp cũng như bị phân hủy
rất nhanh, do đó vi khuẩn có thể thích ứng nhanh nhạy với những thay đổi
của môi trường. Ngược lại, các ARNm eukaryote khá bền vững. Ví dụ
ARNm mã cho β-globin có thời gian bán hủy khoảng hơn 10h. Tuy nhiên
cũng có những loại ARNm có thời gian bán hủy chỉ 30 phút hoặc ít hơn.
Thường đó là những ARNm mã cho các protein làm nhiệm vụ điều khiển
hoạt động của gen. Các phân tử ARNm eukaryot kém bền do chúng mang
các đoạn nucleotide đặc biệt tại đầu 3' kích thích sự phân hủy ARNm. Thực
nghiệm cho thấy khi đoạn nucleotide giàu A và U ở vùng 3' không dịch mã
của phân tử ARNm kém bền được ghép vào một số ARNm bền vững khác,
thì những phân tử này trở nên kém bền do đuôi polyA bị cắt ngắn nhanh.
Như vậy đoạn nucleotide giàu AU kích thích sự phân hủy ARNm thông
qua việc giảm độ dài đuôi polyA. Ngoài ra, một số ARNm có chứa vị trí
đặc hiệu ở đầu 3' được nhận biết bởi endonuclease.
2.1.4 ARN anti-sense
Thông thường, các protein giữ vai trò chủ đạo kiểm soát quá trình phiên mã
cũng như dịch mã. Tuy nhiên hoạt động của một số gen lại được điều khiển
bởi các ARNs. Cũng giống như các protein điều khiển, các ARNs làm
nhiệm vụ kiểm soát hoạt động của gen được tổng hợp một cách độc lập và
tương tác với các vị trí đặc hiệu (các đoạn nucleotide). Xét trường hợp cụ
thể về vai trò điều khiển sau phiên mã của ARNs đối với việc tổng hợp
protein OmpF ở tế bào vi khuẩn E.coli. Protein OmpF nằm phía ngoài
màng tế bào làm nhiệm vụ nhận biết những thay đổi về áp suất thẩm thấu
trong môi trường. Khi áp suất tăng thì gen điều khiển micF hoạt động mạnh
hơn. Sản phẩm của gen micF là phân tử ARN 174 bases, có thể tạo cặp
theo nguyên tắc bổ sung với vị trí nhận biết của ribosome trên phân tử
ARNm của gen ompF. Như vậy phân tử ARNm của micF làm nhiệm vụ
ngăn cản việc tổng hợp protein OmpF. Các phân tử ARN có chức năng
tương tự micF được gọi là ARN-antisense (Hình 2).
Hình 2: Phân tử ARN-antisense-micF kiểm soát dịch mã của phân tử
ARNm -ompF. Phân tử đúp ARN/ARN tạo thành khiến ribosome không
tổng hợp được protein OmpF.
2.1.5 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing"
Phản ứng đọc sửa ARNm làm thay đổi trình tự nucleotide của phân
tử ARNm. Phản ứng này xảy ra trong tế bào chất. Các nucleotide của một
số phân tử ARNm bị loại bỏ hoặc bị thay thế, một số nucleotide khác được
thêm vào. Như vậy trình tự nucleotide trên phân tử ARNm khác với gen
(ADN) mà từ đó phân tử ARNm được phiên mã. Phản ứng này được phát
hiện đầu tiên đối với ARNm mã hóa cho protein ở ty thể của trypanosome.
Các phân tử ARNm này mang thêm một vài nucleotide U khác với trình tự
trên gen ADN. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy phân tử ARNm trong ty
thể của tế bào thực vật hầu như đều trải qua phản ứng "RNA editing". Tuy
nhiên đối với các ARNm này, chỉ có sự thay thế nucleotide C bằng U mà
không có hiện tượng thêm vào hoặc loại bỏ các nucleotide khác. Trình tự
các acid amin ở protein có thể thay đổi đến 10% hoặc hơn nữa so với
protein được mã bởi phân tử ARNm chưa trải qua phản ứng này.
Hình 3: Thay đổi thông tin di truyền trên phân tử ARNm của gen apo-B
bởi cơ chế "ARN editing". Chiều dài phân tử ARNm không đổi nhưng
nucleotide U thay thế C tạo ra một mã dừng tổng hợp protein. Ở động vật,
các phân tử ARNm ít trải qua phản ứng "RNA editing". Trường hợp đầu
tiên được phát hiện đối với gen apolipoprotein B (apo-B) dài 4503 bp, là
gen đơn bản trong genome người (Hình 2.16). Từ gen này hai loại phân tử
ARNm được tổng hợp. Chúng chỉ khác nhau bởi một nucleotide C bị thay
thế bởi U. Do đó làm xuất hiện một mã dừng phản ứng tổng hợp protein.
Protein ngắn tương ứng với loại ARNm này có trọng lượng phân tử 250
KDal và chỉ tồn tại ở trong ruột. Phân tử protein 512 KDal tương ứng với
ARNm không bị đọc sửa tồn tại ở cả gan và ruột. Phản ứng "RNA editing"
được thực hiện nhờ các phân tử ARN dài khoảng 40 - 80 base. Các ARN
này gọi là ARN phụ trợ, ký hiệu là ARNg (guide RNA). Chúng được tổng
hợp độc lập với nhau. Đầu 5' của chúng có thể tạo liên kết với ARNm cần
sửa đổi, còn đầu 3' mang
đuôi polyU. Các nucleotide U được chuyển trực tiếp từ đuôi này sang
ARNm. Quá trình đọc sửa diễn ra từ đầu 3' và tiếp tục về đầu 5' của
ARNm. Có thể có nhiều ARNg tham gia sửa đổi một phân tử ARNm.
2.2. Biến đổi sau phiên mã
2.2.1 Biến đổi phân tử ARNm trong tế bào eukaryot
Trong tế bào eukaryot, quá trình phiên mã phụ thuộc vào từng loại
promoter cũng như từng loại enzym ARN polymerase. Các ARNr được
tổng hợp nhờ ARN polymerase I, ARNm được tổng hợp bởi ARN
polymerase II và các ARNt và 5S ARNr được phiên mã nhờ ARN
polymerase III. Promoter cho các ARN polymerase I và II thường nằm
trước vùng chứa mã di truyền trong khi một số promoter cho ARN
polymerase III nằm phía sau điểm bắt đầu phiên mã (tức là promoter của
ARN polymerase III nằm ngay trong vùng chứa mã di truyền). Cùng
với các ARN polymerase, phản ứng tổng hợp ARN trong tế bào eukaryot
chỉ thực hiện được khi có sự tham gia của nhiều protein khác. Chúng tạo
thuận lợi để enzym khởi động phiên mã tại promoter của các gen eukaryot.
Đây là điều khác biệt giữa quá trình phiên mã ở tế bào prokaryot và
eukaryot. Promoter ở prokaryot thường kìm hãm bởi protein ức chế, vì thế
chúng được xem là promoter mạnh. Ngược lại, promoter ở eukaryot thường
đòi hỏi phải có các protein hoạt hoá; chúng được xem là promoter yếu.
Hình 4: Kỹ thuật xác định vị trí +1 sử dụng S1 nuclease. Đoạn ADN chứa
vị trí +1 được lai với phân tử ARNm. Phân tử lai dạng kép này được xử lý
với S1 nuclease để phân hủy phần nucleotide không lai. Sau đó, phân tử lai
được điện di cùng với mẫu xác định trình tự của đoạn ADN ban đầu.
Trên Hình 4 cho thấy nucleotide A chính là vị trí đầu tiên được phiên
mã sang phân tử ARNm. Để xác định vị trí +1, tức là nucleotide đầu tiên
được phiên mã sang phân tử ARNm, chúng ta có thể áp dụng kỹ thuật "S1
nuclease mapping" (xác định vị trí +1 bởi S1 nuclease). Đầu tiên, đoạn
ADN (sàng lọc từ genome) có chứa phần 5' của gen được lai với ARNm
của chính gen đó. Tiếp theo, phần nucleotide ADN hoặc ARNm không lai
với nhau mà ở dạng sợi đơn sẽ bị phân hủy bởi S1 nuclease. Chỉ có phân tử
lai dạng kép được điện di trên gel acrylamide cùng với phản ứng xác định
trình tự của chính đoạn ADN ban đầu. Nhờ đó, vị trí nucleotide đầu tiên +1
được xác định chính xác (Hình 4). Quá trình tổng hợp ARNm eukaryot xảy
ra nhờ ARN polymerase II. Tuy nhiên enzyme này không tự bắt đầu phản
ứng mà đòi hỏi sự phối hợp của nhiều yếu tố phiên mã. Nhờ tương tác với
ARN polymerase II hoặc với ADN ở promoter hay ở các vị trí khác ngoài
promoter, các yếu tố này giúp enzym nhận biết dễ dàng các vị trí bảo toàn
trên promoter để bắt đầu quá trình phiên mã. Cho đến nay vị trí dừng chính
xác qúa trình tổng hợp ARNm trong tế bào eukaryot vẫn chưa được xác
định. Tuy nhiên với hầu hết các gen mã cho protein, phản ứng được dừng
lại sau khi ARN polymerase II vượt qua vị trí đặc biệt AATAAA (gọi là vị
trí polyA) khoảng 0,5 đến 2 kb. Trong thí nghiệm invitro, việc loại bỏ vị trí
polyA hoặc gây các đột biến tại đó đều khiến cho phân tử ARNm được
tổng hợp rất dài do enzym không xác định được vị trí dừng. Cơ chế kiểm
soát dừng tổng hợp ARNm khi ARN polymerase II đi qua vị trí polyA vẫn
chưa sáng tỏ. Những kết quả thực nghiệm bước đầu cho thấy đây là vị trí
liên kết của phức gồm protein CPSF (Cleavage and Polyadenylation
Specificity Factor) và protein CstF (Cleavage Stimulation Factor). Phần
COOH của tiểu đơn vị lớn nhất của ARN polymerase II cần thiết cho việc
thêm đuôi polyA. Do đó, việc kết thúc phiên mã và thêm đuôi có thể xảy ra
đồng thời trong nhân tế bào eukaryot (Hình 5). Sau khi được phiên mã,
phân tử tiền thân ARNm eukaryot phải trải qua ba thay đổi cơ bản trước
khi được dùng làm khuôn để tổng hợp protein. Trước hết ARNm được gắn
đuôi polyA vào đầu 3', gắn "mũ" Gm7 vào đầu 5' (ở vị trí 2' của đường
ribose) và cắt nối intronexon thành phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phản ứng
methyl hoá tạo cấu trúc mũ giúp cho ribosome nhận biết được phân tử
ARNm và bám vào nó. Cấu trúc mũ còn giúp bảo vệ đầu 5’ của ARNm
không bị phân cắt bởi exonuclease.
Hình 5: Phối hợp giữa vị trí polyA (AATAAA) và phức protein trong quá
trình tổng hợp ARNm. Phức CPSF và CstF liên kết với ARN polymerase
II. Đến vị trí polyA, factor bị phân ly khỏi enzym khiến enzym không thể
tiếp tục tổng hợp ARNm. Đồng thời Poly(A) transferase thêm đuôi polyA
vào đầu 3’ của ARNm.
Sau khi có đuôi polyA và mũ Gm7, ARNm phải trải qua quá trình
cắt bỏ các intron trước khi được vận chuyển ra ngoài tế bào chất. Khoảng
30-40 nucleotide nằm ở biên giới giữa intron và exon rất quan trọng để
phản ứng cắt intron xảy ra chính xác. Đột biến các nucleotide nằm ở trung
tâm intron không ảnh hưởng đến phản ứng này. Đặc biệt trong cấu trúc của
mỗi intron, hai nucleotide đầu tiên GU ở đầu 5' và hai nucleotide AG tận
cùng ở đầu 3' giữ vai trò quyết định. Chúng được bảo toàn ở mọi intron và
là vị trí nhận biết để cắt intron ra khỏi phân tử tiền thân ARNm.
2.2.2. Gắn mũ
Hình 6. Cấu trúc tổng quan của mRNA ở eukaryote
Các ARN thông tin của sinh vật nhân thật và virus có một cấu trúc
đặc biệt ở hai đầu cuối. Ngay sau khi tiền ARN thông tin (pre-mRNA) được
tạo thành và thoát ra khỏi bề mặt của ARN polymerase, một loạt các
enzyme sẽ tiến hành phản ứng lên đầu 5' để tạo thành 5' methylated cap,
gọi là “mũ” – đó thực chất là phân tử 7-methyl-guanosine gắn với
nucleotide cuối của ARN thông tin qua liên kết "không bình thường" là 5'-
5' triphosphate.
Quá trình gắn mũ này xảy ra trong quá trình phiên mã, sau khi phiên
mã được khoảng 20-50 nucleotide. Ở virus, các enzyme gắn mũ cho ARN
thông tin gắn với ARN polymerase của virus. Còn ở sinh vật nhân thật,
khác với ARN polymerase I và ARN polymerase III, ARN polymerase II
có phần CTD (carboxy-terminal domain), tương tác với enzyme gắn mũ.
Nhờ vậy, mũ được bảo đảm đặc hiệu cho cấu trúc đầu 5' ARN thông tin.
Mục tiêu của việc gắn mũ này là tránh việc phân tử ARN bị các enzyme
khác làm phân hóa và trợ giúp cho ARN có khả năng ra khỏi nhân tế
bào đến được tế bào chất. Cụ thể hơn, cấu trúc mũ này có tác dụng bảo vệ
ARN mới hình thành khỏi các enzyme exonuclease 5'-3', là vị trí gắn trực
tiếp cho phức hợp gắn với mũ (CBC -cap-binding complex) – chuẩn bị cho
các bước biến đổi tiền ARN thông tin kế tiếp và cũng là vị trí gắn cho các
nhân tố trong tế bào chất cần thiết trong quá trình dịch mã.
Cấu tạo "mũ" chụp ở đầu 5' của mRNA
2.2.3. Thêm đuôi poly A
Đầu còn lại sẽ bị tách bởi một enzyme phân hóa (endonuclease) để
giải phóng nhóm hydroxyl ở 3' của nucleotide đầu cuối 3' và thêm
vào adenylic acid nhờ vào enzyme poly (A) polymerase. Quá trình này liên
quan mật thiết với việc kết thúc phiên mã, và một lần nữa, có sự tham gia
của ARN polymerase II CTD để tương tác với các nhân tố gắn polyA. Tuy
nhiên, người ta vẫn chưa thực sự hiểu rõ tác dụng của việc gắn đuôi polyA
cho ARN thông tin để tạo thành ARN thông tin trưởng thành: bổ sung các
nhân tố làm ngưng quá trình này không ảnh hưởng đến việc tổng hợp ARN
thông tin và ARN thông tin không có đuôi poly (A) vẫn có thể được vận
chuyển ra khỏi nhân và tham gia dịch mã nhưng với hiệu suất thấp hơn.
Sơ đồ về sự hình thành đuôi poly-A
2.2.4. Phản ứng cắt intron và nối exon
Phản ứng cắt intron và nối hai exon với nhau được thực hiện theo các
bước cơ bản như sau (Hình 7):
+ Cắt tại biên giới exon-intron ở đầu 5' của phân tử tiền thân ARNm, đầu 5'
của exon được giải phóng.
+ Nucleotide 5'pG ở đầu intron vừa bị cắt liên kết với 2'OH của adenine
nằm cách đầu kia (phía 3') khoảng 25 base. Liên kết này khiến cho intron
có cấu trúc vòng.
+ Cắt tại biên giới intron-exon ở đầu 3' của phân tử ARNm. Intron được
loại ra và hai exon được nối với nhau.
Phản ứng cắt bỏ intron đòi hỏi sự tham gia của một số phân tử
snARNs kích thước nhỏ (small nuclear RNA). Chúng liên kết với protein
tạo thành phức ribonucleoprotein (snRNPs).
Một snRNP thường chứa một phân tử ARN và khoảng 10 protein khác
nhau. Một số protein đặc hiệu cho từng loại snRNP, một số khác chung cho
các snRNPs. Phân tử snARN của snRNP có khả năng tạo liên kết theo
nguyên tắc bổ sung với các đoạn nucleotide ở vùng biên giới 5' hoặc 3' giữa
exon và intron. Một số snARNs có thể liên kết với intron hoặc với các
snARN khác. Những liên kết này giữ vai trò quan trọng trong phản ứng
loại bỏ intron.
Hình 7: Phản ứng loại bỏ intron ra khỏi phân tử ARNm. Sau khi biên giới
giữa exon-intron ở đầu 5' bị cắt, cấu trúc vòng của intron được tạo ra do
liên kết 5'-2' giữa G của đầu 5' với A nằm gần đầu 3' của intron. Việc cắt tại
nơi tiếp giáp giữa intron-exon ở đầu 3' cũng như việc nối hai exon với nhau
xảy ra đồng thời. Thực nghiệm đã tìm ra ít nhất có 6 phân tử snARN kí
hiệu từ U1 đến U6 tương ứng với 6 snRNPs. Phân tử snARN U1 liên kết
với 15-20 nucleotide tại nơi tiếp giáp 5' exon-intron, snARN U2 liên kết
với khoảng 20 nucleotide tại đoạn chứa A (vị trí tạo cấu trúc vòng của
intron), còn snARN U5 liên kết với các nucleotide tại vùng biên 3' intron-
exon. Ngoài ra các snARN U4, U6 có khả năng tương tác với nhau và
tương tác với U2, U5. Mọi tương tác giữa
2.2.5. Các intron có khả năng tự cắt ra khỏi phân tử ARNm-Phản ứng
selfsplicing
Trên đây chúng ta đã xét phản ứng cắt bỏ intron, nối hai exon với
nhau tạo phân tử ARNm hoàn chỉnh nhờ xúc tác của các snRNPs và protein
(trong cấu trúc spliceosome).
Ngoài ra, một số phân tử tiền thân ARNm ở ty thể hoặc lục lạp có khả năng
loại bỏ các intron mà không cần sự tham gia của các snRNP hoặc protein.
Nói cách khác, các intron này có thể tự cắt ra khỏi các phân tử tiền thân
ARNm và các exon được nối với nhau. Chúng được chia làm hai nhóm
khác nhau, tuỳ thuộc vào cách thức xảy ra phản ứng.
Hình 8: Phản ứng self-splicing của các intron nhóm I. Phản ứng này chỉ
đòi hỏi sự tham gia của GOH. Trong quá trình tự cắt intron, phosphodiester
được chuyển từ phân tử đường này sang phân tử đường khác (phản ứng
transesterification).
Intron nhóm I: Phản ứng cắt intron nhóm I chỉ yêu cầu phân tử tiền thân
ARNm (có chứa intron) và nucleotide G có nhóm OH ở vị trí 3'. Sự có mặt
của guanosine này dẫn đến việc cắt tại biên giới 5' exon-intron, đồng thời G
được gắn vào đầu intron vừa được giải phóng (bằng việc chuyển liên kết
phosphate từ đường này sang đường khác mà không ảnh hưởng đến liên kết
phosphodiester). Đầu tự do 3'OH của exon sẽ tương tác với nơi tiếp giáp 3'
intron-exon. Tiếp theo hai exon được nối với nhau và intron tồn tại ở dạng
cấu trúc vòng. Cấu trúc này sau đó sẽ chuyển sang dạng thẳng (Hình 8).
Intron nhóm II: Các intron thuộc nhóm này cũng có khả năng tự cắt ra khỏi
phân tử tiền thân ARNm. Chúng có chứa GU ở đầu 5' và cơ chế tự cắt xảy
ra tương tự phản ứng đòi hỏi xúc tác của snRNPs (Hình 9)
Hình 9: Phản ứng self-splicing của các intron nhóm II. Nhóm 2'OH của A
nằm gần 3' intron-exon tương tác với đầu 3' của exon 1. Nơi tiếp giáp 5'
exon-intron bị bẻ gãy tạo cấu trúc vòng cho intron. Tiếp theo phản ứng nối
hai exon với nhau, intron được giải phóng ra dưới dạng vòng.
Quá trình kết nối xảy ra tại những trình tự ngắn, bảo tồn trong các
pre-mRNA thông qua hai phản ứng chuyển ester.
Trong quá trình tạo mRNA hoàn chỉnh, các intron được cắt bỏ và các
exon nối lại với nhau. Đối với các đơn vị phiên mã ngắn, quá trình nối
RNA thường xảy ra sau sự phân cắt và polyadenyl hoá đầu 3’ của các bản
sao phiên mã sơ cấp, như mô tả ở hình 10. Tuy nhiên, đối với các đơn vị
phiên mã dài chứa nhiều exon, quá trình nối exon trong các mRNA mới
sinh thường bắt đầu trước khi sự phiên mã các gen hoàn thành
Hình 10. Các nghiên cứu thể lai DNA-RNA cho thấy rằng các intron bị
cắt ra trong quá trình xử lý pre-mRNA.
Hình ảnh kính hiển vi điện tử của thể lai RNA-DNA giữa DNA của
adenovirus và mRNA mã hoá hexon, một protein chính của virus, cho thấy
các đoạn DNA (intron) vắng mặt trong các mRNA của hexon.
(a). Sơ đồ của đoạn EcoRI A của DNA adenovirus kéo dài từ đầu trái
của genome đến trước đầu kết thúc của exon cuối cùng của gen hexon. Gen
gồm 3 exon ngắn và một exon dài (= 3.5kb), được tách biệt bởi 3 intron 1,
2.5 và 9kb.
(b). Ảnh kính hiển vi điện tử (trái) và sơ đồ minh hoạ của thể lai giữa
đoạn EcoRI A với mRNA hexon. Các vòng được đánh dấu A, B, C tương
ứng với các intron được biểu diễn ở hình (a). Khi các trình tự intron đó
trong DNA genome virus không hiện diện trong mRNA hexon hoàn chỉnh.
Chúng cuộn bên ngoài các trình tự exon mà lai giữa các trình tự tương
đồng của chúng trong mRNA.
Hình 11. Trình tự tương đồng gần vị trí nối 5’ và 3’ trong các pre-
mRNA động vật có xương sống. Các base hầu như không thay đổi là
5’GU và 3’AG của intron (màu xanh), mặc dù các base chặn 2 đầu chỉ
được tìm thấy với tần số cao hơn mong đợi dựa trên sự phân bố ngẫu nhiên.
Vùng giàu pyrimidine gần đầu 3’ của intron được tìm thấy trong hầu hết
các trường hợp. Điểm phân nhánh adenosine cũng không thay đổi, thường
20-25 base từ ví trí nối 3’. Vùng trung tâm của intron, thường có chiều dài
khoảng 40base đến 50kb, thường không cần thiết cho quá trình nối xảy ra.
Các bằng chứng trước đây cho rằng các intron bị loại bỏ trong suốt
quá trình nối thấy từ ảnh KHV điện tử của thể lai DNA của adenovirus với
mRNA mã hoá hexon, một protein chính của capsid virus (hình 11). Các
nghiên cứu khác phát hiện các RNA nhân virus tương tự với DNA virus
(các bản sao phiên mã sơ cấp) và các RNA với một hoặc 2 intron đã loại bỏ
(xử lý trung gian). Kết quả này cùng với những khám phá khác mà mũ
5’cap và đuôi 3’ poly(A) tại mỗi đầu của mRNA tiền thân dài được giữ lại
trong các mRNA hoàn chỉnh ngắn hơn thuộc tế bào chất, dẫn đến việc các
intron bị loại bỏ khỏi các bản sao sơ cấp khi các exon nối với nhau.
Sự định vị các vị trí nôí, đó là, vị trí liên kết intron – exon trong pre-
mRNA có thể được xác định bằng cách so sánh trình tự của DNA genome
với cDNA được tạo thành từ mRNA tương ứng. Trình tự mà hiện diện
trong genome DNA nhưng vắng mặt trong cDNA là intron và chỉ ra các
vùng của các vị trí nối. Như sự phân tích một số lượng lớn các mRNA khác
nhau cho thấy các trình tự tương đồng ngắn, bảo tồn không nhiều lắm tại
các vị trí nối chặn 2 đầu intron trong các mRNA eukaryote; trong các sinh
vật cao hơn, vùng giàu pyrimidine theo hướng 3’ vị trí nối cũng là phổ biến
(hình 11). Các nghiên cứu với đột biến mất đoạn cũng cho thấy rằng nhiều
vùng trung tâm của các intron có thể bị loại bỏ mà không có tác động của
quá trình nối; thường chỉ 30-40 nu tại mỗi đầu của intron là cần thiết cho sự
cắt nối xảy ra ở tốc độ bình thường. Phân tích các dạng trung gian được tạo
thành trong suốt quá trình nối pre-mRNA in-vitro đưa ra kết quả rằng việc
nối các exon thông qua 2 phản ứng chuyển ester liên tục (Hình 12). Các
intron bị loại bỏ như cấu trúc thòng lọng trong đó 5’G của intron được
tham gia vào một liên kết không bình thường 2’, 5’ phosphodiester với một
adenosine gần đầu 3’ của intron. Phần A này được gọi là điểm phân nhánh
vì nó tạo thành một nhánh RNA trong cấu trúc thong lọng. Trong mỗi phản
ứng chuyển ester, một liên kết phosphoester được trao đổi với liên kết
khác. Khi số lượng các liên kết phosphoester trong phân tử không được
thay đổi trong 2 phản ứng, năng lượng không được tiêu thụ. Kết quả của 2
phản ứng này đó là 2 exon liên kết với nhau và intron xen giữa được giải
phóng nhờ cấu trúc thòng lọng nhánh.
Hình
12.
Hai
phản
ứng chuyển ester taọ ra sự kết nối các exon trong các pre-mRNA.
Trong phản ứng đầu tiên, liên kết ester giữa 5’phospho của intron và
3’O (đỏ đậm) của exon 1 trao đổi 1 liên kết ester với 2’O (màu xanh) của vị
trí phân nhánh A. Trong phản ứng thứ hai, liên kết ester giữa 5’P của exon
2 và 3’O (đỏ nhạt) của intron được trao đổi một liên kết ester với 3’O của
exon 1, giải phóng intron nhờ cấu trúc thòng lọng và kết nối 2 exon.
2.2.6. Cấu trúc chung của phân tử ARNm
Ngoài phản ứng cắt intron nối exon, phân tử ARNm eukaryot còn
chịu các biến đổi ở đầu 5' và 3'. Đầu 5' của ARNm có 7-methylguanylate
(m7G) liên kết với nucleotide đầu tiên của ARNm. Mũ m7G này đóng vai
trò giúp ribosome nhận biết ARNm trong quá trình tổng hợp polypeptide.
Đầu 3' của ARNm có đuôi polyA được xem là có vai trò trong việc vận
chuyển ARNm từ trong nhân ra ngoài tế bào chất. Một phân tử ARNm
eukaryot hoàn chỉnh chỉ chứa exon, mang mũ Gm7 ở đầu 5', đuôi polyA ở
đầu 3'. Phân tử ARNm có chứa vùng 5' không dịch mã (5’ UTR) và vùng 3'
không dịch mã (3’UTR). Phần 5’UTR nằm trước mã bắt đầu
tổng hợp peptide"start codon" còn phần 3’UTR nằm sau mã dừng tổng hợp
protein "stop codon" (Hình10). Các vùng này liên quan đến kiểm soát tính
bền vững của ARNm cũng như kiểm soát quá trình dịch mã trên sợi
ARNm. Vùng 5' không dịch mã thường chứa các đoạn oligonucleotide có
thể tương tác với các protein đặc biệt hoặc có thể tạo cấu trúc bậc hai (tạo
các liên kết bổ sung giữa chúng). Những tương tác đó ngăn cản ribosome di
chuyển trên ARNm. Mặt khác, vùng 3' UTR của một số ARNm có các vị
trí nhận biết bởi endonuclease hoặc chứa các đoạn nucleotide đặc biệt (giàu
AU) kích thích sự phân hủy ARNm.
Hình 13: Quá trình phiên mã và dịch mã. Gen chứa các exon (E) và các
intron (I) được phiên mã sang phân tử ARNm tiền thân. Quá trình biến đổi
ARNm thành phân tử hoàn hỉnh để sử dụng làm khuôn dịch mã trong quá
trình tổng hợp protein.
Phân tử ARNm eukaryot khá bền vững. Thời gian bán sống cũng
như khả năng dùng làm khuôn dịch mã phụ thuộc phần nào vào độ dài đuôi
polyA. Trong thực tế, không phát hiện được phân tử ARNm có đuôi polyA
ngắn hơn 30A. Độ dài của đuôi liên quan đến tính bền vững của ARNm
nên việc thêm hoặc bớt các nucleotide A vào đuôi được kiểm soát rất chặt
chẽ (cần lưu ý đuôi polyA được gắn vào ARNm ngay sau khi phiên mã ở
trong nhân. Tuy nhiên thay đổi độ dài của đuôi có thể xảy ra trong tế bào
chất). Đặc biệt trong quá trình phát triển mô phôi, rất nhiều loại ARNm
được phiên mã từ các gen của mẹ và được dự trữ trong tế bào trứng. Chúng
thường có đuôi polyA rất ngắn (10-30 A) nên không được dịch mã. Chỉ sau
khi trứng thụ tinh, các ARNm này được thêm đuôi polyA và trở thành
khuôn để tổng hợp protein.
PHẦN III. KẾT LUẬN
Sự phiên mã là sự tổng hợp ARNm từ khuôn AND. Sự phiên mã ở
eucaryot theo những giai đoạn tương tự như với procaryot, nhưng phức tạp
hơn do bộ gen của eucaryot có kích thước lớn hơn so với procaryot, khác
với procaryot chỉ có một loại ARN polymerase.
Thông thường những phân tử tiền ARNm được sửa đổi để thành
ARNm bằng sự cắt bỏ những intron và nối các exon. Qúa trình cắt nối
những tiền ARNm được thực hiện với sự tham gia của những phân tử cắt
nối. Trong quá trình cắt nối, phần lớn sản phẩm phiên mã ban đầu (tiền
ARNm) được loại ra và thoái hóa ở nhân. Kết quả là kích thước ARNm tạo
thành chỉ còn lại kích thước nhỏ so với ARNm ban đầu.
PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Võ Thị Lan Hương, Một số quá trình cơ bản của sinh học phân tử,
2007, NXB Đại học quốc gia Hà Nội.
2. PGS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên) , Giáo trình Sinh học phân
tử ,2007. Nxb. Đại học Huế
3. Đỗ Lê Thăng-Đinh Đoàn Long, Chú giải di truyền học, 2007, Nxb
giáo dục.
4. Lê Duy Thành, Di truyền học, 2007, Nxb khoa học & kỹ thuật.
5. Lê Duy Thành (chủ biên), Cơ sở sinh học phân tử, 2009, Nxb Giáo
Dục.
6. Lê Đức Trình, Sinh học phân tử của tế bào, 2001, NXB khoa học và
kỹ thuật.
7. />%C3%AD_ARN#G.E1.BA.AFn_m.C5.A9
8. />ma.html
