Thiết kế đoạn mồi để định danh cây gừng

SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu trường Đại Học Bách khoa Đà Nẵng. Ban chủ nhiệm khoa Hóa, bộ
môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện để em tiếp xúc với thực tế thông qua thực
tập Tốt nghiệp.
Bộ môn di truyền và chọn giống – Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tiếp
nhận và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt khoảng thời gian em thực tập tại đây.
Các thầy cô và các anh chị trong bộ môn đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và chỉ bảo
em trong suốt khoảng thời gian em thực tập.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Lang, anh Trần Minh Tài
không những đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt
thời gian thực tập mà còn truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báo trong cuộc
sống.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy Bùi Xuân Đông, cô Đoàn Thị Hoài Nam cùng
toàn thể các bạn 10SH và gia đình của em đã quan tâm và ủng hộ giúp em hoàn thành
tốt đợt thực tập này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả!
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 1
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với tiến bộ của khoa học và công nghệ, việc tìm hiểu mối quan hệ
gần gũi của các taxon đang ngày càng phổ biến. Các đặc điểm là các nucleotide đã
cung cấp một lượng thông tin khổng lồ, các chương trình máy tính sẽ là công cụ quan
trọng không thể thiếu để phân tích dữ liệu đó
Trong những năm gần đây sinh học hiện đại và các kỷ thuật nghiên cứu sinh học
không ngừng phát triển, là cơ sở cho các ứng dụng trong nông nghiệp, y học và bảo vệ
sức khỏe cho con người. Sinh hộc phân tử và kỷ thuật gen là những chuyên ngành sâu

cần thiết cho các nhà sinh học. Công nghệ sinh học hiện đại mà nền tảng là sinh học
phân tử và kỷ thuật gen ngày càng có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất phục vụ
đời sống con người.
Các thành tựu về giải mã bộ gen người, bộ gen cây lúa, bộ gen chuột, nhân bản
động vật đã mở ra một thời kỳ mới giúp con người hiểu biết, có thể chữa khỏi một số
bệnh nan y, nâng cao sức khỏe và đời sống con người. Tuy nhiên, việc triển khai các
ứng dụng sinh học phân tử thường gặp các trở ngại khi số lượng vật chất di truyền
(DNA, RNA) cần thiết trong mẫu thấp. Để có đủ số lượng mẫu, người ta có thể dùng
phương pháp tạo dòng (cloning) hoặc phổ biến hơn là phản ứng PCR. Để thực hiện
được phương pháp này, các nhà sinh học cần phải biết thông tin về trình tự cần nhân
bản và từ đó phải xác định được trình tự các đoạn mồi cần thiết để có thể khuếch đại
đặc hiệu trình tự mong muốn.
Trong bộ Gừng (Zingiberales) ở Việt Nam, họ Gừng (Zingiberaceae) là họ có số
lượng loài nhiều nhất. Đây là một họ có nhiều đại diện có giá trị làm thuốc chữa bệnh,
nhiều loài được sử dụng làm gia vị, làm cảnh
Vì vậy, việc nghiên cứu phân loại họ Gừng ở nước ta một cách có hệ thống là điều
vô cùng cần thiết.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 2
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1 Khái quát về Viện Lúa ĐBSCL
Viện nghiên cứu lúa Đồng bằng sông Cửu Long (Cuu Long Delta Rice Research
Institute hay CLRRI) là một viện nghiên cứu và đào tạo có địa chỉ xã Tân Thạnh,
huyện Thới Lai, thành phố Cần Thơ, Việt Nam với tổng diện tích 366 ha. Tiền thân
của viện này là Trung tâm Kỹ thuật Nông nghiệp đồng bằng song Cửu Long được
thành lập theo quyết định số 41 NN-TC/QĐ ngày 8 tháng 1 năm 1977. Trung tâm này
đã được Chủ tịch Hội đồng Bộ trưởng đổi tên như hiện nay vào năm 1985.
Với những đóng góp đáng kể trong nghiên cứu và sản xuất nông nghiệp, từ năm
2002 trở đi Viện được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cho phép mở rộng

chức năng hoạt động thành Viện nghiên cứu nông nghiệp vùng.
Hình 1.1: Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long
1.2 Bộ môn di truyền
a. Chức năng: Bộ môn Di truyền - chọn giống là đơn vị nghiên cứu trực thuộc
Viện Lúa ĐBSCL có chức năng bảo tồn tài nguyên di truyền cây lúa và một số cây
trồng khác trong vùng trồng lúa, nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống lúa, giống cây
trồng cạn, rau màu theo hướng phát triển bền vững, đáp ứng mục tiêu phát triển của
quốc gia trong từng thời kỳ.(1)
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 3
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
b. Nhiệm vụ:
- Thu thập, bảo quản, đánh giá, tư liệu hóa và sử dụng hợp lý qũy gen cây lúa và
một số cây trồng khác trong vùng trồng lúa, để thực hiện mục tiêu đa dạng sinh học, sử
dụng vật liệu bố mẹ có định hướng đáp ứng yêu cầu cải tiến giống cây trồng.
- Nghiên cứu genome học và genome học chức năng cây trồng mục tiêu; phát triển
những lĩnh vực mới như proteomics, transcriptomics; ứng dụng tin sinh học, đáp ứng
nhu cầu nghiên cứu cơ bản về di truyền phân tử, công nghệ di truyền, kết hợp với các
phương pháp truyền thống làm cơ sở chọn tạo giống lúa, các giống cây trồng cạn và
rau màu.
- Nghiên cứu khai thác vật liệu di truyền từ nguồn hoang dại và loài bản địa, làm đa
dạng nguồn gen, kết hợp với đột biến gen, biến dị somatic hoặc gametic, xây dựng
chiến lược chọn lọc trên cơ sở di truyền số lượng, nhằm tạo chọn giống năng suất cao,
ổn định, chống chịu stress sinh học và phi sinh học, gia tăng hàm lượng dinh dưỡng
nông sản.
- Thực hiện các phương pháp chuyển gen, du nhập gen mục tiêu từ ngân hàng gen
vào giống cây trồng, kết hợp với hồi giao cải tiến, ứng dụng dấu chuẩn phân tử trong
chọn giống (MAS), đánh giá hiệu qủa chọn lọc tính trạng mục tiêu, phân tích QTL,
phân tích chuỗi trình tự gen mục tiêu, thiết kế những cặp mồi liên kết chặt chẽ với gen
mục tiêu, hoàn thiện không ngừng qui trình chọn giống truyền thống và phân tử.

- Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống: Chức năng genome , Công nghệ
gen, Kỹ thuật di truyền , Kiểm tra về GMO các cây có liên quan.
- Tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sinh, thực tập sinh sau Tiến sĩ (post-doct),
sinh viên đến thực tập về di truyền-giống; đào tạo tiến sĩ chuyên ngành di truyền -
giống.
- Thực hiện các hoạt động so sánh năng suất, phân tích tương tác GxE, trồng thử,
chuyển giao giống mới ở các địa phương trong vùng mục tiêu.
- Thực hiện công tác khảo nghiệm giống lúa ở các vùng sinh thái khác nhau.
- Thực hiện các đề tài, dự án hợp tác quốc tế về các lĩnh vực có liên quan.(1)
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 4
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
1.3 Thiết kế đoạn mồi
1.3.1 Khái niệm
Mồi (primer) là một đoạn Nucleotide ngắn (oligonucleotide), có khả năng bắt cặp
với sợi DNA khuôn mạch đơn, tạo ra vùng khởi động cho quá trình tổng hợp sợi DNA
mới nhằm khuếch đại số lượng lớn DNA.
Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử
Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của PCR.
Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng mồi thích hợp mang tính quyết định đối với sản
phẩm PCR thu được.
1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi và những yêu cầu của mồi
1.3.2.1 Nguyên tắc thiết kế primer
Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta
muốn ứng dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao.
Nhằm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải thiết kế
chính xác “oligonucleotide primer”.
Mỗi được thiết kế đúng giúp chúng ta tránh tạo ra những sản phẩm PCR không
chuyên tính, giống như hiện tượng phân biệt giữa cDNA và DNA của bộ gen trong
RNA-PCR.

Các nguyên tắc trong thiết kế primer được Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang
(2004) nghiên cứu như sau:
- Primer nên có chiều dài chuỗi trình tự khoảng 17-28 base.
- Hàm lượng G+C khoảng 50-60%.
- Nhiệt độ Tm khoảng 55-80
0
C.
- Ở đầu 3’ primer có một G hoặc C, hoặc CG hoặc GC nếu nhiều hơn sẽ thúc đẩy
hiện tượng “priming” nhầm ở các trình tự giàu G hoặc C nên được tránh.
Giá trị Tm trong khoảng 56-62
0
C tạo ra quá trình “annealing” đạt kết quả tốt.
Nhưng trong phản ứng PCR nhiệt độ Tm của mồi có thể biến thiên trong vòng 2-3
0
C.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 5
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
1.3.2.2 Các thông số cơ bản để thiết kế mồi
Mục đích của thiết kế mồi là có được sự cân bằng giữa hai kết quả: sự chuyên tính
và sự hiệu quả của PCR. Sự chuyên tính được xem xét dựa trên cơ sở xuất hiện bao
nhiêu lần “priming” nhầm trên tổng số lần “priming” (sự lai giữa primer và dây nền tại
vị trí mục tiêu của nó). Tính hiệu quả của một mồi là làm thế nào tiếp cận với lý thuyết
về kết quả sản phẩm, trong mỗi chu kỳ PCR, một cặp mồi có thể khuếch đại ra một sản
phẩm.
Một chuỗi mã DNA nào đó đã được cung cấp, người ta có thể phân tích mồi trên
phần mềm máy tính, để có một cân bằng giữa hai mục tiêu.
Chiều dài mồi (primer length):
Cả tính đặc hiệu và thời gian bắt cặp ít nhất một phần phụ thuộc vào chiều dài mồi,
yếu tố này quyết định sự thành công của PCR.

Mồi có chiều dài càng lớn thì khả năng bắt cặp của mồi càng ít hiệu quả. Để tối ưu
hóa phản ứng PCR, người ta sử dụng mồi có chiều dài tối thiểu sao cho đảm bảo T
m

khoảng 54
0
C hoặc hơn chút ít, như vậy tính đặc hiệu của sản phẩm PCR và hiệu suất
phản ứng sẽ cao. Những nucleotide ngắn (15 base hoặc ngắn hơn) chỉ được sử dụng rất
hạn chế trong các phản ứng PCR.(2)
Tùy thuộc vào kích thước genemo sinh vật, chúng ta sẽ có một độ dài tối thiểu, sai
biệt hơn kém nhau vài nucleotide. Chiều dài tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PC là
18 nucleotide.(3)
Phần trăm GC (GC Content Percentage):
Hàm lượng GC chiếm khoảng 50 – 70% thì cho kết quả tốt. Nucleotide G và C phải
được phân bố đều khắp trình tự mồi. Cần tránh có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C ở
đầu 3’ của mồi để ngăn khả năng bắt cặp không đặc hiệu.
Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Primer Melting Temperature):
Nhiệt độ nóng chảy (T
m
) là nhiệt độ tại đó có 50% phân tử DNA sợi đôi bị tháo
xoắn thành sợi đơn.
Nhiệt độ nóng chảy tăng theo độ dài của mồi. Chiều dài tối ưu của mồi vào khoảng
18-24 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 55
0
C đến 80
0
C. Có một số công
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 6
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông

thức để tính nhiệt độ nóng chảy của mồi dựa vào số lượng các nucleotide thành phần
(A,G,C và T).
Nucleotide cuối của Mồi (trình tự đầu 3’):
Vị trí đầu 3’ trên primer là cần thiết để khống chế mồi sai vị trí, do đó cần phải xác
định cẩn thận. Khi ta xác định được một nucleotide acid, hai base đầu tiên rong codon
của nó hoặc ba base trong trường hợp nó được mã hóa bằng codon đơn (methionine và
tryptophan) thì hai hoặc ba base đầu này được dùng như đầu 3’. Những cặp base hoàn
chỉnh giữa những đầu 3’của primer và khuôn mẫu cho phép chúng ta có được kết quả
mong muốn, và giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai (mismatch) trong khoảng 5-6
nucleotide tại đầu 3’ của primer.
Nhiệm vụ của đầu 3’ trong primer là kiểm soát hiện tượng gắn primer nhầm và
ngăn cản hiện tượng tương đồng trong cùng một cặp primer. Nếu không xác định cẩn
thận nucleotide ở đầu 3’ thì hiện tượng primer-dimers sẽ xảy ra, và với tính chất bổ
sung cho nhau thì sản phẩm PCR lúc bấy giờ sẽ là một sự khuếch đại của chính primer
chứ không phải của DNA khuôn mẫu.
Các trình tự mồi bổ sung
Nên thiết kế mồi không có vùng tương đồng bên trong mồi vượt quá 3 cặp base.
Nếu mồi có một vùng tự tương đồng như thế, nó sẽ quay lại bắt cặp bổ trợ, tạo ra cấu
trúc sợi kép (còn gọi là cấu trúc bậc 3 hay cấu trúc kẹp tóc), ảnh hưởng đến ciệc bắt
cặp khuôn.
1.3.3 Các phần mềm và chương trình dùng trong thiết kế mồi
1.3.3.1 Chương trình ClustalW
Chương trình clustal là dãy các phiên bản phần mềm phân tích kết quả thí nghiệm
về cấu trúc chuỗi DNA hay protein, bằng phương pháp so sánh đồng thời giữa tất cả
các chuỗi mà người yêu cầu đã lựa chọn cung cấp cho chương trình (về khối lượng, vị
trí các đoạn đứt hay đoạn chèn đặc hiệu…) để tìm kiếm phát hiện ra những đặc điểm
đồng nhất, đặc điểm gần gũi hay phân ly giữa chúng. Qua đó, chương trình sẽ xây
dựng cây tiến hóa và cung cấp thông tin liên quan để dự đoán đặc tính của chuỗi phân
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 7
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam

Bùi Xuân Đông
tích. Clustal có nhiều phiên bản trong đó có phiên bản ClustalW, được viết bằng ngôn
ngữ TUBRO C, có thể chạy trên nhiều môi trường khác nhau: UNIX, MAC, PC.
1.3.3.2 Các phần mềm thiết kế và lựa chọn đoạn mồi
Chương trình thiết kế và lựa chọn đoạn mồi (primer design softwares) là chương
trình tìm kiếm và xác định đoạn nucleotide tương đồng với cấu trúc chuỗi DNA đem
phân tích, phục vụ cho nhân gen PCR hay sử dụng cho nhiều kỷ thuật lai ứng dụng
khác. Để giải quyết nhiệm vụ trên, nhiều phần mềm đã được xây dựng và cung cấp
cho người dùng như DNA Club, OLIGO primer analysis sofware, Molecular Biology
Insights, FastPCR hay Primer 3
1.3.3.2.1 Chương trình FastPCR
FastPCR là một trong những công cụ mạnh để thiết kế mồi.
Hình 1.2: Giao diện của chương trình FastPCR
Các bước thực hiện:
- Chép lại chuỗi trình tự (định dạng FASTA, EMLP) và dán vào cửa sổ input.
- Lựa chọn các thông số cho mồi (bao nhiêu %GC, ) với nhiều phương án.
- Chọn Run (F5) để chạy chương trình, xuất hiện file output với các định dạng như
ASCII text, XML và excel.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 8
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
Trên bảng kết quả (result) dạng notepad gồm tên các mồi, trình tự các mồi, Tm,
%GC, Q. Có rất nhiều mồi để lựa chọn cho phản ứng PCR.
1.3.3.2.2 Chương trình thiết kế Primer-3
Primer-3 là một trong số các chương trình ứng dụng để thiết kế đoạn mồi của
Rozen và Skeletsky. Chương trình Primer-3 được cung cấp cho người sử dụng xử lý
trực tuyến qua địa chỉ truy cập.
Chương trình Primer-3 thiết kế mồi dựa trên cơ sở dử liệu phân tích của các đoạn
mồi tương ứng đã biết trong các ngân hàng dữ liệu.
Các bước thực hiện:

- Nhập dữ liệu: thông thường chuỗi trình tự được viết theo định dạng FASTA.
- Đặt chế độ xử lý.
- Nhấn nút: “Pick primer”.
Hình 1.3: Giao diện trực tuyến chương trình primer-3(4)
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 9
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
1.3.3.2.3 Chương trình thiết kế Primer-BLAST
Hình 1.4: Giao diện trực tuyến chương trình primer-BLAST(5)
Primer-BLAST đã được phát triển tại NCBI để giúp người dùng thiết kế các mồi
cho phản ứng PCR. Nó dùng Primer-3 để thiết kế mồi và sau đó gửi chúng vào
BLAST tìm kiếm đối với người sử dụng lựa chọn cơ sở dữ liệu.
Các bước thực hiện:
Nhập dữ liệu: thông thường chuỗi trình tự được viết theo định dạng FASTA.
Đặt chế độ xử lý.
Nhấn nút: “Get primer”
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 10
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
1.3.3.3 Chương trình phân tích cấu trúc tương đồng BLAST
WU-BLAST2 là chương trình so sánh cấu truc của chuỗi DNA, chuỗi amino axit
phân tích với các chuỗi tương ứng lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu, nhằm tìm kiếm
chuỗi (hay một số chuỗi) tương đồng nhất với chuỗi kiểm tra. Sau đó, người phân tích
sẽ khai thác các thông tin về đặc tính đã biết của các chuỗi trong ngân hàng để dự đoán
xác định cấu trúc và đặc tính của chuỗi cần kiểm tra này. Về phương diện kỷ thuật,
chương trình BLAST cho phép phát hiện sự tương đồng cấu trúc ở hai mức độ là mang
tính cục bộ ở một vùng hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với nhau.
1.4 Tổng quan về Gừng
1.4.1 Nguồn gốc và phân bố của cây Gừng
Chi gừng Zingiber Bochmer gồm khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở các khu vực

nhiệt đới châu Á và châu Úc. Trung tâm phong phú và đa dạng nhất của chi gừng là
Đông Nam Á. Riêng tại Trung Quốc hiện đã biết khoảng trên 20 loài. Trong số các
loài gừng trồng thì loài Zingiber officinale Roscoe được trồng phổ biến nhất.
Loài gừng Zingiber officinale Roscoe đã được trồng rộng rãi từ rất lâu đời ở các
nước nhiệt đới châu Á. Đến nay vẫn chưa thấy loài gừng này mọc dại ở bất cứ khu vực
nào trên thế giới. Một số giả thiết cho rằng gừng có nguồn gốc ở Ấn độ, từ đây nó
đựơc đưa đến các nước châu Âu, các nước Đông Phi bởi những thương nhân Ả Rập.
Hiện nay gừng Zingiber officinale đã được đưa trồng ở hầu khắp các nước trong vùng
khí hậu nhiệt đới ẩm.
Ở Việt Nam gừng Z. officinale được trồng trên khắp các địa phương từ Bắc vào
Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi.(6)
1.4.2 Đặc điểm chung của Gừng
Thông tin cơ bản
Tên thường gọi: Gừng
Tên khác: Khương, Gừng thuốc
Tên tiếng Anh: Zingiber
Tên khoa học: Zingiber officinale (Willd) Roscoe.
Tên đồng nghĩa: Amomum zingiber L.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 11
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
Thuộc họ Gừng - Zingiberaceae(7)
Mô tả
Cây thảo, sống lâu năm, cao 1m. Thân rễ nạc, mọc bò ngang, phân nhiều nhánh. Lá
mọc so le thành hai dãy, hình mác thuôn, thắt lại ở gốc, đầu nhọn, dài 15 -20cm, rộng
2cm, không cuốn, có bẹ nhẵn,lưỡi bẹ nhỏ dạng màng, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục
sẫm bóng,mặt dưới nhạt, có gân giữa hơi trắng nhạt khi vò có mùi thơm.
Cán hoa dài cỡ 20cm, mang cụm hoa hình bông, dài khoảng 5cm, gồm nhiều hoa
mọc sít nhau. Hoa có tràng hoa màu vàng xanh, có thuỳ gần bằng nhau nhọn. Cánh
môi ngắn hơn các thuỳ của tràng, màu tía với những chấm vàng. Nhị hoa màu tím.

Quả mọng.
Bộ phận dùng
Thân rễ (thường gọi là củ )- Rhizoma Zingiberis, có tên là Can Khương.
Thân rễ, thu hái vào màu đông, dùng tươi là sinh khương, phơi hoặc sấy khô là can
khương. Còn dùng tiêu khương ( gừng khô thái lát dày, sao sém vàng, đang nóng, vẩy
vào ít nước, đậy kín. Để nguội); bào khương (gừng khô đã bào chế); thán khương
(gừng khô thái lát dày, sao cháy đen tồn tính).
Có thể cất tinh dầu từ gừng với hiệu suất 1 -2,7% hoặc điều chế nhựa dầu gừng từ
bột gừng khô với các dung môi hữu cơ, hiệu suất 4,2 – 6,5%.
Thành phần hóa học:
Gừng chứa 2-3% tinh dầu với thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon
sesquiterpenic: β-zingiberen (35%), ar-curcumenen (17%), β-farnesen (10%) và một
lượng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic như geraniol, linalol, borneol.
Nhựa dầu chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay. Thành phần chủ yếu của
nhóm chất cay là zingeron, shogaol và zingerol, trong đó gingerol chiếm tỷ lệ cao nhất.
Ngoài ra, trong tinh dầu Gừng còn chứa α-camphen, β-phelandren, eucalyptol và các
gingerol. Cineol trong Gừng có tác dụng kích thích khi sử dụng tại chỗ và có tác dụng
diệt khuẩn trên nhiều vi khuẩn.(8)
Hoạt tính sinh học của gừng
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 12
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
Ít nhất 115 thành phần trong các giống gừng tươi và khô đã được xác định bởi một
loạt các quá trình phân tích. Gingerols là thành phần chủ yếu của gừng tươi và được
tìm thấy giảm nhẹ trong gừng khô , trong khi nồng độ của shogaols, đó là những sản
phẩm gingerol mất nước lớn, phong phú trong gừng khô hơn trong gừng tươi.(9)
Ít nhất 31 hợp chất gingerol có liên quan đã được xác định từ các chất chiết xuất từ
dầu thô methanol của thân rễ gừng tươi.(10)
Gừng đã được phân đoạn thành ít nhất 14 hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm 4-
gingerol, 6-gingerol, 8-gingerol, 10gingerol, 6-paradol, 14-shogaol, 6shogaol, 1-

dehydro-10 -gingerdione, 10gingerdione, hexahydrocurcumin, tetrahydrocurcumin,
gingerenone A, 1,7-bis- (4 ' hydroxyl-3 'metoxyphenyl)-5- methoxyhepthan - 3-one ,
và methoxy- 10-gingerol (11). Tỷ trọng của từng thành phần riêng lẻ trong một mẫu
gừng phụ thuộc vào nước xuất xứ , phạm vi xử lý thương mại , và cho dù là gừng
tươi , sấy khô hoặc chế biến (12).
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 13
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
2.1 Vật liệu
Thiết kế đoạn mồi cần phải có những thành phần cơ bản sau:
- Trình tự Nucleotide
- Chiều dài đoạn mồi
- Nhiệt độ nóng và nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi
- Chiều dài sản phẩm
- Phần trăm GC, tránh tạo cấu trúc kẹp tóc hay tự bắt cặp giữa các mồi
2.2 Phương pháp tiến hành
Bước 1: khai thác dữ liệu trên NCBI để tìm ra chuỗi sequence đặc trưng của loài.
Vào trang chủ của cơ sở dữ liệu NCBI:
Click vào tab nucleotide rồi gõ vào khung tìm kiếm “Zingiber officinale”.
Click “search”. Kết quả:
Từ đó là sẽ tìm ra chuỗi trình tự DNA đặc trưng cuả loài: chọn ra 17 chuỗi DNA
Bước 2: So sánh các chuỗi trình tự DNA tìm được và phân nhóm bằng ClustalW2
để tìm ra chuỗi DNA đặc trưng nhất.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 14
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
Sau khi nhập dữ liệu vào chương trình ClustalW2, kết quả thể hiện bằng
Phylogenetic Tree qua hình bên dưới.
Dựa vào kết quả trên, chuỗi DNA đặc trưng nhất là chỗi mang mã số EF491823

Bước 3: Thiết kế Primer cho chuỗi DNA vừa tìm được bằng các chương trình thiết
kế mồi.
Chương trình Primer-3
Kết quả nhận được là 1 cặp mồi chính:
Mồi xuôi: AGCAGTGACATTGAAAGGGC, chiều dài: 20 base, T
m
= 58,75
0
C,
%GC = 50%. Mồi ngược: AGGATGGTTTGCTGGACTCA, chiều dài: 20 base, T
m
=
58,93, %GC = 50%.
PRODUCT SIZE: 164.
Và 4 cặp mồi bổ sung:
STT Tên mồi Trình tự chuỗi Chiều dài
(base)
T
m
(
0
C)
%GC
1 Mồi xuôi GTGACATTGAAAGGGCCACA 20 58,67 50
Mồi ngược ACCTATCTCTGGCACTGTCG 20 58,89 55
2 Mồi xuôi AGCCTCACTACCCCAAATCC 20 59,08 55
Mồi ngược CTTCCGACATTCCTTTGGGG 20 58,54 55
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 15
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông

3 Mồi xuôi CACGGCTTTGGATGGAACTC 20 59,20 55
Mồi ngược ATCCCAACTCACTCCTCCTG 20 58,42 55
4 Mồi xuôi CCCCAGTCTTTGCCACAAC 19 58,96 57,89
Mồi ngược GGATTTGGGGTAGTGAGGCT 20 59,08 55
Chương trình FastPCR
Kết quả sau khi chạy chương trình FastPCR ta được 10 cặp mồi:
ST
T
Tên
mồi
Trình tự chuỗi Prime
r
qualit
y (%)
T
m
(
0
C)
PCR
Fragmen
t
Size(bp)
T
opt
(
0
C)
1 Xuôi CGGATACACCATTCCACTGTG
G

88 58,
7
370 65
Ngượ
c
GGCAAGATGACCAAGACTCCC
T
80 59,
3
2 Xuôi CGGATACACCATTCCACTGTG
G
88 58,
7
432 61
Ngượ
c
AGGATGGTTTGCTGGACTC 80 55,
2
3 Xuôi CGGATACACCATTCCACTGTG
G
88 58,
7
492 65
Ngượ
c
CCTATCTGGCACTGTCGCTTA
GG
91 61,
3
4 Xuôi

TATCACGGCTTTGGATGGAACTC
G
87 59,
2
167 64
Ngượ
c
CTCCTGGAACACCACAGTGGAAT
GG
77 62,
4
5 Xuôi
TATCACGGCTTTGGATGGAACTC
G
87 59,
2
504 65
Ngượ
c
GGCAAGATGACCAAGACTCCC
T
80 59,
3
6 Xuôi
TATCACGGCTTTGGATGGAACTC
G
87 59,
2
626 66
Ngượ

c
CCTATCTCTGGCACTGTCGCTTA
GG
91 61,
3
7 Xuôi AGTGACATTGAAAGGGCCAC 87 56,
1
161 60
Ngượ
c
AGGATGGTTTGCTGGACTC 80 55,
2
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 16
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
8 Xuôi AGTGACATTGAAAGGGCCAC 87 56,
1
99 61
Ngượ
c
GGCAAGATGACCAAGACTCCC
T
80 59,
3
9 Xuôi CACTGTGGTGTTCCAGGA 81 55,
0
418 61
Ngượ
c
AGGATGGTTTGCTGGACTC 80 55,

2
10 Xuôi CACTGTGGTGTTCCAGGA 81 55,
0
262 61
Ngượ
c
TCACTGCTAGAGGCGGT 80 55,
1
Chương trình BLAST Primer
Kết quả thiết kế mồi bằng chương trình BLAST Primer được 10 cặp mồi:

Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 17
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
Bước 4: Kiểm tra độ tương đồng của mồi trên các chuỗi các loài khác bằng
Nucleotide BLAST:
Lựa chọn chương trình BLAST: blastn-để so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide cần
phân tích với cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 18
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
Nhập dữ liệu: nhập chuỗi dữ liệu được viết theo ngôn ngữ FASTA được viết thành
hai phần, dòng đầu bắt đầu bằng kí tự “>” hoặc “>gi[…]” và tiếp theo là thông tin
chung về chuỗi, các dòng sau là trình tự cấu trúc chuỗi.
Đặt vùng phân tích “set subsequence”
Lựa chọn ngân hàng dữ liệu “choose databases”
Gửi yêu cầu xử lý.
- Về cấu trúc, tập tin kết quả gồm bốn phần là:
+ Phần đầu hiển thị kết quả sơ bộ dạng đồ họa hình ảnh màu của các chuỗi có độ
tương đồng cao nhất.

+ Phần tiếp theo hiển thị kết quả dạng ký tự tóm tắt kết quả.
+ Phần thứ ba hiển thị kết quả cụ thể khi so sánh từng cặp chuỗi
+ Phần cuối cùng tóm tắt thông tin về chế độ chạy yêu cầu cho BLAST.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 19
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
Sau khi kiểm tra độ tương đồng của mồi trên các chuỗi của các loài khác nhau thì ta
chọn ra được 4 cặp mồi:
1. Mồi xuôi: TATCACGGCTTTGGATGGAACTCG
Mồi ngược: GGCAAGATGACCAAGACTCCCT
2. Mồi xuôi: TCTTGCCAAGCTGGTTCTGT
Mồi ngược: CCTATCTCTGGCACTGTCGC
3. Mồi xuôi: GTGACATTGAAAGGGCCACA
Mồi ngược: ACCTATCTCTGGCACTGTCG
4. Mồi xuôi: CACGGCTTTGGATGGAACTC
Mồi ngược: ATCCCAACTCACTCCTCCTG
Tuy nhiên, kết quả thiết kế của các phần mềm chỉ cho chúng ta những trình tự và
những thông tin lý thuyết. sau khi có kết quả chúng ta phải thực hiện thí nghiệm thực
tiển để có thể chọn các thông số chính xác cho phản ứng PCR.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 20
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
Khi thiết kế mồi cho đoạn gen đặc trưng của cây gừng thì kết quả thu được về mặt
lý thuyết là được 4 cặp mồi, nhưng để chọn ra được 1 cặp mồi tốt nhất cho phản ứng
PCR thì cần phải thực hiện thí nghiệm thực tiễn. Tuy nhiên, do thời gian thực tập quá
ngắn nên em không có điều kiện để thực hiện thí nghiệm thực tiễn.
Sau quá trình thực tập, em có thể biết thêm được nhiều kiến thức về “Tin sinh hoc”
nói chung cũng như về “Thiết kế mồi” nói riêng. Để tiếp xúc và làm quen với nhiều

chương trình, phần mềm ứng dụng tin sinh học hơn.
Để làm tốt đề tài này, thì cần các yêu cầu: cần phải nắm kỷ kiến thức về môn sinh
học phân tử; cần nắm rõ cũng như cách sử dụng các chương trình, phần mềm để thiết
kế mồi; phải có kinh nghệm thiết kế mồi nhiều cũng như nắm được các yêu cầu của
thiết kế mồi.
Mặc dù em đã cố gắng để thu thập các tài liệu cần thiết cũng như cọ xát với thực tế
nhiều để hoàn thành tốt bài báo cáo này, nhưng vì thời gian hạn hẹp và nguồn tài liệu
tham khảo bị giới hạn nên khó tránh khỏi những thiếu sót trong quá trình làm báo cáo
thực tập. Em mong sẽ nhận được sự góp ý từ quý thầy cô cũng như độc giả để bài báo
cáo của em có thể hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn.
Cần Thơ ngày 6 tháng 1 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thân
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 21
SVTH: Nguyễn Thị Thân GVHD: Đoàn Thị Hoài Nam
Bùi Xuân Đông
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.
2. Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh. Giáo trình TIN SINH HỌC. bộ giáo dục và
đào tạo, trường đại học Cần Thơ, Viện NC & PT Công nghệ Sinh Học; 2011.
3. GS.TS Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu. Công nghệ gen. nhà xuất bản Nông
Nghiệp TP Hồ Chí Minh; 2012.
4. Primer3 Input [Internet]. [cited 17 Tháng Chạp 2014]. Truy vấn từ:
/>5. Primer designing tool [Internet]. [cited 17 Tháng Chạp 2014]. Truy vấn từ:
/>6. TAI NGUYEN DI TRUYEN THUC VAT VIET NAM - PLANT GENETIC
RESOURCES OF VIETNAM [Internet]. [cited 16 Tháng Chạp 2014]. Truy vấn
từ: />7. Họ Gừng (Zingiberaceae) [Internet]. [cited 16 Tháng Chạp 2014]. Truy vấn từ:
/>8. Loài Zingiber officinale (Willd.) Roscoe (Cây Gừng) | Cây Thuốc [Internet]. [cited
25 Tháng Chạp 2014]. Truy vấn từ:
/>9. Jolad SD, Lantz RC, Chen GJ, Bates RB, Timmermann BN. Commercially

processed dry ginger (Zingiber officinale): composition and effects on LPS-
stimulated PGE2 production. Phytochemistry. Tháng Bảy 2005;66(13):1614–35.
10. Jiang H, Sólyom AM, Timmermann BN, Gang DR. Characterization of gingerol-
related compounds in ginger rhizome (Zingiber officinale Rosc.) by high-
performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry.
Rapid Commun Mass Spectrom RCM. 2005;19(20):2957–64.
11. Koh E. M, Kim H. J, Kim S, editors. et al. Modulation of macrophage functions by
compounds isolated from Zingiber officinale. Planta Med. 75(2):148–51 2009;
12. Schwertner HA, Rios DC, Pascoe JE. Variation in concentration and labeling of
ginger root dietary supplements. Obstet Gynecol. Tháng Sáu 2006;107(6):1337–
43.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp Trang 22